蛋白纯化经验指南

蛋白纯化经验指南

生物谷整理

原创：Chromatography,

推荐书籍：《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、

《酶制剂工业》

1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，

之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。

请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破

碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率

只有50〜60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后

目的蛋白会沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较

强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，

此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就

可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5舟的PEG5000,这样的情况

下甯白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失

去活性你可以监测•下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决

你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉

淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。

2）请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？

亲和的填料合成过20来种，你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FUN可偶联

的有限，倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅陋，你是不是考

虑把FAD连上去.当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化

的填料上,而澳化银活化或别的活化的介质都不大好，因此我觉得这个没有什么

问题.

此外如果是以F.MN为辅酶的，那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的

配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你

就不需要合成填料了，有现成的.

我已经给你发了相关一些偶联的材料，请杳收，现在一般要自己合成亲和填料，

有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有浸化鼠琼

脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，峻基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖

凝胶，以及疏基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作

为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选

择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。

不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清

楚就可以选择合适的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择坏氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基筑基羟基

都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基

团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。

包涵体的蛋臼复性做得不多，但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的

方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用，常

用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出

来未必就是方法不行,关键要经常改变条件.

层析复性很时髦，但是真正能用的不很多，我觉得蛋白这东西难就在于大多都不

相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。

3）SephadexG-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，

一般对盐浓度限度如何？

大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自

然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，

但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样

品，我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。

4）我的蛋白17kd左右，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，

现在我用聚乙二醇修饰它，分子量增加5000左右，修饰率不可能达到100%,

请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（当然修饰后还

残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）

他们大多用凝胶过滤，我觉得这也不错的做法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子

上和普通蛋白行为不一样，修饰度越高那么山峰也越后，因此你的蛋白选择sep

hadexG50试试，它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏

水性的链，修饰后的蛋白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个原

理分离。离子交换也可以选择，因为同样道理，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，

电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理，你可以

试试，你于义的亲和能不能分开，你在这儿个方法里选择看哪个更经济好用就可

以。

5）我是个新手，谢谢楼主给我解决了许多难题。

我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用常规的方法（超声波破壁，缓冲

液提取），总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏岁水性较强，需要加

助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？

其实这个问题我觉得是这样的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目标

蛋白的分子量你是应该知道的，那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里，剩

下的问题你再解决如何提取。

对于不同的酶要看酶稳定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个防

用水就是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，设计个方案，这样才能

解决问题，所以不一定加甘油就管用，你还得注意破碎本身会不会有问题，倒回

去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。

6）IIPLC是用来分析检测or分离纯化？

如果可以用来纯化，上样量那么小有什么意义呢？

如果是用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？

HPLC既可以做分析也可以做制备，纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得

到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这

些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以

也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.

分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸

好了分析的条件也就相应有了制备的条件。

7）利用蔬水性质，用反向HPLC方法分离的原理？（包括洗脱液的选择和谁先

被洗脱下来等），请chromatography兄详细点。

反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，

洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱,反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱,

选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。

疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%左右，其他的都是亲水的,而反相正好

相反,它的表面全是疏水基团，因此疏水一般需要高盐吸附，低盐洗脱,反相一般

用甲醇水乙睛水吸附，洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.也于以上的原因，疏水比反

相要温和，蛋白一般不变性，由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反

相适合做分析多，也为做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率

也低，因为硅胶杂吸附的原因.

疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.

