生物制品砷盐测定指南（试行）

生物制品砷盐测定指南（试行）1适用范围1.1本指南适用于疫苗类、抗毒素/抗血清类、血液制品类、重组生物技术产品类、细胞与基因治疗产品类、医用生物辅料类等生物制品的原辅材料、中间品、成品的砷盐测定，同时适用于生物制品生产过程中工艺用水、缓冲液、生产接触耗材浸出液的砷盐筛查与定量检测。1.2本指南涵盖砷盐限度检查、半定量测定、痕量定量测定三类检测场景，各检测机构可根据样品基质特点、限值要求选择对应的检测方法。2规范性引用文件2.1《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0822砷盐检查法2.2《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0412电感耦合等离子体质谱法2.3USP43-NF38<211>Arsenic2.4EP11.02.4.2Arsenic2.5GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测2.6生物制品生产用原材料质量控制技术指南（2023年版）3术语与定义3.1砷盐：本指南中所指砷盐为样品中总砷含量，以单质砷（As）的质量计，包括无机砷和有机砷的总和。3.2检出限（LOD）：指特定检测方法可定性检出样品中砷的最低浓度或最低质量，对应99%置信水平下空白样品测定值的3倍标准偏差。3.3定量限（LOQ）：指特定检测方法可准确定量样品中砷的最低浓度或最低质量，对应空白样品测定值的10倍标准偏差。3.4古蔡氏法：又称砷斑法，通过砷化氢与溴化汞试纸生成特征色斑进行限度比对的方法。3.5二乙基二硫代氨基甲酸银法（简称Ag-DDC法）：通过砷化氢与Ag-DDC试剂生成红色胶态银进行比色定量的方法。3.6电感耦合等离子体质谱法（简称ICP-MS法）：通过等离子体电离后分离检测砷离子质荷比信号进行痕量定量的方法。4基本要求4.1人员要求检测人员需经过痕量金属检测、生物制品前处理专项培训并考核合格，熟悉对应检测方法的原理与操作流程，能够独立排查仪器异常、判断数据可靠性，掌握实验室生物安全防护要求。4.2环境要求痕量砷检测需在洁净度等级不低于万级的理化实验室局部百级操作区内开展，实验用通风橱需为痕量金属检测专用，不得与含砷试剂、重金属消化类实验共用通风区域；操作区空气砷本底浓度需≤0.01μg/m³，每季度至少开展1次本底监测。4.3器皿要求所有接触样品、试剂的玻璃器皿、聚四氟乙烯（PTFE）器皿，使用前需用20%（v/v）优级纯硝酸浸泡≥24h，再用电阻率≥18.2MΩ·cm的超纯水冲洗≥6次，于100℃洁净烘箱中烘干后密封保存；禁止使用铬酸洗液清洗器皿，避免铬酸中砷杂质引入污染；微波消解罐每次使用后需用20%硝酸煮沸30min后再按常规流程清洗。4.4试剂要求所有试剂优先选用痕量金属级，至少为优级纯；实验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm的超纯水，总砷含量≤0.001μg/L；砷标准贮备液需使用国家有证标准物质，浓度为1000μg/mL，4℃避光保存有效期12个月；砷标准工作液需临用前用5%（v/v）硝酸逐级稀释配制，不得存放复用。5方法选择原则5.1古蔡氏法适用于砷盐限度检查场景，无需准确定量的原辅材料快速筛查、工艺用水日常巡检、中间品内控限度核验，方法检出限为0.1μgAs，定量限为0.3μgAs，仅适用于基质简单、无强还原性物质的样品，如氯化钠、蔗糖、甘氨酸等药用辅料、纯化水、磷酸盐缓冲液等。