69　选择性必修3　第九单元　微专题7　PCR技术与电泳相关问题

微专题7

PCR技术与电泳相关问题选择性必修3生物技术与工程第九单元生物技术与工程一、PCR技术及应用1．PCR循环图示及规律2．PCR中的数量关系循环次数123nDNA分子数2482n含引物1(或2)的DNA分子数1372n－1同时含引物1、2的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物数量2＝21+1－26＝22+1－214＝23+1－22n+1－23．重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。4．反向PCR技术反向PCR技术是根据DNA片段中间的已知序列设计引物，扩增已知序列两侧的未知序列。扩增思路是：先从未知序列的两侧把DNA切成片段，然后通过DNA连接酶将DNA片段环化；再利用已知序列的两端设计引物，只不过引物相对于已知序列是反向配置的，所以子链反向延伸(如图)。PCR反向扩增后，经测序可以确定未知序列。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。5．融合PCR技术与融合蛋白融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白(如图所示)。1．(2025·湖北武汉期末)重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。过程如下图，下列叙述不正确的是(

)A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行一次PCR，共产生4种DNAD．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制√C

[G与C间形成三个氢键，引物中G、C的含量越高，与模板链形成的氢键越多，复性温度可以设置得越高；当设置温度过低，会造成引物与模板链的结合位点增加，导致非特异性条带增多，A正确。由题图可知，引物2和引物3分别与同一段目的基因的两条链的对应位置结合，因此二者之间存在互补配对片段，为防止扩增时引物2与引物3之间进行配对，需将其置于不同的反应系统中，B正确。引物1和2位于一个反应系统中，引物3和4位于另一个反应系统中，这两个反应系统均进行1次复制，由引物1扩增的DNA与引物4扩增的DNA相同，因此只能产生3种双链DNA分子，即引物1(或4)扩增的双链DNA，引物2扩增的双链DNA，引物3扩增的双链DNA，C错误。引物2与目的基因的相应模板链结合，可形成一个双链不等长的DNA分子，该DNA分子中引物2所在的那条链再与引物1结合即可扩增获得同时含有引物1和引物2的双链等长的DNA分子，如图中所示，因此至少需要经过2次复制，D正确。]2．(2025·四川成都期中)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是(

)

A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增B．设计的引物中G、C碱基含量越高，复性温度越低C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子D．在环化阶段，可选E．coliDNA连接酶而不能选T4DNA连接酶√A

[DNA子链合成的方向为5′端到3′端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增，应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；G、C碱基含量越高，碱基对间氢键的含量越多，复性的温度越高，B错误；PCR产物是包含部分已知序列和未知序列的链状DNA分子，C错误；在环化阶段，因为图示的末端为黏性末端，因此，既可选E．coliDNA连接酶，也可选T4DNA连接酶，D错误。]二、电泳及其应用1．核酸凝胶电泳一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率与核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等有关。在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。2．电泳在遗传中的应用遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同切割点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果是个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同切割点，每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。3．(2025·广东深圳一模)为探究DNA片段P与O2蛋白结合的关键位点，研究者获得片段P不同位点的突变体M1、M2和M3，用O2蛋白进行结合试验，并用指示探针(带荧光的片段P)等进行检测，结果如图。下列分析正确的是(

)注：“－”表示未添加，“＋”表示添加，指示探针的浓度很低。A．条带1越宽说明O2蛋白与待测物的结合越强B．显示条带2就说明O2蛋白与P无法结合C．M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合D．M2和M3与O2蛋白的结合强度相同√C

[泳道2与泳道1相比较，泳道2中条带1出现，条带2变窄，说明O2蛋白与指示探针结合，二者结合的越多，条带1就会越宽，条带2就会越窄，由于无荧光标记的蛋白P和突变体(M1、M2、M3)会竞争指示探针与O2蛋白结合，从而使条带2变宽，条带1变窄，且与O2蛋白的结合能力越强，条带1会越窄，条带2会越宽，所以显示条带2说明全部或部分探针未结合O2蛋白，即说明O2蛋白与P可以结合，A、B错误；由题图可知，M1的电泳条带与片段P的电泳条带大体一致，说明了M1的突变位点几乎不影响O2蛋白的结合，C正确；M2和M3的电泳条带宽度不同，说明它们与O2蛋白的结合强度不同，D错误。]4．(不定项)(2025·河北邯郸模拟)肾上腺脑白质营养不良(ALD)是一种伴X染色体的隐性遗传病(致病基因用a表示)，女性杂合子中有5%的个体会患病。图1为某ALD患者家族系谱图，提取该家族中三名女性与此病有关的基因进行PCR，产物酶切后电泳结果如图2所示(正常基因含一个限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点)。下列叙述正确的是(

)A．若不考虑基因突变，Ⅱ-4的基因型只能是XAXaB．a基因比A基因多一个酶切位点是因为发生了碱基的缺失C．Ⅱ-3患病的原因可能是两条X染色体中的一条失活，导致A基因不能表达D．若Ⅱ-1基因型与Ⅱ-5相同，则Ⅱ-1与Ⅱ-2后代患ALD的概率为2.5%√√√ACD

[根据题意，Ⅰ-1基因型为XAXa，Ⅰ-2基因型为XAY，由于Ⅱ-4患病，若不考虑基因突变，Ⅱ-4的基因型只能是XAXa，A正确；结合题干信息，分析图2可知，正常基因酶切后可形成长度为310bp和118bp的两种DNA片段，而突变基因酶切后可形成长度为217bp、118bp和93bp的三种DNA片段，217bp和93bp之和为310bp，正常基因与突变基因碱基对数一样，所以a基因比A基因多一个酶切位点是因为发生了碱基的替换，B错误；由图2可知，Ⅱ-3的基因型为XAX