8）求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4对二硫键，诱导表达后以包

涵体形式存在，请问，我怎么设计我的纯化步骤？我用过离子交换柱，纯度可以

达到60%,但是不知道下边该怎么做？望赐教！

这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带，我需要复性，这

是一段杀菌蛋白，我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3c的载体，BL21表达

你好，我做更性不多，你可以依据有关有多对4对二硫健的蛋白复性的原理看这

方面的文献，我看一般有天少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的，还有用分子

伴侣，你可以多看看再尝试：）

至于纯化，如果你的蛋白有游离的筑基，那我觉得很时候用以前的共价层析，专

门对于疏基进行纯化,那填料叫基-7105-00ThiopropylSepharose6B不知道

现在还有没有这个填料，你可以问pHarmacia公司的人。你p'l给我，我可以把

这个材料发给你，如果没有，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，

你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，

我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可

以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到

很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。

这样省事点。

9）我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性结合的蛋白（67

kda）,用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢

对于小分子的配基我觉得需要有一定的亲和手臂，否则由于位阻很难有很好的分

离效果，说到活化填料的选择我多说几句，大多人都会选择浪化锹，但是这样做

的介质一般杂吸附多，此外没有亲和手臂，所以对「小分子的配基有时候纯化效

果不好，此外本身对介质也没有交联作用，所以刚性也差，如果经常用极端pH

洗脱配基脱落也多，这是它的一些缺点。

环氧活化的琼脂糖凝胶可以有很多的手臂选择，刚性也好，没有非特异吸附，形

成的键比别的活化方法更稳定，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选择这

样的方法，偶联很简单，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你

参考。

10）我目前作的一个蛋白药物的分子量大约是7000,等电点4,目前要去除内

毒素有何简单可行的方法？（此蛋白已经纯化好，但检验内毒素不过关）

你用过分子筛吗？supcrdcxG75对你这种蛋白比较合适。做之前请先用IMNaOH

Iml/min平衡2小时。这种方法除内毒素，非常有效。

如果问题请与我联系。，我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品

中震荡40小时左右,就可以,可以做到＜10EU/mg

11）请问HPLC是在蛋白复性后做比较好，还是在HPLC之后再来复性？？？

复性做得不多,柱上的复性更少，但是就感觉而言还是尽量在柱后复性,因为这样

好放大,而且容易操作,对于HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包括很高的

变性剂对机器也不好，也可能因为流速慢而结晶堵住管道等，很复杂，虽然有一些

这样的例上但是我觉得真正操作还是麻烦，何况这样做的量也不大.所以还是选

择纯化后复性吧.

12）我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么结合缓冲液和

洗脱缓冲液好？

我现在拟的是：

BindingBuffer:

20mMTris,IMNaCl,pH8.0

ElutionBuffer:

50mM柠檬酸，pH3.0

应该没有问题，如果挂得不好，你可以把BindingBuffe二中的IMNaCl去掉，不知

道你用什么活化的载体,如果是CNBr,那就得加，但是我们发现有时候盐也可以

洗脱下来东西，你试试再说吧.

洗脱你可以用pH5.04.03都试试，如果在高一点就可以洗下来,没有必要用太

低的，怕对活性有影响

13）这段在用离子交换柱纯化蛋白，我想问一下，洗说采用的离子强度的大小

范围，应该如何确定，可以根据什么来调整洗脱时的凄子强度

一般采用的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，怎么确定得配合你的洗脱的峰的电

泳结果来确定，最直接的就是你的目标蛋白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐

浓度（离子强度）就不用太大，如果出来的很晚或一直没有出来，那就选择更高

的盐浓度。

当然你也可以选择用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离效果其实也不错,

虽然摸索要麻烦点，但是重现性好，也一样可以做得很纯，血旦能很精确知道在

多少浓度下洗脱出来。我比较喜欢用这种洗脱方法

14）你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教，我的蛋白是2KD,在做

非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44乐

余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时•，只出现两个峰，第一主峰

占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%,出峰时间为

3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有

二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5um,300

埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙睛，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。

我觉得蛋臼的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在

反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或

者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋

白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。

我觉得测定聚合体还是用高•效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反

相你可以查查文献有没有这么检测的。

目前检测proteinaggregation的方法主要有四种。

logelfiltration.根据专门的mark,可以推断大致的聚合物的分子量，不过

实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。

2onativegol.大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果熨在不能让人信服。

通常要与其他结果配合说明问题。

3oDynamiclightscattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的

条件。但是对于浓度有限制。

4o超高速离心。

文献中多见1,3联用，3explainsthestatusofprotein,and2explain

thestatusofconcentration-dependentaggregation.

