T-SAASS 215-2025 牛体外胚胎自动玻璃化冷冻及解冻技术规程

ICS65.020.30CCSB43SAASS程CodeofpracticeforautomaticvitrificationandwarmingofinvitroproducedbovineIT/SAASS215—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东奥克斯畜牧种业有限公司提出。本文件由山东农学会归口。本文件起草单位：山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、深圳拜尔洛克生物技术有限公司。本文件主要起草人：张燕、马庆涛、王玲玲、李彦芹、肖遥、赵秀新、舒怡玮、陈昊楠、黄金明、高运东。T/SAASS215—20251牛体外胚胎自动玻璃化冷冻及解冻技术规程本文件规定了牛体外胚胎自动玻璃化冷冻及解冻的技术流程、胚胎质量鉴定、胚胎自动玻璃化冷冻与解冻以及记录的要求，并给出了具体操作方法与步骤。本文件适用于牛体外胚胎生产中的自动玻璃化冷冻与解冻。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T25881牛胚胎GB/T26938牛体内胚胎生产与移植技术规程GB/T45202牛体外胚胎生产和移植技术规程NY/T3445畜禽养殖场档案规范3术语和定义GB/T26938界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1自动玻璃化冷冻解冻automatedembryovitrificationandwarming利用自动化设备，实现对牛胚胎等生物样本快速冷冻与解冻的自动化控制技术。3.2冷冻/解冻芯片vitrification/warmingchip一种基于微流控技术设计的、由高分子水凝胶材料制成的薄片状载体，具备微型凹槽和网状亲水性表面结构，由凝胶、芯片框架以及芯片保护膜组成。其中冷冻芯片含有平衡凝胶、冷冻保护凝胶，解冻芯片含有解冻凝胶、清洗凝胶。3.3载杆组asetofcarrier在胚胎自动玻璃化冷冻与解冻过程中的关键组件，由玻璃化冷冻载杆、一级套筒及支架构成，用于确保胚胎样本在冷冻和解冻过程中的安全性和精确性。4技术流程。牛体外胚胎自动玻璃化冷冻技术流程见图1；牛体外胚胎自动玻璃化解冻技术流程图2。T/SAASS215—20252图1胚胎冷冻操作流程图图2胚胎解冻操作流程图5胚胎发育阶段及质量鉴定胚胎发育阶段鉴定和胚胎质量分级按照GB/T25881的规定执行。6胚胎自动玻璃化冷冻6.1.1按附录A准备所需主要设备、器械与试剂。6.1.2芯片及基础液准备：预热冷冻芯片、基础液至室温。6.1.3准备胚胎冷冻所用液氮，存放胚胎的低温容器质量应符合GB/T5458规定。6.1.4预设自动玻璃化冷冻解冻仪至冷冻程序。6.2组装冷冻载杆组和基板6.2.1玻璃化冷冻载杆与基板组装示意图如图3。6.2.2参照图3准备自动玻璃化冷冻支架、基板及载杆，并在载杆上标记冷冻样本信息。6.2.3载杆缩回一级套筒，并将其与支架进行组装，形成完整的载杆组。6.2.4将载杆组与基板组装。3图3玻璃化冷冻载杆与自动玻璃化冷冻支架基板组装图6.3胚胎处理6.3.1在Φ60mm的细胞培养皿中制作4个130μL的基础液微滴，并按照1个基础液微滴对应1枚胚胎的标准，将待冷冻胚胎从培养液中转移到基础液微滴中。6.3.2在基础液微滴中对胚胎进行清洗，并计时10min。6.3.3将未放胚胎的微滴中的基础液加到载杆圆槽内。6.3.4将清洗干净的胚胎转移入圆槽内。6.3.5加基础液至载杆T字槽及T字槽后方。6.4组装冷冻芯片6.4.1冷冻芯片与基板组装示意图如图4。6.4.2从密封包装中取出复温至室温的冷冻芯片，并撕掉其表面的保护膜。6.4.3参照图4所示，按照C角在右上方的位置将芯片组装到基板上。图4冷冻芯片与基板安装位置示意图6.5运行冷冻程序46.5.1将组装好的载杆支架基板及芯片放入冷冻解冻仪的空闲通道中。6.5.2确认通道号、胚胎信息、芯片及协议匹配无误后，运行胚胎冷冻程序。6.6胚胎包装及储存6.6.1冷冻程序结束前30s，准备好临时储存液氮容器。6.6.2冷冻程序结束后，将载杆组从基板上脱离下来，并投入液氮中。6.6.3在液氮中拉下载杆的一级套筒。6.6.4将载杆组套入用于长期保存载杆的套筒中，并记录样本信息。6.6.5取出已运行完冷冻程序通道上的基板和芯片。6.6.6复位已运行完冷冻程序的通道。7胚胎自动玻璃化解冻7.1.1解冻芯片准备：预热解冻芯片至室温。7.1.2解冻用油准备：100mL胚胎培养用油倒入放有磁力搅拌子的烧杯中，搅拌器设定温度为37℃,转速800rpm，将胚胎培养用油预热至36～38℃。7.1.3准备解冻冷冻所用液氮及解冻样本。7.1.4预设自动玻璃化冷冻解冻仪至解冻程序。7.2载杆组泡油7.2.1从液氮中拉下载杆组长期保存套筒，使其脱离载杆组。7.2.2在1s内将无套筒载杆组的圆槽端垂直于烧杯内的胚胎培养用油，浸泡2s。7.3组装解冻载杆组和基板7.3.1取出自动玻璃化解冻支架、基板。7.3.2将泡油后的载杆组与基板组装。7,4组装解冻芯片7.4.1从密封包装中取出复温至室温的解冻芯片，并撕掉其表面的保护膜。7.4.2按照C角在右上方的位置将芯片组装到基板上。7.5运行解冻程序7.5.1将组装好的载杆支架基板及芯片放入冷冻解冻仪的空闲通道中。7.5.2确认通道号、胚胎信息、芯片及协议匹配无误后，运行胚胎解冻程序。7.6解冻后胚胎的应用7.6.1解冻后胚胎继续培养7.6.1.1解冻程序结束后，将基板从冷冻解冻仪上取下，并将其转移至体视显微镜下。7.6.1.2将提前平衡的胚胎体外培养液加到载杆前端圆槽内,将胚胎从圆槽内取出，转移入提前平衡好的胚胎体外培养液中。7.6.1.3解冻后胚胎的体外培养应按照GB/T45202的规定执行。7.6.2胚胎移植7.6.2.1解冻程序结束前，准备好移植用麦管并做好标记。7.6.2.2解冻程序结束后，将基板从冷冻解冻仪上取下，并将其转移至体视显微镜下。7.6.2.3将提前预热的胚胎移植液加到载杆前端圆槽内,将胚胎从圆槽内取出，转移入预热的胚胎移植液中。7.6.2.4胚胎装管应按照GB/T26938的规定执行，装管后胚胎可直接用于移植。58档案记录牛体外胚胎自动玻璃化冷冻、解冻、继续培养及移植过程中，记录各项数据，应符合NY/T3445的要求，见附录B，档案保存2年。T/SAASS215—20256主要设备、器械与试剂A.1主要设备恒温加热台、体视显微镜、自动玻璃化冷冻解冻仪、胚胎培养箱、加热型磁力搅拌器、自动装管辅助装置、金属浴等。A.2主要器械耗材冷冻芯片、解冻芯片、玻璃化冷冻载杆、自动玻璃化冷冻支架及基板、Φ60mm的细胞培养皿、烧杯、转子、50mL离心管、巴氏玻璃管、高纯氮气、高纯二氧化