生物制品鉴别试验指南（试行）

生物制品鉴别试验指南（试行）1总则1.1目的为规范生物制品鉴别试验操作，保证检验结果的准确性、可靠性和可追溯性，保障生物制品质量安全，依据《中华人民共和国药品管理法》《中国药典》2025年版三部、《生物制品质量控制技术规范》等法规标准，制定本指南。1.2适用范围本指南适用于疫苗类、血液制品类、重组蛋白及抗体类、细胞治疗产品类、基因治疗产品类、变态反应原类生物制品的出厂放行检验、上市后监督抽验、应急检验中的鉴别试验环节，涵盖所有按照生物制品管理的药品、血源筛查类体外诊断试剂的真实性鉴别需求。1.3定义生物制品鉴别试验是指采用物理、化学、免疫学、分子生物学、生物学活性测定等技术，确认待检品的核心属性与标示信息一致，排除假冒、掺假、毒株/细胞株错配、序列变异等质量风险的检验项目，是生物制品质量控制的必检项，所有批次产品放行前必须完成鉴别试验并符合规定。2基本要求2.1人员要求2.1.1检验人员应具备生物学、药学、医学等相关专业大专及以上学历，通过生物制品检验操作技术、生物安全防护、偏差处理等专项培训并考核合格，取得对应检验项目的上岗资质。2.1.2涉及高致病性病原微生物、CAR-T细胞、基因治疗载体等特殊样品检验的人员，应额外接受对应品类的专项操作培训，每年至少开展1次实操能力考核，考核不合格者不得独立开展检验工作。2.1.3检验人员应熟悉待检品的特性、储存要求、检验方法原理及操作要点，严格按照规程开展试验，如实记录原始数据，不得篡改、伪造检验记录。2.2设施设备要求2.2.1试验场所应符合检验项目的生物安全等级要求：涉及灭活疫苗、重组蛋白、血液制品检验的区域应为清洁级，涉及活病毒、活菌疫苗、活细胞产品、感染性样本检验的区域应为BSL-2及以上生物安全实验室，涉及高致病性病原微生物的应在BSL-3及以上实验室开展。2.2.2设备应按规定定期校准：移液器每6个月校准1次，体积误差≤±0.5%；酶标仪每年校准1次，波长误差≤±2nm，吸光度误差≤±0.01A；核酸扩增仪每季度校准1次，孔间温度差≤±0.2℃；流式细胞仪每季度校准荧光通道，CV值≤±2%；液相色谱-质谱仪每年校准1次，质量准确度≤±5ppm。2.2.3设备使用前应确认处于正常状态，有使用记录，故障设备应挂标识停用，维修校准合格后方可重新使用。2.3试剂与对照品要求2.3.1商用试剂应选择有合法资质的供应商提供的合格产品，在有效期内按照要求储存，不得使用过期、变质、污染的试剂。自制试剂（如电泳缓冲液、细胞培养液等）应有配制记录、有效期标识，配制后应经过无菌、性能验证合格后方可使用，例如细胞培养液配制后应做无菌试验，无细菌、真菌、支原体生长，支持细胞生长活力≥95%。2.3.2标准品、对照品应优先使用中国食品药品检定研究院提供的法定标准品；采用工作标准品的，应定期与法定标准品进行溯源校准，活性偏差≤±5%，含量偏差≤±10%方可使用。2.3.3涉及鉴别试验的抗体、引物、探针等关键试剂，应经过专属性验证，确认无交叉反应后投入使用。2.4样品要求2.4.1待检品应按照产品说明书规定的条件储运，取样前应检查样品包装完整性、外观性状、有效期，不符合要求的样品不得开展检验。2.4.2取样量应满足平行试验、复验、留样需求，至少为单次检验用量的3倍。样品取样后应按照要求分装，避免反复冻融影响活性，用于核酸检验的样品应避免核酸酶污染，用于活性检验的样品应全程低温运输。2.4.3样品留样应符合《药品生产质量管理规范》要求：疫苗类样品留样至有效期后1年，血液制品、重组蛋白类留样至有效期后6个月，细胞治疗产品、基因治疗产品留样至产品使用后5年。2.5生物安全要求2.5.1试验过程中产生的感染性废弃物应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》要求处理，液体废弃物采用121℃高压灭菌20分钟，固体废弃物采用高压灭菌或焚烧处理，处理后应进行灭活验证，残留活菌/活病毒载量≤1CFU/10mL。