ISO 217662021 烟草和烟草制品.烟草制品中烟草专用亚硝胺的测定.LC-MSMS法标准立项发展报告

ISO21766:2021《烟草和烟草制品烟草制品中烟草专用亚硝胺的测定LC-MS/MS法》标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:TobaccoandTobaccoProducts—DeterminationofTobacco-SpecificNitrosaminesinTobaccoProducts—MethodUsingLC-MS/MS摘要烟草专用亚硝胺（Tobacco-SpecificNitrosamines,TSNAs）是烟草制品中一类具有显著致癌活性的有害化学成分，主要包括N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟碱（NAB）和N-亚硝基假木贼碱（NAT）。随着全球烟草控制框架公约的深入实施和烟草制品减害化趋势的推进，建立准确、灵敏、可靠的TSNAs检测方法标准，已成为国际烟草检验领域的重要技术需求。ISO21766:2021《烟草和烟草制品烟草制品中烟草专用亚硝胺的测定LC-MS/MS法》由国际标准化组织（ISO）于2021年2月3日正式发布，是国际上首个针对烟草制品中TSNAs定量检测的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法标准。本报告系统梳理了该标准的立项背景、研制历程、核心技术内容、试验验证情况及推广应用前景，分析其对烟草产品质量安全监管、国际贸易技术协调和公众健康保护的重要意义，并对标准未来修订方向提出展望。该标准的发布填补了国际烟草标准化领域在TSNAs检测方法上的空白，为全球烟草制品有害成分监测提供了统一的技术依据。关键词：烟草专用亚硝胺；LC-MS/MS；国际标准；ISO21766；烟草制品；有害成分检测Keywords:Tobacco-specificnitrosamines;LC-MS/MS;Internationalstandard;ISO21766;Tobaccoproducts;Harmfulconstituentdetermination1引言1.1研究背景烟草制品中的有害成分研究一直是公共卫生领域关注的焦点。烟草专用亚硝胺（TSNAs）是烟草特有的一类N-亚硝基化合物，由烟草生物碱（烟碱、降烟碱、新烟碱和假木贼碱）在烟草种植、调制、发酵和加工过程中经亚硝化反应而形成。大量毒理学和流行病学研究表明，TSNAs是烟草制品中最重要的致癌性有害成分之一，其中NNK和NNN已被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物（对人类致癌性证据充分）。TSNAs与吸烟相关的肺癌、口腔癌、食管癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤的发生密切相关。2003年世界卫生组织（WHO）通过的《烟草控制框架公约》（FCTC）及其相关决议，明确要求各缔约方对烟草制品进行成分管制和信息披露，建立烟草制品有害成分的检测方法和监管体系。在此背景下，各国纷纷加强对烟草制品中有害成分的监测力度，TSNAs作为关键的限量监控指标，其准确检测方法成为亟待解决的技术问题。1.2国内外标准现状在ISO21766:2021发布之前，烟草专用亚硝胺的检测方法在不同国家和组织中存在较大差异。美国联邦贸易委员会（FTC）、加拿大卫生部、WHO烟草实验室网络（TobLabNet）等机构分别建立了各自的检测方案，主要采用气相色谱-热能分析仪法（GC-TEA）或液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。然而，不同方法在前处理流程、色谱条件、质谱参数和定量方式等方面存在显著差异，导致检测结果的可比性和互认性不足。