生物制品氟盐测定指南（试行）

生物制品氟盐测定指南（试行）1范围本指南适用于疫苗类（含佐剂疫苗、多糖疫苗、重组蛋白疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗等）、血液制品类、抗毒素及抗血清类、重组生物制品类、诊断用生物制品类等生物制品中游离氟、总氟含量的测定，也适用于生物制品生产用原料、辅料、工艺中间品的氟盐质控检测。本指南规定的离子选择电极法测定范围为0.05mg/L~10mg/L，离子色谱法测定范围为0.01mg/L~20mg/L，超出范围的样品可经适当稀释后测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部生物制品质量控制通则GB5750.5-2006生活饮用水标准检验方法无机非金属指标GB/T22104-2008土壤中氟的测定离子选择电极法WHO生物制品质量控制实验室管理规范（2022版）中国食品药品检定研究院生物制品理化检验操作规程（2023版）3术语和定义3.1游离氟：生物制品中以游离氟离子形态存在、未与制品中蛋白、多糖、佐剂、辅料等结合的氟，可直接经提取后测定。3.2总氟：生物制品中所有形态的氟总和，包括游离氟、有机结合态氟、无机络合态氟，需经前处理破坏结合键转化为游离氟离子后测定。3.3氟盐：本指南所指氟盐为生物制品生产、储存过程中引入的含氟化合物的统称，以氟元素含量计的质量浓度或质量分数作为测定结果表示形式。3.4本底值：检测过程中由试剂、容器、环境引入的氟含量，需通过空白试验扣除。4测定原理4.1离子选择电极法（常规法）氟离子选择电极的敏感膜为氟化镧单晶，与参比电极（饱和甘汞电极）共同插入待测溶液时，氟离子可在单晶膜表面产生膜电位，待测溶液中氟离子活度的对数与膜电位符合能斯特方程：E=E0-(2.303RT/F)lgα(F-)，其中E为电极电位，E0为标准电极电位，R为气体常数，T为热力学温度，F为法拉第常数，α(F-)为氟离子活度。在固定总离子强度的条件下，活度系数为定值，可通过标准曲线法计算样品中氟离子浓度。4.2离子色谱法（仲裁法）待测样品经前处理去除大分子杂质后，进入阴离子交换色谱系统，根据氟离子与色谱柱固定相的交换能力差异实现与其他阴离子的分离，经抑制型电导检测器测定，以保留时间定性，峰面积或峰高定量，计算样品中氟离子含量。5仪器与试剂5.1仪器设备5.1.1电位分析系统：离子计或精密酸度计，电位测量精度≤±0.1mV；氟离子选择电极，检测下限≤0.02mg/L；饱和甘汞参比电极或Ag/AgCl参比电极。5.1.2离子色谱系统：配有阴离子交换色谱柱、抑制型电导检测器、淋洗液在线脱气装置、自动进样器，系统稳定性RSD≤0.5%。5.1.3前处理设备：磁力搅拌器（配聚四氟乙烯搅拌子）、高速冷冻离心机（最大转速≥15000r/min）、氧瓶燃烧装置（500mL硬质玻璃氧瓶、铂丝夹具）、马弗炉（控温精度±5℃）、镍坩埚、超纯水机（出水电阻率≥18.2MΩ·cm）。5.1.4容器类：所有接触样品的容器均为聚四氟乙烯或高密度聚乙烯材质，使用前经10%（v/v）硝酸溶液浸泡24h，超纯水冲洗6次后沥干备用，禁止使用玻璃容器存储含氟样品。5.2试剂与耗材5.2.1基准试剂：氟化钠基准物质，纯度≥99.99%，使用前于105℃鼓风干燥箱中干燥2h，置于干燥器中冷却至室温备用。5.2.2总离子强度调节缓冲液（TISAB）：配制方法见附录A，不同类型样品选用对应TISAB体系，TISAB配制后4℃密封保存，有效期3个月。5.2.3氟标准储备液（1000mg/L）：配制方法见附录B，4℃密封保存，有效期6个月。5.2.4氟标准工作液：临用前将氟标准储备液用超纯水逐级稀释为所需浓度，现配现用。5.2.5前处理试剂：10%（w/v）三氯乙酸溶液、0.5mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液、优级纯硝酸镁、优级纯氢氧化钠（碱熔法用）、无灰滤纸（氧瓶燃烧法用）、高纯氧气（纯度≥99.999%）、0.22μm水性聚醚砜滤膜、OnGuardIIRP固相萃取小柱（离子色谱法除有机物用）。5.2.6空白质控样：符合生物制品基质特征的不含氟基质，用于空白试验与加标回收试验。