2.5.2检验人员应根据生物安全等级穿戴对应的个人防护装备，试验结束后应对试验台面、设备表面采用1000mg/L含氯消毒剂或75%酒精消毒，空气采用紫外线照射30分钟消毒。3常用鉴别试验方法及操作规范3.1免疫学鉴别试验免疫学鉴别试验基于抗原抗体特异性结合原理，是生物制品最常用的鉴别方法，适用于绝大多数含有蛋白抗原的生物制品。3.1.1免疫印迹法（WesternBlot）（1）原理：待检品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至固相载体，采用针对目标蛋白的特异性抗体结合，通过显色或发光反应判定目标蛋白是否存在，同时可确认目标蛋白的分子量是否符合要求。（2）适用范围：重组蛋白药物、单克隆抗体、亚单位疫苗、多糖结合疫苗的载体蛋白、血液制品的目标蛋白鉴别。（3）操作步骤：①胶制备：根据目标蛋白分子量选择分离胶浓度：分子量<10kD采用15%分离胶，10kD~100kD采用10%分离胶，>100kD采用7.5%分离胶，浓缩胶统一采用5%浓度。②样品处理：取待检品按1:4比例加入5×上样缓冲液，还原性电泳需加入终浓度5%的β-巯基乙醇，100℃煮沸5分钟变性，上样量不少于10μg总蛋白，同时上样分子量标准品、阳性对照品、阴性基质对照品。③电泳：恒压80V电泳至溴酚蓝进入分离胶后，调整电压至120V，电泳至溴酚蓝迁移至分离胶底部停止。④转膜：采用湿转法，恒流300mA，转膜时间根据分子量调整：<10kD转膜15分钟，10kD~100kD转膜30分钟，>100kD转膜60分钟，转膜过程需冰浴降温避免蛋白降解。⑤封闭：采用5%脱脂奶粉或1%BSA的PBST缓冲液，室温封闭1小时或4℃封闭过夜。⑥一抗孵育：将特异性一抗按工作浓度（1:500~1:10000）稀释后加入膜上，室温孵育1小时，PBST洗膜3次，每次5分钟。⑦二抗孵育：将HRP标记的对应二抗按工作浓度（1:2000~1:10000）稀释后加入膜上，室温孵育1小时，PBST洗膜3次，每次5分钟。⑧显色：采用ECL发光液等体积混合后滴加在膜上，曝光时间10s~5分钟，采集发光图像。（4）结果判定：阳性对照在预期分子量位置出现特异性条带，阴性对照无条带，待检品在对应分子量位置出现特异性条带，分子量偏差≤±10%，判定为符合规定。（5）验证要求：方法学验证需确认专属性：3批不含目标蛋白的阴性基质样品无特异性条带；检测限：可检出最低浓度为1μg/mL的目标蛋白；精密度：批内条带灰度值RSD≤10%，批间RSD≤15%。3.1.2双抗体夹心ELISA法（1）原理：将特异性抗体包被于固相载体，捕获待检品中的目标抗原，再加入酶标记的另一特异性抗体形成夹心复合物，加入底物后显色，通过吸光度值判定目标抗原是否存在。（2）适用范围：疫苗抗原快速鉴别、血液制品凝血因子鉴别、重组蛋白药物半定量鉴别、病毒抗原检测。（3）操作步骤：①包被：采用pH9.6的碳酸盐缓冲液将捕获抗体稀释至1μg/mL~5μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，PBST洗板3次，每次3分钟。②封闭：每孔加入200μL含1%BSA的PBST缓冲液，37℃封闭2小时，洗板3次。③加样：每孔加入待检品、阳性对照、阴性对照各100μL，每个样品设置2复孔，37℃孵育1小时，洗板3次。④加酶标抗体：每孔加入100μL工作浓度的酶标抗体，37℃孵育1小时，洗板3次。⑤显色：每孔加入100μLTMB底物溶液，37℃避光显色10分钟，加入50μL2mol/L硫酸终止反应，采用酶标仪在450nm波长下读取OD值。（4）结果判定：待检品OD值与阴性对照OD值的比值（P/N）≥2.1，阳性对照OD值处于规定范围内，判定为符合规定。（5）验证要求：专属性：3批阴性基质样品P/N<2.1；加标回收率：80%~120%；精密度：复孔OD值RSD≤10%。3.1.3免疫凝集试验（1）原理：颗粒性抗原（细菌、病毒致敏颗粒、红细胞等）与对应特异性抗体结合，在适宜电解质条件下形成肉眼可见的凝集块，用于抗原定性或血清型鉴别。