中国在烟草行业标准方面，国家烟草质量监督检验中心等机构曾发布行业标准YC/T379-2010《卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的测定气相色谱-热能分析仪法》等，但针对烟草制品本身（非烟气）中TSNAs的测定尚无统一的国家标准。国际层面也缺乏统一的LC-MS/MS检测方法标准，难以满足全球烟草制品贸易和质量监管一体化的需求。1.3标准立项的必要性随着烟草行业减害降焦战略的深入推进，烟草制品中有害成分的精准定量已成为产品质量控制和安全性评价的核心环节。LC-MS/MS技术凭借其高灵敏度、高选择性和可同时定量多种目标物的优势，已成为当前TSNAs检测的主流技术手段。然而，缺乏统一的国际标准导致不同实验室之间的检测数据难以横向比较，限制了国际烟草贸易中的技术协调和监管互认。因此，亟需制定一项基于LC-MS/MS技术的国际标准，规范烟草制品中TSNAs的检测方法和质量要求。2标准编制过程2.1标准立项阶段ISO21766:2021由国际标准化组织烟草及烟草制品技术委员会（ISO/TC126）提出并负责制定。ISO/TC126是国际标准化组织下设的专门负责烟草及烟草制品领域标准化的技术委员会，其工作范围涵盖烟草原料、烟草制品、烟草工业设备和检测方法等各个领域。在标准立项前，ISO/TC126通过广泛征集各成员国意见和系统梳理现有技术方法，充分论证了制定烟草制品中TSNAs检测方法国际标准的必要性和可行性。2018年，该项目在ISO/TC126全体大会上正式通过立项决议，编号为ISO21766，由中国、美国、德国、日本、韩国等多个成员国联合参与研制工作。项目组在ISO/TC126框架下成立了专门的工作组（WG），由来自各国烟草检验机构、标准化研究机构和仪器制造企业的技术专家组成。2.2标准起草阶段标准起草过程中，工作组系统收集了各成员国在TSNAs检测方面的技术资料和实验室数据，对已有方法进行了全面比较和评估。起草组重点解决了以下几个关键技术问题：（1）样品前处理方法的优化：比较了液-液萃取、固相萃取（SPE）等不同前处理方式对TSNAs提取效率和净化效果的影响，确定了以固相萃取为核心的样品制备流程。（2）色谱分离条件的确定：优化了色谱柱类型、流动相组成、梯度洗脱程序等参数，实现了四种TSNAs目标物（NNN、NNK、NAB、NAT）的有效分离。（3）质谱检测参数的优化：针对每种目标物优化了离子对选择、碰撞能量、离子源温度等关键参数，确保了检测的灵敏度和选择性。（4）内标物的选择：建立了以氘代同位素标记物为内标的定量方法，有效校正了基质效应和样品前处理过程中的回收率损失。2.3标准征求意见与审查阶段标准草案完成后，按照ISO标准制定程序，工作组将草案（CommitteeDraft,CD）分发给ISO/TC126各成员国征求意见。工作组对各成员国提出的意见和建议进行了逐条处理，形成了国际标准草案（DraftInternationalStandard,DIS）。在DIS阶段，各成员国进行了为期三个月的投票和意见反馈，工作组再次对草案进行了修改完善，最终形成了最终国际标准草案（FinalDraftInternationalStandard,FDIS）。经过多轮技术审查和文字修订，ISO21766:2021于2021年2月3日由国际标准化组织正式发布实施。该标准的发布凝聚了各成员国的技术智慧和实践经验，是国际烟草标准化领域合作的重要成果。2.4标准的主要参与单位在该标准的研制过程中，来自多个国家的烟草检验机构和研究机构做出了重要贡献。其中，中国国家烟草质量监督检验中心是该标准的主要参与单位之一，在标准制定中发挥了积极作用。中国国家烟草质量监督检验中心（ChinaNationalTobaccoQualitySupervisionandTestCenter）隶属于国家烟草专卖局（中国烟草总公司），是经中国国家认证认可监督管理委员会（CNCA）资质认定的国家级产品质量监督检验机构，同时是中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认可的国家级实验室。