有时也见过1,2联用的，不过仅用于说明次要问题。

15）请教阁下：我想把种配法连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但

是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎

看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。

完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会

影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不

用担心，你的配基稳定的话你可以用0.IMNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联

24小时就可以。

16）最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一

次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过

夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，

没有加BSA,第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，

根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h,而且分辨率很高，但后来两次，

线性流速最快的时候也只有17cm/h,分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？

（我们用的玻璃管都是一样的型号）

这都很止常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行小行，

此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会

使结构破坏的，你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.

至于流速你的样品会不会比较粘，你柱压高不高，如果柱压高,那填料变形压缩，

那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,

因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.

17）我们用18反向柱纯化蛋白，用的流动向是设三氟乙酸，乙情，不知道

这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。

反相一般都是做分析的多，除非你的蛋白很稳定，否则不大适合做纯化,因此在有

机溶剂中都有变性的可能，一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了，

当然这也很蛋白本身关系很大，如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温

和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你

的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好，纯化过程一定要快

这样也降低变性的可能.

18）我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50%硫酸铉沉淀，然后上HiTra

pdesalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并收

集峰，最后进行透析。第二次纯化时，是直接将腹水上脱盐柱，没有经过硫酸铁

沉淀，结果两次纯化结果，第二次所的蛋白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体

我主要是用来做胶体金标记，请问两种纯化过程，对抗体的纯度会有什么影响，

是否会对标记效果产生差别？

腹水中应该有•些脂溶性物质以及•些别的杂质，沉淀后应该更干净点,直接过

柱子要注意清洗,至于这两个方法具体效果如何,你可以跑电泳检测，同时也可以

做抗体的活性检测，如果没有什么差别,那当然是回收率越高越好.具体怎么样

只有检测后才知道.

19）用HPLC分析得到的结果对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗？

我觉得有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的分布以及别的信息，而如

果是反相可以知道哪个蛋白的疏水性强，用离子交换的柱子可以知道电荷的不同,

总之了解的信息越多对纯化越有用，所以说都是有意义的，只是很少有先做HPLC

后做纯化的，大多先纯化后用HPLC分析.

20）离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？

没有问题,是盐都可以，只是小心钙离子容易和磷酸盐产生沉淀，你可以用别的缓

冲液就没有问题.

21）我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH多少为好？

目的蛋白是2KD。

别客气，其实高效凝胶柱干一般用TSK系列的最多，你可以看看有没有分离范围

窄点的柱子，只怕难有分离范围这么小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实

按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合适，你也可以直接用C18的试试试，

凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。

补充一卜，由于分子量小，可以用小来估计disulfidebond是否形成。形成一

个，分子量减少2（失去两个proton）。

至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，蛋白复性，成功的可能随纯度的

提高而提高

因为HPLC用的填料一般是5-lOum的,而通常用的填料至少也在35um以上，分离

效果差别还是很大的，如果要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般

的泵和系统,包括柱子根本承受不了那么大的压力,此外普通的层析系统的泵的

精度管道等都很难保证有很高的分离效果,但是你可以把HPLC的条件直接用普

通的填料来放大制备，例如你摸好/HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料，

如果它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只

要你HPLC的条件很好,那就可以,但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,

它也没有相应的填料.