（2）适用范围：细菌类疫苗（肺炎球菌疫苗、流脑疫苗、百白破疫苗等）血清型鉴别、红细胞类制品血型鉴别、病毒类疫苗血凝素鉴别。（3）操作步骤：①玻片法：取10μL待检品滴加于洁净玻片上，加入10μL特异性分型血清，轻轻混匀后室温静置2分钟~5分钟，观察凝集情况，同步设置阴性血清对照、阳性抗原对照。②试管法：将待检品用生理盐水做2倍倍比稀释，每管加入100μL，再加入100μL对应抗体，37℃孵育1小时，观察凝集程度。（4）结果判定：玻片法待检品出现可见凝集块，阴性对照无凝集，判定为阳性；试管法待检品凝集效价≥1:8，阳性对照效价在规定范围内，判定为符合规定。3.2核酸类鉴别试验基于核酸序列的特异性，通过扩增、测序等方法确认待检品的核酸序列与预期一致，适用于病毒类疫苗、基因治疗产品、mRNA疫苗、细胞治疗产品的鉴别。3.2.1常规PCR法（1）原理：采用针对目标序列的特异性引物，在DNA聚合酶作用下扩增目标核酸片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，通过片段大小判定目标核酸是否存在。（2）适用范围：病毒类疫苗毒株鉴别、细菌类疫苗菌种鉴别、基因治疗产品载体鉴别、mRNA疫苗逆转录后cDNA序列鉴别。（3）操作步骤：①核酸提取：取100μL待检品，采用磁珠法或柱提法提取核酸，核酸纯度A260/A280应处于1.8~2.0之间，浓度≥10ng/μL，mRNA样品需先逆转录为cDNA。②反应体系：25μL体系包含2×PCRMix12.5μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、模板核酸2μL、无酶水8.5μL，同步设置无模板阴性对照、阳性模板对照。③扩增程序：预变性95℃5分钟；循环阶段：95℃变性30s，退火温度为引物Tm值减5℃，30s，72℃延伸，延伸时间按片段长度设置为1kb/min，共35个循环；终延伸72℃10分钟。④电泳检测：取5μL扩增产物与1μL上样缓冲液混合，点样于含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中，120V电泳20分钟，凝胶成像系统观察条带。（4）结果判定：阳性对照在预期片段大小位置出现特异性条带，阴性对照无条带，待检品出现对应大小的特异性条带，片段长度偏差≤±5%，判定为符合规定。（5）验证要求：专属性：非目标模板无扩增条带；检测限≤10拷贝/反应；扩增效率90%~110%，线性相关系数R²≥0.99。3.2.2实时荧光定量PCR法（qPCR）（1）原理：在PCR扩增体系中加入荧光探针或荧光染料，实时监测扩增过程中的荧光信号强度，通过Ct值判定目标核酸是否存在，可实现绝对定量。（2）适用范围：低载量核酸样品鉴别、病毒疫苗外源因子鉴别、CAR-T细胞CAR基因整合鉴别、AAV载体基因组滴度测定。（3）操作步骤：①核酸提取同常规PCR法。②反应体系：20μL体系包含2×qPCRMix10μL、上下游引物（10μmol/L）各0.4μL、荧光探针（10μmol/L）0.2μL、模板核酸2μL、无酶水7μL。③扩增程序：预变性95℃30s；循环阶段：95℃5s，60℃30s，共40个循环，60℃延伸阶段采集荧光信号。（4）结果判定：阳性对照Ct值处于20~30之间，阴性对照Ct值>40或无Ct值，待检品Ct值≤35，判定为符合规定。（5）验证要求：线性范围覆盖10^1~10^8拷贝/反应，批内Ct值RSD≤2%，批间RSD≤5%。3.2.3Sanger测序法（1）原理：采用双脱氧链末端终止法测定目标核酸片段的碱基序列，与参考序列比对确认序列一致性。（2）适用范围：疫苗毒株减毒位点验证、基因治疗产品插入序列确认、重组蛋白表达基因序列验证、变异株鉴别。（3）操作步骤：采用常规PCR扩增目标片段，纯化后进行测序反应，测序产物纯化后上测序仪检测，测序覆盖度应达到目标片段的100%，测序峰图Q值≥20的碱基占比≥95%。