该中心主要承担烟草及烟草制品、烟用辅料、烟用材料等产品的质量监督检验、仲裁检验、委托检验以及相关的标准研究和制修订工作。该中心拥有国际先进水平的液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）、气相色谱-热能分析仪（GC-TEA）、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）等大型精密分析仪器，建有完善的质量管理体系和专业技术团队。在TSNAs检测领域，该中心长期从事烟草制品及烟气中有害成分的分析方法研究和标准制定工作，积累了丰富的技术经验和实验数据。在ISO21766:2021的研制过程中，中国国家烟草质量监督检验中心承担了方法验证、实验室间协同试验和标准文本技术审查等重要任务，参加了多项国际实验室间的比对试验，为标准的科学性和适用性提供了有力的技术支持。此外，该中心还牵头和参与制定了多项烟草行业标准和国家标准，推动了我国烟草标准化工作与国际标准体系的接轨，为我国烟草行业的技术进步和质量提升做出了重要贡献。3标准主要内容解读3.1标准适用范围ISO21766:2021规定了采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定烟草制品中烟草专用亚硝胺含量的方法。该标准适用于各类烟草制品，包括卷烟烟丝、斗烟丝、鼻烟、嚼烟及其他无烟烟草制品中NNN、NNK、NAB和NAT四种TSNAs成分的定量检测。标准的适用范围明确排除了主流烟气和侧流烟气中TSNAs的测定，后者通常需要采用不同的采样和前处理方法。3.2方法原理该标准所采用的LC-MS/MS方法原理为：将待测烟草样品经适当前处理后，使TSNAs从样品基质中提取至溶剂中，经过固相萃取柱净化后，利用高效液相色谱将目标物与其他共存物质进行分离，然后在电喷雾离子源（ESI）正离子模式下实现电离，通过串联质谱的多反应监测（MRM）模式对目标物的特征离子对进行检测和定量。方法的定量采用内标法，以氘代同位素标记物为内标，根据目标物与内标的峰面积比值计算样品中各组分的含量。3.3关键技术参数前处理条件：标准规定了样品粉碎粒度、称样量、提取溶剂及用量、提取温度和时间等关键参数。提取溶剂通常采用含内标物的乙酸铵缓冲液或甲醇-水混合溶剂，通过振荡或超声辅助提取方式实现目标物的充分提取。固相萃取净化：标准采用混合型阳离子交换（MCX）或亲水亲脂平衡（HLB）型固相萃取柱进行样品净化，规定了活化、上样、淋洗和洗脱等步骤的具体条件，以有效去除样品基质的干扰杂质。色谱条件：推荐采用C18反相色谱柱（如2.1mm×100mm，1.7~3.5μm粒径），以乙酸铵-甲醇或乙酸铵-乙腈体系为流动相进行梯度洗脱分离，柱温控制在30~40℃，流速为0.2~0.4mL/min。质谱条件：电喷雾离子源正离子模式，离子源温度300~500℃，毛细管电压2.5~4.0kV，雾化气、干燥气和碰撞气流量根据仪器型号优化，通过MRM模式采集各目标物及对应内标物的两对离子对信息（定性离子对和定量离子对）。3.4方法性能指标标准对方法的性能指标提出了明确要求：（1）检测限（LOD）和定量限（LOQ）：NNN、NNK、NAB和NAT四种组分的LOD应不高于0.2ng/mL（提取液浓度），对应样品中含量约0.01μg/g；LOQ应不高于0.5ng/mL（提取液浓度），对应样品中含量约0.03μg/g。（2）回收率：在添加水平范围内，四种TSNAs组分的加标回收率应在85%~115%之间，相对标准偏差（RSD）不大于15%。（3）重复性和再现性：在实验室间协同试验中，方法的重复性限（r）和再现性限（R）应满足标准附录中给出的特定要求。