5.2Ag-DDC法适用于半定量及定量检测场景，可满足大部分常规生物制品的砷盐质量控制要求，方法检出限为0.05μgAs，定量限为0.15μgAs，适用于重组蛋白原液、抗毒素成品、普通灭活疫苗、血液制品等基质复杂度中等的样品。5.3ICP-MS法适用于痕量砷准确定量场景，可满足高风险生物制品的严格限值要求，方法检出限为0.001μg/L，定量限为0.003μg/L，适用于细胞与基因治疗产品、mRNA疫苗、含佐剂疫苗、静脉注射用免疫球蛋白、生产用一次性耗材浸出液等基质复杂、限值要求严苛的样品。6样品前处理6.1采样要求样品需具有代表性，无菌样品采样需在百级生物安全柜内操作，避免采样过程引入砷污染；液体样品取样量为0.5~5mL，固体样品取样量为0.2~5g，根据限值要求调整取样量，确保样品中总砷含量不低于方法定量限。6.2湿法消解适用范围：不含铝佐剂、不含氟化物的基质简单样品，如重组蛋白原液、抗毒素、普通血液制品。操作步骤：称取0.5~2.0g固体样品或量取1~5mL液体样品，置于100mL凯氏烧瓶中，加入5~10mL优级纯硝酸，混匀后放置过夜，再加入2~3mL优级纯硫酸，设置消解温度为120~160℃加热消解；若消解过程中溶液变为棕黑色，需逐次补加1~2mL硝酸，直至溶液呈无色或微黄色，继续加热至冒白烟后冷却；加入20mL超纯水，加热赶酸至剩余体积2~3mL，冷却后转移至25mL容量瓶，用超纯水定容至刻度，同步制备试剂空白。注意事项：含高浓度蛋白的样品初始消解需采用小火加热，避免暴沸溢洒；赶酸需彻底，硝酸残留量需≤1%（v/v），避免干扰后续显色反应；加标回收率需控制在80%~120%之间，超出范围需重新前处理。6.3干法灰化适用范围：耐高温、无挥发性砷组分的样品，如蔗糖、甘氨酸、氯化钠等药用辅料。操作步骤：称取1~5g样品置于瓷坩埚中，加入10mL10%（w/v）硝酸镁溶液混匀，小火蒸干后置于电炉上炭化至无烟，转移至马弗炉中550℃灰化4~6h；冷却后加入2~3mL盐酸（1+1）溶解灰分，转移至25mL容量瓶定容至刻度，同步制备试剂空白。注意事项：灰化温度不得超过600℃，避免砷挥发损失；若灰分残留黑色碳粒，需加少量硝酸润湿后重新灰化；加标回收率需控制在75%~120%之间，低于75%需改用湿法或微波消解。6.4微波消解适用范围：所有生物制品基质，尤其适用于含铝佐剂、高浓度蛋白、脂质体、纳米制剂等复杂基质样品。操作步骤：称取0.2~1.0g固体样品或量取0.5~2mL液体样品置于PTFE消解罐内，加入5mL痕量金属级硝酸、1~2mL30%优级纯过氧化氢，盖紧罐盖后装入微波消解仪；采用三阶升温程序：10min升温至120℃，保持5min；5min升温至160℃，保持10min；5min升温至190℃，保持20min；消解结束后自然冷却至室温，取出消解罐置于140℃赶酸器上赶酸，至剩余液体体积约1mL，冷却后转移至对应容量瓶，用5%硝酸定容至刻度，同步制备试剂空白。注意事项：含氟化物的样品需额外加入1~2mL49%氢氟酸消解，并采用耐氢氟酸的PP容量瓶定容；消解罐密封性能需定期核验，避免消解过程中砷挥发损失；赶酸后硝酸残留量需≤0.5%（v/v），避免对后续检测产生干扰；加标回收率需控制在85%~115%之间，低于85%或高于115%需重新开展前处理。6.5前处理豁免要求基质为纯水、低浓度缓冲液、无有机物的小分子辅料溶液，且无强还原性物质的样品，可无需消解直接取样检测，需同步做基质空白验证无干扰。7测定操作程序7.1古蔡氏法7.1.1原理：砷盐在酸性溶液中被锌粒还原为砷化氢，与溴化汞试纸反应生成黄色至棕色的特征砷斑，与标准砷斑颜色比对判断砷含量是否符合限值要求。