22）你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨

率,具体何解？

我觉得是这样的：凝胶过滤的原理是小分子能进入的孔到多于大分子的，但是如

果有多糖或核酸的干扰（很粘），这样一些小分子也不能进入更多的孔（和没有

干扰的相比），这样自然分离效果不如没有干扰的。这是其一。

其二是由于这些东西粘度大，那么同样流速下，由于sephadexG-75压力比平常

的大，所以胶会压缩变形，这样它的内孔和没有干扰的排阻极限也不同，所以分

离效果自然比没有干扰要差。特别是压缩会使孔变得不均匀。

当然相对而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。

其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物质（还有一些脂溶性的物质）也会一样

干扰传质，因此影响分离效果。所以这两个东西一般要小心，同时它还会降低柱

子的寿命。

23）我的目的蛋白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我

先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（20rnMPB

ph=7.00）,发现目的蛋白根本挂不上.我想试用硫酸傕分级沉淀除去部分杂蛋

臼，再过s-100.但不知硫酸镂分级沉淀该如何具体操作？

你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，

杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadexG50那么大于30kd的很快就出

来，或者上superdex30大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离

子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝

胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测

定样品的电导看看。

硫酸筱分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铉去沉淀蛋

白，你可以直接在液体里加固体的硫酸核就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清

继续加硫酸筱，再离心，上清再加硫酸镂，你可以设计你的实验，然后用电泳检

测或者活性检测沉淀的效果。

24）如果怀疑是多糖造成的黏度过大，请问应该如何去处多糖？

多糖去除你可以用硫酸核分级沉淀，也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也

不带电荷,你可以用离子交换挂住你的蛋白，这样也是可以的

25）问一个有关DEAESephadexA50的问题，我的填料处理好后别人拿去用

了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以

再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？

这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你

可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不

干净的东西，你可以用6M盐酸呱泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，

这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料

很容易长菌，用完得洗干净，保存在20灿勺乙醇中。

26）我想在想纯化peg修饰的蛋白，可是我目前只有弱阳离子交换的粉甲基纤

维素，你看能不能纯化阿，好像文献上都用sp-sepharose,纤维素是不是不行

啊？另外，目前没有专门的层析装置和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以

阿，流量是不是也不用太精确阿？谢谢！

离子交换的方法是可以的，但是我觉得疏水也很值得一做，因为修饰后电荷变化

了，其实疏水性也增加了，所以这些方法都可以，此外只要你的CM纤维素能挂

住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，而且流速更好点，你先试试，不

行再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量肯定不精确，我觉得还是有

个泵好点，没有检测器也不行，这些是纯化的基础，要不可是比较麻烦的，怕实

验难重复。何况你没有泵也没有办法做线性剃度洗脱。反正是太简单点。

27）问一个有关DEAESephadexA50的问题，我的填料处理好后别人拿去用

了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以

再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？

这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你

可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不

干净的东西，你可以用6V盐酸脏泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，

这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料

很容易长菌，用完得洗干净，保存在20灿勺乙醇中。

28）首先我想问一下agarose和sepharose区别，我的理解是：都指琼脂糖，但a

garose是未连接其他介质的，而sepharose是连接其他介质的，不知理解对不对？

请指教！Glutathione-agarose（4%crossTinkedbeadedagarose）和Glutathio

neSepharose4B是一种东西吗？

其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白（某种酶和

GST融合），我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升，但我不知怎么做.

