（正式版）DB13∕T 2593-2017 《禽腺病毒4型PCR检测方法》

DB13/T2593—2017禽腺病毒4型2017-12-22实施2017-12-22实施IDB13/T2593—2017本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、陈赛娟、李杰峰。DB13/T2593—2017禽腺病毒4型PCR检测方法2术语和定义溴化乙锭(ethidiumbromide)聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)3试剂或材料在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.4溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.5焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。工2DB13/T2593—20173.9引物：上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。4仪器设备4.1PCR仪：温度范围4.0℃~99.9℃;样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。以灭活的禽腺病毒4型鸡胚尿囊液作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。c)镊子；5.2.2棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS(配制方法见附录A中A.5)DB13/T2593—20173样品采集后放入塑料袋内密封(一个采集点的样品放一个塑料袋内),于保温箱中加冰，密封24h5.2.5样品的处理5.2.5.1棉拭子处理方法将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。5.2.5.2组织的处理方法用病毒核酸提取试剂盒，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的DNA。6.1.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL离心管中，在离心管中加入200μL样品，加入200μLBB5,6.1.2加入250μL无水乙醇，涡旋混合15s,室温放置5min。6.1.4加入500μLWB5,12000r/min离心1min,弃掉流出液，重复一次。6.1.5室温12000r/min离心1min,彻底去除残留的乙醇，在室温静置1min～3min彻底晾干离心6.1.7室温12000r/min离心1min,洗脱DNA,-20℃贮存备用。PCR扩增条件：94℃预变性3min,94℃变性10s,56℃退火30s,72℃延伸57s,循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。DB13/T2593—201747.1扩增产物的电泳检测7.2结果判定阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性；如果样品的PCR产物电泳后在954bp位置未8试验报告依次陈述试验对象、所使用的标准(包括发布或出版年号)、所使用的方法、检测结果、与试验时间等。DB13/T2593—20175附录A(规范性附录)相关试剂的配制A.2.2TAE电泳缓冲液(50×)焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,加灭菌双蒸水至100mL,室温放置6h～8h,121℃±2℃高压灭A.5.1A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液):NaH₂PO₄·H₂027.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na₂HPO₄·7H₂053.6g,(或Na₂HPO₄·127H₂071.6g或Na₂HPO₄·2H₂O35.6g)先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。8.5g,最后用蒸馏水稀释至1000mL。DB13/T2593—20176(规范性附录)引物名称引物浓度序列(5'-3')上游引物CCGACCGTTACAAGTTTAGCAT上游