T∕NXSLX 0103-2025 山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光 定量 PCR 检测技术规程

ICS11.220CCSB41NXSLXRegulationofpracticefordetectionofMycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniaebyquantitativereal2025-11-17发布T/NXSLX0103—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提出。本文件由宁夏饲料工业协会归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司。本文件主要起草人：吴亚文、邸静、安玲玲、尹才、白涛涛、罗龙龙、任子昱、蔡冬冬、吴绿怡、周爽、王晓亮、李知新、周海宁、王建东、郭亚男、张成莲、马龙、马彦龙、赵燕、马金昕。1T/NXSLX0103—2025山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光定量PCR检测技术规程本文件规定了山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）实时荧光定量PCR检测时的仪器设备、样品采集、保存和运输、实时荧光定量PCR操作程序、结果判定、注意事项。本文件适用于山羊的鼻拭子、肺脏和胸水等样品中Mccp核酸的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T34720山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1山羊支原体山羊肺炎亚种Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniae，Mccp山羊支原体山羊肺炎亚种是引起山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）的病原体，属于支原体科支原体属，无细胞壁、能通过细菌滤器的革兰氏阴性微生物。4仪器设备4.1荧光聚合酶链式反应检测仪（PCR仪）。4.2Ⅱ级生物安全柜。4.3台式冷冻离心机（可控温至4℃、离心速度可达13000r/min以上）。4.4冰箱（2℃~8℃、-20℃和-70℃)。配的带滤芯吸头。4.6高压灭菌锅。4.7耗材。4.7.11.5mL和5mL离心管。4.7.20.2mLPCR薄壁管或八联管。4.7.35mL样品保存管。5试剂5.1除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水。5.2DNA提取试剂盒。5.3Mccp引物荧光探针引物和序列（参见附录A）。5.4荧光PCR酶。反应液含有Taq聚合酶和反应缓冲液配制（参见附录B）。5.5阳性对照。灭活的Mccp-14020培养物，经GB/T34720规定的PCR方法和细菌基因组三代测序验证为Mccp病原。2T/NXSLX0103—20255.6阴性对照。用无菌无核酶水作为阴性对照。6样品的采集、保存和运输6.1样品的采集样品的采集按照NY/T541的规定执行。取发病山羊的鼻拭子、肺脏和胸水等样品。6.2样品的保存采集的样品无法在12h内送检的情况下，应根据不同的检测要求，将样品按所需温度分类保存于冰箱、冰柜中。6.3样品的运输采集的样品应以最快最直接的途径送往实验室，对于可在采集后24h内送达实验室的样品，可放在2℃~8℃的容器中冷藏运输；对于不能在24h内送达实验室但不影响检验结果的样品，应以冷冻状态运送。6.4样品的处理在样本制备区进行。样品处理方法按照GB/T34720规定执行，处理过程中的生物安全要求和措施，按照GB19489进行，涉及到的基因扩增和分区要求的按照GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求规定执行。肺脏组织样品处理方法，取50mg，放入盛有500μL灭菌水的无菌无酶研磨管中，6000r/min振荡研磨45s，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min；弃上清收集沉淀，提取核酸。液体样品胸水用灭菌水1:1稀释后，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min后，弃上清收集沉淀，提取核酸。拭子样品处理方法鼻拭子制于1mL灭菌水中，充分捻动，挤干后弃去拭子，3000r/min离心10min，取上清液经13000r/min离心20min后，弃上清收集沉淀，提取核酸。7荧光PCR操作程序7.1样品DNA提取在核酸提取区进行。可用商品化的DNA提取试剂盒提取样品的DNA。提取的DNA应立即进行荧光PCR扩增，如不能立即检测，4℃保存不宜超过8h，长期保存应制-70℃。7.2反应体系的配制反应配制应在专门的区域进行。采用25μL反应体系，扩增体系配制如下：样品DNA或对照5μL7.3荧光PCR反应在检测区进行。在荧光PCR仪上选用FAM通道，设置如下反应参数：37℃孵育2min；95℃预变性20s；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共40个循环；设置60℃收集FAM荧光信号。8结果判定8.1阈值设定3T/NXSLX0103—2025阈值设定原则根据不同的荧光PCR仪的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。8.2质量控制FAM信号通道下，阳性对照应出现典型的扩增曲线且Ct值＜30.0，阴性对照无典型的扩增曲线或无Ct值，则试验成立；否则试验不成立。8.3结果描述及判定8.3.1被检样品有特异性扩增曲线，而且Ct值≤35.0，判定为Mccp核酸阳性（参见附录C）。8.3.2被检样品扩增结果无典型的扩增曲线或无Ct值时，判定为Mccp核酸阴性。8.3.3被检样品有特异性扩增曲线，当样品的扩增结果35.0＜Ct值≤40.0时，可判定为Mccp核酸可疑；可疑样品进行1个反应复检，若样品复检有特异性扩增曲线，而且Ct值≤40.0时，判定为Mccp核酸阳性；若样品复检结果无典型的扩增曲线或无Ct值时，判定为Mccp核酸阴性。9注意事项本方法样品处理过程中使用的耗材和器皿，应高压灭菌处理；在荧光PCR反应中使用过的枪头和PCR反应管，禁止高温高压处理，应用2%的84消毒液浸泡30min后，再作为医疗废弃物处理。4T/NXSLX0103—2025（规范性）引物和探针序列A.1引物和探针序列Mccp实时荧光定量PCR检测方法所用的引物探针序列见表A.1表A.1实时荧光定量PCR引物和探针序列引物名称序列报告基团5'修饰淬灭基团3'修饰Mccp/92.1/F184AGCTATTGTTCTATCCGTTTTTT--Mccp/92.1/R297GAGCACGCGTACATTTATAATAT--Mccp/92.1/P207FAACATAGTCGTTTGCACTTGFAMBHQ15T/NXSLX0103—2025（规范性）荧光PCR酶反应液组成B.1反应液组成本反应液用于一步法PCR反应，使用时需加上下游引物、探针等稀释至1×工作浓度。酶反应液含：50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），2.5mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTPmix，5U/μLExTaqHS，1URNaseInhibitor，2mmol/LDTT，5%甘油，其余为无核酶水。6T/NXSLX0103—2025（资料性）实时荧光定量PCR扩增曲