分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心我不知我买的可不可以

这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1亳升的柱子怎么做,装介质的柱子的

高度和直径有要求吗？

agarose是通常的琼脂糖的英文名祢，大家都这么叫，它不是商品的注册名称。

而sephcirose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你理解是有偏差

的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose（4%crossTin

kedbeadedagarose）和GlutathioneSepharose4B是同一类东西，只是厂家不

同。

GST融合蛋白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分

子克隆的做法做，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，

对于直径和高度没有特别的要求，我们的做法是：

1、GST琼脂糖凝胶FF装柱,0.7X2.5cm,柱床体积为1ml；

2、用缓冲液1平衡5个床体积，流速为Iml/min；

3、将10nli发酵液用缓冲液1稀释到20ml,0.45un滤膜过滤，上样。流速

为Iml/min；

4、用缓冲液1再洗10个床体积，流速为Iml/min；

5、用缓冲液2洗脱，流速为Ind/min,收集洗脱峰

6、用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为lml/m

in,柱子置于+4~8c环境中保存

缓冲液组成：

缓冲液1：20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2MN

aH2P0419ml,0.2MNa2IIP0481ml加水至1000ml

缓冲液2：50mMTris-盐酸缓冲液,pH8.0,配制：0.IMTris50ml,0.1M盐

酸29.2nd,307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。

29）请问conAsepharose4B亲和凝胶使用前的处理方法？

不需要特别处理，直接平衡后就可以上样了。

30）谢谢，我想问•下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？还是

阶段洗脱好？检测器我想先收集然后再去测紫外。

也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好，而且容易放大，不需要仪器,我比较喜欢，

效果差不多，但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以，我上学

也那样做过.

31）我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western,由于量少所以要做免

疫沉淀。我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、proteinA-sepharose

来做免疫沉淀，发现做完后跑电泳，出现了两条带，分别位于85KD、55KD左右，

请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有没有可能是目标蛋白变小了？

抱歉,我没有做过免疫沉淀，但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步，

所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,

这样分子量正好和你的250KD相当，你可以跑非还原电泳看看，是不是还这样呢.

如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的.

32）我提胰蛋白随，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘蛋白，首先过

SEPHADEXG-25柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱：第二步是用卵类粘

蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的

叠氮化钠抑菌吗？以后怎样去除？

我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度

多大为好？

那实验我知道，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法很多，配基

有大豆胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶，苯甲眯类，特别是后面的苯甲眯，可以买到现

成的苯甲眯琼脂糖凝胶，何必自己去提取呢，感觉比较复杂，自己偶联这些配基

也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除

盐柱子都可以，或者直接上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，最后洗脱

下来就可以了。

最好还是用乙醇，浓度很难说，因为和你的蛋白浓度有关，别的醇用得很少。此

外你可以考虑用硫酸铉沉淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在

苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，配合硫酸镂沉淀也是不错的选择。

33）楼主,我想问一下phenyl-sepharoseCL-4B有没有浓缩作用，以前有人做

过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓

度较高的蛋白，又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱

子的选择上有什么要求，使洗脱下来的蛋白浓度会较高，

亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓

缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先

用离子交换柱子拄住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以

不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗

脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，

离子交换是最常用的。上点样

34）我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化

铝物理吸附，使用含有1.7mol/L（即200g/L）硫酸镂的pk7.5,0.05mol/L的磷酸缓

冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharoseCL-4B脱盐和浓缩，可是效果很差，

基本是起不到浓缩的作用.

我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用，我现在却做不

出来，也联系不上以前做过的人.

phenyl-sepharoseCL-4B使疏水层析，我现在就这种柱子,我想问的是装填料的

时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的，洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰

值高一些,谢谢

这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶

上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好，你想

浓缩效果好，你可以把硫酸较的浓度提高到2.5M再挂在柱子上，直接用ph7.5,0.

05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子，也

就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐

浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.

35）楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的

特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，

抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的

蛋白虽然有一点差别，但是那也不是很明显的，其实就用280就可以了.

36）我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在EColi中，分子量1415kDa,蛋

白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，

据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检

测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST胶。开始时采用先洗脱融

合蛋白，再酶切，洗脱采用GSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，

就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性

剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅

有一个cyso

我的问题是：

1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋臼的结构的。不过人家的蛋白是合

成出来的，然后用反相CIS（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为b

inding效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，

沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋

白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离

或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。

2、过去曾做过superdex20010/300分离酣切产物时，由于目的蛋白聚集，我也

没有marker,每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相

有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？

3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理

条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存

在，如果加入50%TFE（三氟乙醇,trifluorethanol）,则可使其在中性pH下恢

复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做

有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg,PEG

之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。

现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！

4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流

速改观也不明显，后来结告的时候bindingbufTer中也加表面活性剂稍微好

点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我

怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型

表面活性剂,binding时在加入tritonX-100,采用混合表面活性剂,据说可以

使GST部分复性，增加binding,我还没有试过。

您有这方面的经验么？多谢了

1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是

国产的GST融合蛋白的纯化系统，价格就不贵，你PV你的邮件给我,我给你一份材

料，反相柱子其实做不了多少东西，所以建议你别用它制备.

