DB63-T 2291-2024 青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范

ICS65.020.20CCSB21DB63青海省市场监督管理局发布IDB63/T2291—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。本文件主要起草人：徐金青、沈裕虎、王蕾、王寒冬、边海燕、韩文婷、陈同睿、王焕强、薛明珍、包天忠、李俊仁、李春桥、王健斌、赵璨、尤恩、邓超。本文件由青海省农业农村厅监督实施。DB63/T2291—20241标准名称本文件规定了青稞（Hordeumvulgarevar.nudumHook.f.）育成品种DNA指纹图谱采集的术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、操作步骤、育成品种DNA指纹图谱和品种鉴别等技术要求。本文件适用于青稞育成品种DNA指纹图谱的采集，并对照鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4404.1粮食作物种子第1部分：禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法GB/T34265Sanger法测序技术指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1SNP标记基于单核苷酸多态性的分子标记。3.2DNA指纹图谱通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicAcid）SNP：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism）DB63/T2291—20242PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）5仪器设备及试剂见附录A。超纯水符合GB/T6682的要求，所用试剂为分析纯。6溶液配制见附录B。见附录C。8操作步骤8.1样品准备8.1.1扦样种子质量应符合GB4404.1的要求。按照GB/T3543.2的规定，各待检品种分别进行扦样、分样；每品种籽粒分为3份，一份用于检测，一份留作复检，另一份用于备份。8.1.2发芽按照GB/T3543.4的规定进行发芽，发芽的籽粒数需大于等于50粒。8.1.3叶片采取随机选取三叶一心植株10株，采取叶片混样进行样品制备。8.2DNA样品制备8.2.1DNA提取按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。8.2.2DNA质量检测按照GB/T30988中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。8.3PCR扩增8.3.1反应体系将附录C中引物稀释至10µmol/L，DNA浓度稀释至100ng/μl~200ng/μl。反应体系为25µl,包含10×PCR反应缓冲液2μl，2.5mmol/LdNTP溶液1.6μl，10µmol/L正向引物0.5μl，10µmol/L反向引物0.5μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，超纯水18.2μl，样品DNA2μl。8.3.2反应程序DB63/T2291—2024394℃预变性4min；95℃变性30s，不同引物按照附录C设置退火温度退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。8.4扩增产物检测和测序按照GB/T30988中的琼脂糖凝胶电泳法进行电泳检测，按照GB/T34265中的方法进行测序，获得扩增产物的相应序列。9育成品种DNA指纹图谱按照附录CSNP染色体的位置，记录扩增产物的序列信息，得到青稞育成品种的DNA指纹图谱参见附录D。参照附录D中青稞育成品种的DNA图谱，判断所鉴定的品种是否为相同或不同的品种。DB63/T2291—20244主要仪器设备及试剂A.1主要仪器设备PCR扩增仪、电子恒温不锈钢水浴锅（0℃~100℃)、电子天平（0.01g）、电子天平（0.0001g）、磁力搅拌机、高速台式离心机、高通量组织研磨仪、微量分光光度计、高压灭菌锅、酸度计、微量移液器（2.5μl、10μl、100μl、1000μl）、微波炉、量筒、电泳装置、电泳仪、凝胶成像系统或紫外透射仪、冰箱。A.2主要试剂乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、10×PCR反应缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸、TaqDNA聚合酶、琼脂糖、溴酚蓝、硼酸、二甲苯青、甘油、二甲基腈蓝FF、溴化乙锭。DB63/T2291—20245溶液配制B.1DNA提取试剂B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二纳盐（EDTApH8.0）溶液称取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL超纯水，充分溶解，用0.8g～1.1gNaOH固体调节pH至8.0，定容至50ml。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min，室温保存。B.1.21mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HClpH8.0）溶液称取6.06g的Tris，加40mL的超纯水，充分溶解。用1.8mL～2.2mL的浓HCl（36%~38%）准确调节pH至8.0，定容至50ml。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。B.1.3DNA提取液称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8g和氯化钠32.7g，依次加入10mLTris-HCl溶液（pH8.0）（见B.1.24mLEDTA溶液（pH8.0见B.1.1加超纯水充分溶解后定容至400mL。灭菌温度和时间同B.1.1，4℃保存。B.1.410倍DNA溶解液取10mL1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0见B.1.2）和2mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0见B.1.1混合均匀，定容至100ml，分装后灭菌。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。B.2琼脂糖凝胶电泳试剂B.2.15×TBE贮藏液称取54gTris，27.5g硼酸，加入20ml0.5mol/LEDTA溶液（见B.1.1），再用超纯水定容至1L。用时稀释为1×TBE电泳缓冲液。室温保存。B.2.26×上样缓冲液称取EDTA8.7672g，二甲苯腈蓝FF0.5g，溴酚蓝0.5g，加入360ml甘油，调节PH至7.0，再用超纯水定容至1L，磁力搅拌溶解，4℃保存。B.2.310mg/ml溴化乙锭（EB）在100ml超纯水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室温保存。DB6