6样品采集与保存6.1采样要求：采样容器符合5.1.4要求，每批次样品采集量不少于10mL（或1g），同时采集全程空白对照：将同批次空白容器装入超纯水，与样品同条件采集、运输、保存，用于评估采样过程的污染情况。6.2样品保存：液态样品（含复溶后的冻干样品）密封后4℃保存，72h内完成测定；需长期存储的样品置于-20℃冷冻保存，避免反复冻融，冻融次数不得超过2次。固体原料/辅料置于干燥器中常温密封保存，避免受潮。7测定方法7.1游离氟测定7.1.1离子选择电极法（1）标准曲线制备：分别准确移取0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L的氟标准工作液各10.0mL，分别加入等体积对应TISAB溶液，混匀后转入聚乙烯烧杯中，放入搅拌子，将电极插入液面下，搅拌状态下待电位稳定（30s内电位变化≤±0.2mV）后记录电位值，按浓度从低到高依次测定。以电位值为纵坐标，氟离子浓度的常用对数值为横坐标绘制标准曲线，线性相关系数r≥0.999为合格。（2）样品前处理：①低基质样品（多糖疫苗、重组疫苗成品、工艺缓冲液等，蛋白含量<1%、无铝佐剂）：准确移取1.0mL样品，加入等体积对应TISAB溶液，混匀后待测。②高蛋白样品（血液制品、抗毒素、单抗制品等，蛋白含量≥1%）：准确移取1.0mL样品，加入1.0mL10%三氯乙酸溶液，涡旋振荡1min，12000r/min4℃离心10min，准确移取1.0mL上清液，加入1.0mL对应TISAB溶液，混匀后待测。③含铝佐剂样品：准确移取1.0mL样品，15000r/min4℃离心20min，完全分离佐剂沉淀与上清液，准确移取0.5mL上清液，加入0.5mL对应TISAB溶液，混匀后待测，禁止吸取佐剂沉淀。（3）样品测定：与标准曲线相同测定条件下测定样品溶液电位值，代入标准曲线计算得到测定液中氟离子浓度，同时测定全程空白与试剂空白的氟含量。7.1.2离子色谱法（仲裁法）（1）标准曲线制备：分别配制0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的氟标准系列溶液，经0.22μm滤膜过滤后，按参考色谱条件（见附录C）进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，氟离子浓度为横坐标绘制标准曲线，线性相关系数r≥0.9995为合格。（2）样品前处理：按7.1.1（2）完成除蛋白、除佐剂处理后，取上清液过0.22μm滤膜，再经OnGuardIIRP固相萃取小柱（活化后使用）去除残留有机物，弃去前3mL流出液，收集后续流出液待测。（3）样品测定：与标准曲线相同条件进样测定，根据保留时间定性，峰面积代入标准曲线计算氟离子浓度，同时测定空白样品。7.2总氟测定7.2.1样品前处理（1）氧瓶燃烧法（适用于含蛋白、有机结合态氟、固体制剂的样品）：准确称取0.1g~0.5g固体样品（或移取0.5mL液体样品滴至无灰滤纸上，室温晾干），固定于氧瓶铂丝夹具上，氧瓶中预先加入10mL0.5mol/L氢氧化钠溶液作为吸收液，向氧瓶中充入高纯氧气1min，点燃滤纸后迅速塞紧瓶塞，待燃烧完全后振荡10min，静置30min使氟化氢完全被吸收。用超纯水冲洗瓶塞、铂丝，洗液并入吸收液中，滴加1滴酚酞指示剂，用1mol/L盐酸调节至红色刚好褪去，将溶液转移至25mL容量瓶中，加入12.5mLTISAB溶液，定容至刻度后混匀待测。（2）碱熔法（适用于含铝佐剂、无机络合态氟的样品）：准确称取0.2g~1.0g样品置于镍坩埚中，加入4g优级纯氢氧化钠，加盖后放入马弗炉，程序升温：从室温升至300℃保持30min，再升至550℃保持2h，冷却至室温后加入10mL80℃超纯水浸取熔块，用1mol/L盐酸调节pH至7.0~8.0，转移至50mL容量瓶中，加入25mLTISAB溶液，定容至刻度后混匀，静置取上清液待测。7.2.2测定：前处理后的样品可选择离子选择电极法或离子色谱法测定，操作同7.1.1与7.1.2。8干扰消除8.1阳离子干扰：铝离子、铁离子、锆离子等高价阳离子可与氟离子形成稳定络合物，导致测定结果偏低，选用含1mol/L柠檬酸钠的TISABII溶液可掩蔽浓度≤50mg/L的高价阳离子干扰，若样品中高价阳离子浓度超过50mg/L，可适当稀释样品后测定。