2.只要你有标准蛋白，那用HPLC做分析代替电泳是很不错的，因为这样时间缩短

了，效率更高，而且定量很准确.

3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为（环境极性大）疏水相

互作用太强和聚集，至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.

4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样，

那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表直活性剂看看,这个不做怕

是不知道的，因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.

37）色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有粉甲基纤维

素,sp-sepharose等,但是祛码西亚的sp-sepharose太贵了,450/25m1。你能

推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！

维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给

你相关的材料.

38）一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？

二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问

可能是什么原因有什么办法解决

还真没有做过，你可以用电洗脱的方法，然后浓缩可以用离子交换不就行了或者

透析袋加PEG8000浓缩，只怕这样会变性了.

你丽切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长睡切时间，.此外看有pH有没有问题,

你的蛋白浓度是不是太低.

39）我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔

径。谢谢！

完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小

分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋

白也没有问题，包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.

40）谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘

肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP—Sepharose4B纯化，以后你多留意点，

别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可

以用来纯化谷胱甘肽还原酷吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完

全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.

41）我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲豚琼脂糖凝胶？G

00GLE搜不到。我们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析

以防长菌和防酶降解，可以吗？

环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲眯琼脂糖凝胶的材料，

你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需

要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇:，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。

42）查尔酮合成酹的酹活耍用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要

送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography有没有人做过的，

有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有

没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。

这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力，你完全可以自己合成一些亲

和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质，效果不错,我觉

得你可以用亲和的办法，即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和

芳香环有很特异亲和力.

你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.

43）请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，

但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！

那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好

了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况卜.缓慢加冷丙酮，避免局部

浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。

44）三氟乙醉我的看法是降低了极性，这样你的蛋白不会因为（环境极性大）疏

水相互作用太强和聚集，至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.

关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。

ioTFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由

于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，

使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。

2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入

TFE的作用,使之变成a-helix。

具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁

对！二

45）我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题

想请教：

1：我的目的蛋白在强阴离子柱上结合（buffer:25niM磷酸盐PH7.4）,但是

似乎结合力很弱（因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值

刚开始升高时就开始出现了），我换用了20nlMTrisPH8.2buffer之后，蛋白

的结合力好像还是很弱，洗脱峰没多大改变.请问我用PH8.5Trisbuffer会

改善我的问题么？

2:出于目的蛋白丰度低易失活，而且实验室浓缩的条件有限，我过了脱盐柱和粒

子柱后样品蛋白含量低体积大，我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么？会很

大的影响我的分辨率么？我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗

出来,我该怎样优化一下？

3:我有亲和胶（redA）,但是由于经济上的原因不能用守异的含配体的溶液洗脱,

只好用高盐的洗脱液（含2MKC1）,这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗

脱么？（因为我没有空柱,上不了机器，只能用手工做,这样做梯度很是麻烦）

4:天然的肝脏匀浆梯度离心后，在PH7.4的磷酸盐平衡液下，为什么绝大部分

（95%以上）蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么？

谢谢你的指导！！

1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子，同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果

还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用，但是有的蛋白吸附力弱,所以

盐一高挂不住，因此要降低到5-10mM也许能更好点.

2.大体积直接上疏水没有问题，既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-

1M盐洗去杂质，然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差，

而且这样洗脱的体积小,容易放大.

3.你说的RedA是procicnredHE-3B吗,是染料亲和吗，既然这个填料可以，那

么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和，这个应该更便宜点，洗脱用盐没

有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱，你可以用阶段洗

脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度，只要你多

摸索，你会找到个合适的浓度，效果一样很好,没有问题.

4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同

时还一个缓冲体系,我觉得主要在川,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.