7.1.2操作步骤：采用符合中国药典要求的定制测砷装置，导气管内填充0.1g醋酸铅棉花（填充长度1~2cm），顶端放置现制的溴化汞试纸并密封；取前处理好的供试品溶液（对应原样品量1g或1mL，可根据限值调整）置于测砷瓶中，加入5mL碘化钾试液（16.5%碘化钾水溶液）、5滴酸性氯化亚锡试液（40%氯化亚锡盐酸溶液），摇匀后放置10min，加入2g无砷锌粒，立即塞紧导气管，置于25~30℃水浴中反应45min；取出溴化汞试纸，与同步制备的标准砷斑比对。7.1.3标准砷斑制备：取2mL标准砷工作液（每1mL含1μgAs），与供试品同法操作制备。7.1.4结果判定：供试品砷斑颜色浅于或等于标准砷斑，判定为符合限度要求；深于标准砷斑判定为不符合，需复检。7.1.5注意事项：溴化汞试纸需临用前制备，避光保存且不得受潮；平行样品砷斑颜色差异不得超过1个色阶，否则需重新测定。7.2Ag-DDC法7.2.1原理：砷化氢与Ag-DDC的三乙胺-三氯甲烷溶液反应生成红色胶态银，在510nm波长处测定吸光度，与标准系列比对定量。7.2.2标准曲线制备：取0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mL砷标准工作液（1μg/mLAs）分别置于测砷瓶中，各加入5mL盐酸（1+1），补加超纯水至总体积35mL，加入5mL碘化钾试液、5滴酸性氯化亚锡试液，摇匀后放置10min，加入2g无砷锌粒，立即将导气管下端插入盛有5.0mLAg-DDC试液的比色管中，反应45min；取出比色管，加三氯甲烷定容至5mL，用1cm比色皿在510nm波长处测定吸光度，以砷含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，相关系数需≥0.999。7.2.3样品测定：取前处理好的供试品溶液（含砷量在0.5~5μg之间），按标准曲线制备同法操作，测定吸光度后代入标准曲线得到砷含量，同步测定试剂空白。7.2.4结果计算：样品中总砷含量按式（1）计算：X=(C1-C0)×V/(m×1000)（1）式中：X为样品中总砷含量，单位为mg/kg（固体）或mg/L（液体）；C1为供试品溶液中砷的质量，单位为μg；C0为试剂空白中砷的质量，单位为μg；V为供试品溶液定容体积，单位为mL；m为样品取样量，单位为g（固体）或mL（液体）；1000为单位换算系数。7.2.5注意事项：Ag-DDC试液需临用前配制，棕色瓶避光保存不得超过7天；导气管需保持干燥，避免水分进入显色液导致浑浊；试剂空白吸光度需≤0.010，否则需更换试剂重新测定。7.3ICP-MS法7.3.1原理：样品经消解后进入电感耦合等离子体，在高温下被电离为砷离子，经质谱仪质量分析器按质荷比分离后，检测75As的特征信号强度，采用内标法校正基质效应和仪器漂移，与标准系列比对定量。7.3.2仪器调谐：开机后预热≥30min，采用含Li、Co、Y、Ce、Tl的1μg/L调谐液进行仪器参数优化，要求氧化物产率（CeO+/Ce+）≤2%，双电荷产率（Ba2+/Ba+）≤3%，灵敏度满足7Li信号强度≥20000cps/μg/L、115In信号强度≥40000cps/μg/L，分辨率符合半峰宽0.6~0.8amu要求。7.3.3标准曲线制备：用5%硝酸配制砷标准系列溶液，浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0μg/L，在线加入10μg/L72Ge内标溶液，进样测定后以砷浓度为横坐标，砷与内标信号强度的比值为纵坐标绘制标准曲线，相关系数需≥0.9995。