3.5质量控制要求标准在质量控制方面提出了全面要求：每批样品测定时应同步进行空白试验和加标回收试验；每个分析批次应使用标准工作溶液绘制标准曲线（不少于6个浓度点），标准曲线的相关系数应不低于0.995；应定期使用质控样品进行方法性能监控，确保方法的稳定性和可靠性。3.6结果计算与报告标准详细规定了检测结果的计算方法，基于内标法的定量原理，通过目标物与内标物的峰面积比及标准曲线方程计算样品中各TSNAs组分的含量，结果以微克每克（μg/g）或毫克每千克（mg/kg）表示，报告结果应包含平行测定值的平均值和标准偏差，标注检测方法和检测日期等信息。4标准的适用性分析4.1技术优势LC-MS/MS法与传统GC-TEA法相比具有显著的技术优势：一是选择性更高，通过MRM模式可有效排除复杂基质干扰，实现对痕量目标物的准确测定；二是灵敏度更高，检测限可达pg级水平，满足痕量分析要求；三是可同时测定多种TSNAs组分，提高了检测效率；四是无需衍生化步骤，简化了样品前处理流程。4.2适用范围该标准适用于多种烟草制品类型，包括传统燃吸型烟草制品和新兴无烟烟草制品。对于不同类型的烟草制品，标准规定了相应的样品制备要求，确保方法的普适性和可操作性。4.3局限性分析值得注意的是，该标准主要适用于烟草制品本身中TSNAs的测定，对于主流烟气中TSNAs的测定需采用烟气捕集装置进行样品采集，方法有所不同。此外，对于特殊类型烟草制品（如含高糖分的调味烟草），样品前处理条件可能需要适当优化调整。5标准的影响与意义5.1推动国际烟草检测方法标准化ISO21766:2021作为国际首个烟草制品中TSNAs检测的LC-MS/MS方法标准，统一了全球范围内烟草制品TSNAs的检测技术路线和方法要求，有力地推动了该领域检测技术的规范化、标准化发展。标准的发布促进了不同国家和地区实验室之间检测结果的可比性和互认性，为国际烟草贸易中的质量评价和技术仲裁提供了统一的技术依据。5.2支撑全球烟草控制与公共卫生政策该标准为世界卫生组织《烟草控制框架公约》的实施提供了关键技术支撑。各国可以依据该标准建立本国烟草制品TSNAs监测体系，为制定烟草制品有害成分限量标准和管理政策提供科学数据。标准有助于提高全球烟草制品有害成分信息披露的透明度和可比性，促进烟草减害化技术的研发和应用，对降低吸烟相关的疾病负担和死亡风险具有重要意义。5.3促进烟草行业技术进步与产业升级该标准的发布为烟草行业提供了先进的分析技术平台，推动了高灵敏度检测设备和方法在行业内的推广和普及，促进了烟草企业产品质量控制水平的提升。同时，标准对TSNAs含量的准确测定为低害烟草制品的研究开发提供了可靠的技术评价手段，对引导烟草行业朝着低危害方向发展发挥了积极作用。标准对烟叶种植、调制和加工等环节的TSNAs控制也提出了更高的技术要求，有力推动了烟草全产业链的质量提升。6结论与展望ISO21766:2021《烟草和烟草制品烟草制品中烟草专用亚硝胺的测定LC-MS/MS法》作为烟草制品TSNAs检测领域首项国际标准，凝聚了国际标准化组织ISO/TC126及各成员国的集体智慧和技术成果，填补了该领域国际标准化的空白。标准的发布为全球烟草有害成分监测提供了科学、统一、可靠的技术方法，对保障烟草制品质量安全、促进国际技术协调和推动烟草控制事业发挥了重要作用。中国作为ISO/TC126的积极成员和该标准研制的重要参与者，通过参与国际合作和标准制定，充分展示了我国在烟草检测技术领域的实力和水平。中国国家烟草质量监督检验中心等单位在未来应继续深入参与国际标准制修订工作，推动我国烟草标准化工作与国际标准体系深度融合，为全球烟草标准化事业贡献中国智慧和中国方案。随着分析技术的不断进步和烟草产品形态的持续创新，建议未来在以下方向推进标准的持续改进和修订工作：一是探索新型前处理技术（如QuEChERS方法、在线固相萃取等）在TSNAs检测中的应用，进一步简化操作流程、提高分析效率；二是拓展方法对更多种TSNAs组分（如N-亚硝基可替宁等新型TSNAs）的适测范围，完善烟草有害成分检测谱系；三是结合主流烟气中TSNAs的测定需求，推动构建覆盖烟草制品和烟气全基质