（4）结果判定：待检品序列与参考序列同源性≥99.9%（减毒活疫苗毒株）或100%（重组药物、基因治疗产品），判定为符合规定。3.3生物学活性鉴别试验基于生物制品的功能活性，通过细胞或动物水平的试验确认其活性符合预期，适用于活性类生物制品的鉴别。3.3.1中和试验（CPE抑制法）（1）原理：特异性抗体或抗血清与病毒混合后，可中和病毒的感染性，抑制病毒对敏感细胞的致病变效应（CPE），通过观察细胞病变情况判定中和活性。（2）适用范围：抗病毒血清、灭活疫苗毒株鉴别、中和抗体类药物鉴别。（3）操作步骤：将待检品做2倍倍比稀释，每孔加入100TCID50的标定病毒液，37℃中和1小时，加入已培养至单层的敏感细胞，37℃、5%CO2培养箱培养3~7天，每日观察CPE。（4）结果判定：阴性对照出现100%CPE，阳性对照中和效价在规定范围内，待检品完全抑制CPE的最高稀释度（中和效价）≥1:16，判定为符合规定。3.3.2细胞结合活性试验（流式法）（1）原理：单克隆抗体、CAR-T细胞等可特异性结合表达目标靶点的细胞，采用荧光标记抗体结合后，通过流式细胞术检测结合率，确认靶点特异性。（2）适用范围：单抗药物靶点鉴别、CAR-T细胞靶点鉴别、融合蛋白活性鉴别。（3）操作步骤：取1×10^6个表达目标靶点的阳性细胞、不表达靶点的阴性细胞分别加入试管，加入待检品（终浓度1μg/mL~10μg/mL），4℃孵育30分钟，PBS洗2次，加入荧光标记二抗，4℃孵育30分钟，PBS洗2次后上机检测。（4）结果判定：待检品与阳性细胞的结合率≥90%，与阴性细胞的结合率≤5%，判定为符合规定。3.4理化鉴别试验基于生物制品的物理化学特性，通过色谱、质谱等技术确认其结构、组分与对照品一致。3.4.1高效液相色谱法（HPLC）（1）原理：根据生物制品的分子大小、电荷、疏水性等差异，在色谱柱中实现分离，通过保留时间、峰形等参数判定待检品与对照品是否一致。（2）适用范围：重组蛋白药物纯度鉴别、血液制品组分鉴别、多糖疫苗分子量分布鉴别、mRNA完整性鉴别。（3）操作规范：①分子排阻色谱（SEC）：采用适宜的SEC色谱柱，流动相为pH7.0的磷酸盐缓冲液，流速0.5mL/min，检测波长280nm，进样量20μL。待检品主峰保留时间与对照品保留时间偏差≤±2%，判定为符合规定。②离子交换色谱（IEC）：采用离子交换色谱柱，梯度洗脱，检测波长280nm，待检品电荷异构体峰分布与对照品一致，主要峰面积占比偏差≤±5%，判定为符合规定。3.4.2液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）（1）原理：通过酶解待检品获得肽段，经液相分离后进入质谱检测，获得肽段的分子量、序列信息，与理论序列比对，确认一级结构正确性。（2）适用范围：重组蛋白药物一级结构确证、翻译后修饰位点鉴别、单抗糖型分析。（3）结果判定：待检品肽段覆盖率≥95%，目标修饰位点肽段检出率100%，分子量实测值与理论值偏差≤±0.01%，判定为符合规定。4特殊生物制品专属鉴别要求4.1疫苗类减毒活疫苗需额外开展毒株基因型鉴别，确认减毒位点序列未发生突变；灭活疫苗需开展灭活验证，无活病毒检出；mRNA疫苗需开展加帽率检测，加帽率≥90%，polyA尾长度符合规定；多糖结合疫苗需开展多糖与载体蛋白结合验证，游离多糖占比≤10%。4.2血液制品类人血白蛋白需开展多态性鉴别，无其他血清蛋白污染；静注人免疫球蛋白需开展Fc段活性鉴别，补体激活活性符合规定；凝血因子类产品需开展凝血活性鉴别，效价符合标示量的80%~150%。4.3抗体类药物单克隆抗体需开展亚型鉴别，确认重链、轻链亚型与标示一致；双特异性抗体需开展两个靶点的结合活性验证，每个靶点结合率≥85%；抗体偶联药物需开展药物抗体比（DAR）鉴别，DAR值符合规定范围。4.4细胞治疗产品CAR-T细胞需开展CAR阳性率检测，CAR阳性率≥80%；细胞表面标志物鉴别，CD3/CD4/CD8比例符合规定；活细胞率≥90%，无支原体、细菌、真菌污染。4.5基因治疗产品AAV载体需开展血清