7.3.4样品测定：将前处理好的供试品溶液、空白溶液、质控样品依次进样测定，采用碰撞/反应池模式消除40Ar35Cl对75As的干扰，氦气碰撞气流量设置为3~5mL/min；每测定10个样品插入1次标准曲线中间浓度点核验，偏差需≤5%，否则需重新校准曲线。7.3.5结果计算：样品中总砷含量按式（2）计算：X=(C1-C0)×V×D/(m×1000)（2）式中：X为样品中总砷含量，单位为mg/kg（固体）或mg/L（液体）；C1为供试品溶液中砷的浓度，单位为μg/L；C0为试剂空白中砷的浓度，单位为μg/L；V为供试品溶液定容体积，单位为mL；D为供试品溶液的稀释倍数；m为样品取样量，单位为g（固体）或mL（液体）；1000为单位换算系数。7.3.6注意事项：含高盐基质的样品需稀释至盐浓度≤0.2%（w/v）后进样，避免雾化器堵塞和基质效应；内标溶液的回收率需控制在80%~120%之间，超出范围需检查进样系统是否异常。8方法学验证要求检测方法投入使用前需开展完整的方法学验证，验证内容包括：8.1专属性：基质加标试验验证无明显干扰，目标峰无杂峰干扰，加标前后信号差异符合方法回收率要求。8.2检出限与定量限：连续测定11次试剂空白，3倍标准偏差对应的浓度为检出限，10倍标准偏差对应的浓度为定量限，定量限需低于产品限值的1/10。8.3准确度：采用三个浓度水平的加标回收试验验证，分别为限值的50%、100%、150%，每个浓度水平平行制备6份样品，各方法回收率需符合以下要求：古蔡氏法显色偏差不超过1个色阶，Ag-DDC法回收率80%~120%，ICP-MS法回收率85%~115%。8.4精密度：重复性要求为同一操作人员、同一仪器、同一工作日测定6份平行样品，相对标准偏差（RSD）：古蔡氏法无明显颜色差异，Ag-DDC法RSD≤10%，ICP-MS法RSD≤5%；中间精密度要求为不同操作人员、不同日期、不同仪器测定同一样品，RSD≤15%。8.5线性与范围：标准曲线相关系数符合对应方法要求，线性范围需覆盖限值的20%~200%。8.6耐用性：小幅改变前处理温度、消解时间、pH值、反应温度等参数，测定结果偏差≤10%，说明方法耐用性符合要求。9检测质量控制9.1空白控制：每批次检测需同时开展试剂空白、器皿空白测定，空白中砷含量需低于对应方法的检出限，否则整批次检测结果无效，需排查污染来源后重新检测。9.2阳性质控：每批次检测需同时测定基质加标阳性质控样品，加标浓度为限值浓度，回收率需符合方法要求，否则整批次检测结果无效。9.3平行样控制：每个样品需至少制备2份平行样，测定结果的相对偏差需≤15%，超出范围需重新制备样品测定。9.4留样复测：检测结果超出限值时，需用留存的原样重新取样复测，复测2份平行样均符合限值要求的，判定为符合规定；复测仍有1份及以上超出限值的，判定为不符合规定。10结果判定与报告要求10.1判定依据：根据对应生物制品的法定质量标准、内控质量标准中的砷盐限值判定，常用生物制品砷盐限值如下：注射用常规生物制品≤0.1mg/kg，口服生物制品≤0.3mg/kg，静脉注射血液制品≤0.05mg/kg，细胞与基因治疗产品≤0.01mg/kg，药用辅料≤0.5mg/kg，工艺用水≤0.01mg/L。10.2结果检测报告需注明检测方法、前处理方法、检出限、定量限、回收率、平行样相对偏差，结果保留两位有效数字，处于限值附近的结果需保留至与限值相同的小数位数；低于检出限的结果需标注为“<LOD”，低于定量限的结果需标注为“<LOQ”。11异常情况处置11.1古蔡氏法砷斑异常：砷斑呈灰色、黑色或边界模糊时，说明存在硫化氢、有机还原性物质干扰，需增加醋