CN119464205A 干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞及其制备方法和应用 （北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院））

干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞本发明公开了一种干细胞来源的功能增强人多能干细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，采用包括Wnt通路激动剂和ALK5抑制剂的神经嵴细胞分化培养基对CD47阳性的人多能干细胞进行诱导分化培养，得到神经嵴细长因子2和细胞凋亡抑制剂的过渡培养基和包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2和血小板生长因子的间充质基质细胞分化培养基对神经细胞高表达CD47和IL_10，表达CD47可以帮助移植细胞逃避免疫系统的攻击，延长细胞存活时2向所述人多能干细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，筛选后得到CD47采用神经嵴细胞分化培养基对所述CD47阳性的人多能干细胞进行诱导分化培依次采用过渡培养基和间充质基质细胞分化培养基对所述神经嵴细胞进行诱导分化2.根据权利要求1所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特3.根据权利要求1所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特述人多能干细胞中电转化包括IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列的主质粒以及用于4.根据权利要求3所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列。5.根据权利要求4所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特6.根据权利要求1~5中任意一项所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制7.根据权利要求6所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特化培养的操作为：采用过渡培养基重悬所述神经嵴细胞以使细胞密度为1x105个/cm2~2.58.根据权利要求7所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法，其特3。任意一项所述的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法10.一种干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞用于制备皮肤损伤和/或骨关节炎45们在骨关节炎治疗中可能有助于促进损伤组织的修复和再生。这包括帮助重建关节软骨、保生成的MSCs不带有不良的免疫原性或其备得到的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞以及该干细胞来源的功能增强型间充向所述人多能干细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，筛选后得到6采用神经嵴细胞分化培养基对所述CD47阳性的人多能干细胞进行诱导分化培养，依次采用过渡培养基和间充质基质细胞分化培养基对所述神经嵴细胞进行诱导[0013]在一个实施例中，向所述人多能干细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列的操作为：向所述人多能干细胞中电转化包括IL_10基因编码序列和CD47基因编码序质粒的CLYBL位点插入IL_10基因编码序列和CD47基因编7[0022]一种干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞用于制备皮肤损伤和/或骨关节炎能干细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，采用包括Wnt通路激动剂和TGF_β受体激酶抑制剂的神经嵴细胞分化培养基对所述CD47阳性的人多能干细胞进行诱导分化制剂的过渡培养基和包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2和血小板生长因子的间充8制备得到的高表达IL_10和CD47的间充质机制细胞，能够有效缓解细胞治疗过程中的免疫[0030]本发明的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法基于非动物源性为细胞治疗稳定提供更为优质的MSCs资源，同时本发明能够生产高表达IL_10和CD47的间图1为一实施方式的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法的流程[0036]图5为实施例2中分选得到的CD47阳性的人多能干细胞的IL_10ELISA检测结果9[0043]图12为测试例4中GPF_MSCs与UCSMC进行共同培养和传代后进行GFP阳性比例流式[0049]图18为对图17进行定量分析的结果图，测量数据包括骨密度（bonemineral[0052]结合图1，本发明公开了一实施方式的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞[0053]优选的，本实施方式的干细胞来源的功能增强型间充质辑在人多能干细胞中插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，从而使得最终得到的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞可以表达CD47和IL_10，CD47可以帮助移植细胞使得巨噬细胞能够识别并清除这些细胞。这样可以在移植过程中减少宿主免疫系统对移植物的排斥反应。生成和功能，Tregs是一类能够抑制免疫反应并维持免疫耐受的细胞，IL_10通过支持序列的操作为：向人多能干细胞中电转化包括IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列的质粒的CLYBL位点插入IL_10基因编码序列和CD47基因编基因修复模板，一部分的细胞在DNA自我修复过程中会将pTLL98左右同源臂以及左右同源[0089]其中，GlutaMAX为L_丙氨酰_L_谷氨酰胺溶液，Pen/Stre细胞插入IL_10基因编码序列和CD47基因编码序列，采用包括Wnt通路激动剂和TGF_β受体培养基和包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2和血小板生长因子的间充质基质细胞质基质细胞，结合具体实施例，得到的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞高表达制备得到的高表达IL_10和CD47的间充质机制细胞，能够有效缓解细胞治疗过程中的免疫[0106]本发明的干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的制备方法基于非动物源性为细胞治疗稳定提供更为优质的MSCs资源，同时本发明能够生产高表达IL_10和CD47的间[0107]本发明还公开了一实施方式的上述干细胞来源的功能增强型间充质基质细胞的[0112]具体实施例中，DMEM/F12(Gibco,C11330500BT)、AdvancedDMEM/F12(Gibco,生物,RP01020)、ncTargetSupplementB(首醇胺添加剂,Procell,PB180431_10mL)、FBS(Gibco,12664025)、GlutaMAX(Gibco,在无动物源性且化学成分确定环境下进行人多人CD47的CDS序列如SEQID将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻(DH5αCompetentCell，Vazyme#将细胞按照干细胞传代的方法培养在6孔板中，并每天换液体，三天后，用含有100μg/ml基质细胞分化培养基2可以实现NCCs分化成MSCs，间充质基质细胞分化培养基3可以实现[0203]由图9可以看出，间充质基质细胞分化培养基1能有效诱导间充质基质细胞的产[0204]结合图6和图9可以看出，FBS并非MSCs分化所必需的，也无需用BSA和ITS_X代替分别使用MesenchymalStromalCellChondrogenicDifferentiationMedium(MCDM,ScienCell,7551)、MesenchymalStromalCellOsteogenicDifferentiationMedium(MODM,ScienCell,7531)和MesenchymalStromalCellAdipogenicDifferentiationMedium(MCDM,ScienCell,7541)，按试剂使用说明书诱导MSCs分别分化[0207]对实施例3得到的MSCs进行传代和细胞计数，在六孔板中按照100万个细胞/孔密[0209]将实施例3得到的MSCs与不带荧光的脐间充质基质细胞UCMSC(来自北医三院干细[0218]利用带有luciferase荧光素酶的MSCs进行C57小鼠关节腔注射，通过小动物活体标本进行扫描。使用MimicsResearchsoftware对micro_CT图像进行三维重建。使用关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；