46）1.我正是用的Q柱出现的上述问题，

2.redA确实是一种染料亲和，

3.我说的挂不上是在souce30S和streamlinesp上样的体积

4.你用akta的设备么？我用purifier100，发现电导值总是稍迟于开始的梯度.

1,那你按我提议试试吧，降低缓冲液浓度,提高pH值.

2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都

是颜料，结构也相似.

3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.

4.AKTA就是那样的，因为梯度是从一开始就算，而电导至少要近一个柱床体积才

有变化，所以稍迟.

47）你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很

小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadexG50那么大于30kd的很快

就出来，或者上superdex30大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再

用离子交换试试，S700分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外

你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，

你测定样品的电导看看。

硫酸镂分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸镂去沉淀蛋

白，你可以直接在液体里加固体的硫酸筱就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清

继续加硫酸镀，再离心，上清再加硫酸筱，你可以设“你的实验，然后用电泳检

测或者活性检测沉淀的效果。

多谢你的回复，但是我把缓冲液PH调到5.6,我的目的蛋白仍挂不上SP柱（我

是一个新手，正在做蛋白纯化.我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=6KD,理论

等电点为9.45.,无lag.我先用ST00除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子

交换柱SP分离（2OmMPBph=7.00）,发现目的蛋白根本挂不上.），是不是

理论IP与实际有相差？

48）有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性，那这样的可能性

很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你

的酶稳定吗.

我的酶还算比较稳定，4c下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，一2

0C时间就更长了。

49）问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然

后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，

很多人都这样说，所以科宫里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯

蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。

50）多谢你的回复，但是我把缓冲液PH调到5.6,我的目的蛋白仍挂不上SP

柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化.我的FI的蛋白是以可溶形式表达，MW=6K

D,理论等电点为9.45.,无lag.我先用ST00除去了部分杂蛋白，但接着再用

阳离子交换柱SP分离（20mMPBph=7.00）,发现目的蛋白根本挂不上.），

是不是理论IP与实际有相差？

理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有

盐也会挂不住的。

51）我的脑还算比较稳定，4c下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变,

-20C时间就更长了。

我分别用了0.5M,1M的XaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个

管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有441TU/10

u1,而收集管里的顶多只有20IU/50u1o

所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液

洗脱下来的收集液，发现酶活居然有100IU/50u1,我想是不是初始缓冲

液的离子强度就太高了呢，0.011M柠檬酸一氢氧化钠，PH5.5?然后就

用的是手工步进式洗脱，0.05M,0.1M,0.15M,0.2M,0.2

5MNaCl,直到后来的0.5M,1M.

另外，我还想请教您：

阳离子层析柱用完后如何保存？先用1"氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓

冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否有荐一下？硫柳汞我这里

包装大，25g,又不能分装，需要避光保存，先谢冻了！

那用更高点的盐洗脱看看，例如I2M,如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子

上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不

是没有挂住呢。

保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳

汞。

52）问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然

后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，

很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯

蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。

纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核

就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，

具体很难说，得看你的目标蛋白而定。

53）你好，我想请教一卜，我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏

水柱.疏水上柱要求硫酸核的浓度在1.75M以上，但是高浓度的硫酸筱在6M的盐

酸服中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿

素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下，上样的浓

度有要求么？不知道你有什么好的建议呢,谢谢.

要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐

酸胭了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.具体情

况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特

别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。

54）不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。

另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维

索时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维索时要选用高于pK值的缓冲

液。”是什么意思，谢谢：

所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,PK值用

于表示酸碱性的强弱，阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小

于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品，否则就挂不上样品.而

阳离子是需要缓冲液川高于pK值，这样它才能解离带负电荷，用于吸附带正电荷

的样品.否则也拄不住.

55）我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带,

特别是最近的•条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您

有什么高见，谢谢。

这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题

56）向您请教•个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21（DE3）表达目的蛋白，

目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD,在利用Ni-NTA纯化时总是在

目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？！！！

此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！”

也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB

看看是不是这样的，如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加

0.5%的吐温等表面活性剂，这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左

右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质，最后在用咪唾溶液洗脱.如果你这样

都去不掉，而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大，

时间也别太长,注意温度，因为超声有时候也可能会使蛋白降解.