8.2pH干扰：pH<5.0时，氟离子与氢离子形成HF、HF2-等形态降低游离氟浓度；pH>8.0时，氢氧根离子与氟离子选择电极敏感膜发生响应产生正干扰，测定液pH需严格控制在5.0~5.5范围内。8.3阴离子干扰：氯离子、硫酸根离子、硝酸根离子等浓度超过1000mg/L时，离子选择电极法会产生轻微干扰，可通过稀释样品消除；离子色谱法可通过色谱柱分离完全消除此类干扰。8.4基质干扰：蛋白、多糖等大分子物质可吸附氟离子，需通过三氯乙酸沉淀、氧瓶燃烧等前处理步骤完全去除后测定。9结果计算9.1液态样品游离氟/总氟含量计算：ρ(F)=(c×V×f)/V0式中：ρ(F)——样品中氟的质量浓度，单位为mg/L；c——标准曲线查得的测定液中氟浓度，单位为mg/L；V——测定液定容体积，单位为mL；f——样品稀释倍数；V0——取样体积，单位为mL。9.2固体样品游离氟/总氟含量计算：ω(F)=(c×V×f)/m式中：ω(F)——样品中氟的质量分数，单位为mg/kg；c——标准曲线查得的测定液中氟浓度，单位为mg/L；V——测定液定容体积，单位为mL；f——样品稀释倍数；m——取样质量，单位为g。9.3结果校正：所有测定结果需扣除全程空白与试剂空白的氟含量，空白氟含量超过方法检出限时，该批次样品测定结果无效。9.4结果表示：氟含量<0.1mg/L（或0.1mg/kg）时保留2位有效数字，≥0.1mg/L（或0.1mg/kg）时保留3位有效数字。10方法学验证要求10.1准确度：采用加标回收试验验证，分别添加低、中、高3个浓度水平的氟标准品，每个水平平行测定6次，回收率需在85%~115%范围内，相对标准偏差（RSD）≤5%。10.2精密度：日内精密度：同一样品平行测定6次，RSD≤3%；日间精密度：同一样品连续3天测定，每天平行测定3次，RSD≤5%。10.3检出限与定量限：离子选择电极法检出限为0.02mg/L，定量限为0.05mg/L；离子色谱法检出限为0.005mg/L，定量限为0.01mg/L。10.4专属性：空白基质样品测定值低于方法检出限，添加生物制品常见辅料（蔗糖、吐温80、明胶、组氨酸、铝佐剂等）的基质加标样品回收率在85%~115%范围内，判定为方法专属性合格。10.5线性范围：离子选择电极法线性范围为0.05mg/L~10mg/L，离子色谱法线性范围为0.01mg/L~20mg/L。11质量控制要求11.1每批次样品测定需同时制备标准曲线，线性相关系数需符合要求，否则需重新制备标准曲线。11.2每批次样品需同时测定全程空白、试剂空白，空白值低于方法检出限时判定为无交叉污染。11.3每10个样品插入1个质控样，质控样测定值需在标称值的±10%范围内，否则需重新测定该批次样品。11.4所有样品需做平行样测定，平行样相对偏差≤5%，否则需重新测定。12注意事项12.1氟离子选择电极使用前需置于10mg/L氟标准溶液中活化2h，使用后用超纯水冲洗至电位空白值（≥350mV）后干放保存，禁止长期浸泡于水或低浓度氟溶液中。电极使用超过1年或响应斜率低于50mV/decade时需更换。12.2测定时按浓度从低到高的顺序测定，高浓度样品测定后需充分冲洗电极，避免记忆效应影响低浓度样品测定结果。12.3氧瓶燃烧操作时需佩戴防护面罩，确认氧瓶密封良好，燃烧不完全的样品需重新处理。12.4离子色谱法使用的淋洗液需现配现用，经0.22μm滤膜过滤并脱气后使用，避免气泡进入色谱系统。12.5试验操作区禁止存放聚四氟乙烯生料带、含氟橡胶制品等含氟材料，避免环境氟污染。13异常情况处理13.1标准曲线线性不合格：检查电极是否老化、标准溶液是否过期、TISABpH是否符合要求，排除故障后重新制备标准曲线。13.2加标回收率偏低：检查前处理过程是否有样品损失、氧瓶燃烧是否完全、是否存在高价阳离子络合干扰、测定液pH是否符合要求，针对问题优化前处理流程后重新测定。13.3平行样偏差过大：检查电极电位是否稳定、搅拌速度是否均匀、容器是否存在氟污染，排除问题后重新测定。14废物处理14.1含氟废液：收集至专用聚乙烯废液桶中，加入过量氯化钙溶液搅拌，使氟离子完全生成氟化钙沉淀，上清液经检测氟含量≤10mg/L后方可排放，沉淀按危险废物处置。14.2固体废弃物：氧瓶燃烧后的残渣、废弃滤膜、固相萃取小柱等装入密封袋