57）我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带,

特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您

有什么高见，谢谢。

你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MXaCl,这样可以降低一些因为离

子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不

是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5砌和10m.M还原谷胱甘肽

去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注

意功率和时间.避免过强时间过长，降解蛋白.

此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西，会不会是降解或造成这

样的结果。你可以加点酶的抑制剂，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。

58）我准备用30%—60%硫酸镂沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱。

但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高

啊？

30%—60%硫酸镂沉淀可能对你的目的蛋白来讲，太粗略了，如你所言，目的蛋

白可能在沉淀中，可否分级沉淀，30%—50%,50%—60%,再测一下

活性可能就分开了，20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或

PH的改变都会使蛋白有损失，最好不要超过1Omg/ml。

59）我的蛋白是用PGEX-4T载体在BL21中表达的，表达量很高，形成包涵体，

为了获得可溶性蛋白，我现在尝试用较低浓度的诱导剂诱导，此前用不同浓度诱

导做过对比，电泳后表达量的差异不大；但当我再降低温度诱导后发现，超声处

理后的上清液中LI的蛋白条带很微弱，大部分目的蛋白还是在沉淀中；这和我降

低诱导剂前做的不一样（同温度），为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢？对

同一菌种应该是固定的吧？我很迷惑.

另外，请问，一般情况下28度，30度诱导时间应该分别多少才合适？我们的

光度计出了点问题，无法测定CD值.谢谢.

还有，你有没有较好的蛋白纯化的文献介绍几篇，好吗？

60）chromatography兄，请教一个问题：

选择填料的时候，CM和SP怎么选择？什么时候选择弱阳？什么时候选择强阳？

再问一个：

我们实验室有两种蛋白，一种等电点5左右，另一种等电点9左右，为什么都可

以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液都呈中性）

等电点5的那个我觉得选择阴离子交换柱好些，为什么不这样？

没有什么特别的原则，重要是纯化的效果好就可以，一般都是先选择弱的.

纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以，所以其实在这样的情况下，酸性蛋白是拄

在阴离子柱上，而后面的挂不住，但是只要能把它们和杂质分开就可以.所以酸

性蛋白流穿，杂质被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以.

61）我准备用30%—60%硫酸镂沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱。

但发现活性大部分还在沉淀中。测了一下蛋白浓度是2Dmg/ml。是不是浓度太高

啊？

也不是，其实沉淀你可以做仔细点，例如先用30%沉淀，取上清，再把上清加

到40%,然后如此类推，一直到60%,然后测定沉淀和最后上清的活性，这

样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在

一定浓度的盐中，直接过滤上柱子就可以，浓度高也没有关系.

62）急问：我的样品蛋白液本来放在4c保存，谁知有人把温度调到了18C

已有一天，请问这样对蛋白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这

样的温度卜性质会有所改变吗？某人说4c-30C的情况卜，树脂不会有太大

改变。是这样么？谢谢！

不知道你的蛋白稳定不稳定，你可以测定一下活性看看，如果没有什么变化，那

就没有关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是好的树脂不是以蛋白为配

基的亲和填料.，没错在4c—30C的情况下是没有多少改变，但是那也看多

长时间，什么树脂，因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的话.

63）我用鼎国的sepharose4-B合成亲和柱可以吗？

是活化好的吗，还是普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知道你选择

的粒径是多少范围的，最好要细一些，45-1651nli比较好，用一般应该没

有问题.

64）比如说，sephadexG-25的分级范围是1000~5000,我想问一下，分子量

小于1000的分子（例如盐）是怎么样通过的？它是从凝胶内部通过吗？不是说

只有1000〜5000大小的分子从凝胶内部通过吗？

凝胶的中间有的是大小不同的