T-ZJRHXH 0018-2026 化妆品中肌肽等7种肽类组分含量的测定 液相色谱-串联质谱法

T/ZJRHXH0018—2026化妆品中肌肽等7种肽类组分含量的测定液相色谱-串联质谱法前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由浙江省日用化工行业协会提出并归口。本文件起草单位：[建议补充起草单位，如相关检测机构、化妆品企业、高校等]本文件主要起草人：[建议补充起草人信息]本文件为首次发布。1范围本文件规定了化妆品中肌肽、谷胱甘肽、铜肽（甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸）、乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-7等7种肽类组分含量的测定方法。本文件适用于水剂、膏霜、乳液、粉剂、凝胶等各类化妆品（包括原料及成品）中上述7种肽类组分的定量测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法JJF1059.1测量不确定度评定与表示SN/T2324进出口化妆品检验规程3原理试样中的目标肽类组分经混合溶剂超声提取后，采用离心和过滤净化处理。通过反相高效液相色谱进行分离，串联四极杆质谱仪在多反应监测（MRM）模式下检测，外标法定量。利用目标物的保留时间和特征离子对（母离子与子离子）进行定性，以峰面积计算含量。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为色谱纯，实验用水符合GB/T6682规定的一级水要求。4.1试剂4.1.1甲醇（CH₃OH）：色谱纯。4.1.2乙腈（CH₃CN）：色谱纯。4.1.3乙酸（CH₃COOH）：色谱纯。4.1.4三氟乙酸（CF₃COOH）：色谱纯。4.1.5氯化钠（NaCl）：分析纯。4.1.6甲酸铵（HCOONH₄）：色谱纯。4.1.7甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.8提取溶剂：1%氯化钠水溶液：甲醇：乙酸=6:3:1（体积比），现配现用。4.1.9流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液（体积分数）。4.1.10流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液（体积分数）。4.1.115mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%甲酸）：准确称取0.315g甲酸铵，加水溶解后加入1mL甲酸，定容至1000mL，超声混匀。4.2标准品肌肽（CAS：305-84-0）、谷胱甘肽（CAS：70-18-8）、铜肽（CAS：34981-10-7）、乙酰基六肽-8（CAS：616204-22-9）、棕榈酰五肽-4（CAS：214047-00-4）、棕榈酰三肽-5（CAS：147732-56-7）、棕榈酰四肽-7（CAS：221227-05-0），纯度均≥95.0%。4.3标准溶液配制4.3.1标准储备液（1000μg/mL）：分别准确称取各标准品0.0100g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，涡旋混匀。于-18℃避光保存，有效期1个月。4.3.2混合标准中间液（10μg/mL）：分别移取各标准储备液1.00mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，涡旋混匀。于-18℃避光保存，有效期1周。4.3.3混合标准工作液：取混合标准中间液，用提取溶剂逐级稀释配制成系列浓度工作液，肌肽、谷胱甘肽、铜肽浓度范围为0.5μg/L~200μg/L，乙酰基六肽-8等其余4种肽浓度范围为1.0μg/L~500μg/L，现配现用。4.4其他材料0.22μm有机相微孔滤膜；低吸附聚丙烯离心管、进样瓶。5仪器和设备5.1超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（UPLC-MS/MS）：配备电喷雾电离源（ESI）。5.2分析天平：感量0.0001g。5.3超声波清洗仪：功率≥200W，频率40kHz。5.4台式高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。5.5涡旋混合器。5.6容量瓶：10mL、100mL。5.7具塞比色管：10mL。5.8移液枪：10μL~1000μL。6试验步骤6.1试样处理6.1.1水剂类样品：准确称取0.5g（精确至0.0001g）试样于10mL具塞比色管中，加入5mL提取溶剂，涡旋混匀1min，超声提取20min（功率200W，温度≤30℃）。冷却至室温后，用提取溶剂定容至刻度，再次涡旋混匀。取1mL提取液至2mL离心管中，12000r/min离心10min，取上清液经0.22μm有机相滤膜过滤后，注入进样瓶待测。6.1.2膏霜、乳液类样品：准确称取0.5g（精确至0.0001g）试样于10mL具塞比色管中，加入8mL提取溶剂，涡旋混匀2min使样品充分分散，超声提取30min（功率200W，温度≤30℃），期间每隔10min涡旋混匀一次。冷却至室温后，用提取溶剂定容至刻度，涡旋混匀。后续离心、过滤步骤同6.1.1。6.1.3粉剂、凝胶类样品：准确称取0.5g（精确至0.0001g）试样于10mL具塞比色管中，加入6mL提取溶剂，涡旋混匀1min，超声提取25min（功率200W，温度≤30℃）。冷却至室温后，用提取溶剂定容至刻度，涡旋混匀。后续离心、过滤步骤同6.1.1。6.1.4空白试验：除不加试样外，其余操作同6.1.1~6.1.3。6.2色谱条件色谱柱：WatersBEHC18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）或等效柱；柱温：40℃；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；梯度洗脱程序：|时间（min）|流动相A（%）|流动相B（%）||-------------|--------------|--------------||0.0|98|2||1.0|98|2||4.0|35|65||5.5|5|95||7.0|5|95||7.1|98|2||10.0|98|2|6.3质谱条件电离方式：电喷雾正离子源（ESI+）；离子源温度：500℃；毛细管电压：5500V；气帘气压力：30psi；雾化气压力：55psi；辅助气压力：55psi；检测模式：多反应监测（MRM）；7种肽类组分质谱参数：|目标组分|母离子（m/z）|定量子离子（m/z）|定性子离子（m/z）|去簇电压（DP/V）|碰撞能量（CE/eV）|保留时间（min）||----------------|---------------|-------------------|-------------------|------------------|--------------------|-----------------||肌肽|227.1|210.1|110.0|85|18/33|1.76||谷胱甘肽|308.1|179.0|233.1|90|22/28|2.15||铜肽|409.2|392.2|246.1|100|25/32|3.82||乙酰基六肽-8|445.2|102.0|83.9|105|56/72|4.58||棕榈酰五肽-4|579.4|425.3|312.2|110|35/42|5.23||棕榈酰三肽-5|306.8|84.1|129.2|75|48/22|5.67||棕榈酰四肽-7|451.3|323.2|210.1|95|38/45|6.12|7结果计算与表示7.1定量方法以混合标准工作液的浓度为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y），绘制标准工作曲线，采用1/x²加权回归方程进行拟合，得到线性回归方程y=ax+b（相关系数R²≥0.996）。根据试样溶液中目标组分的峰面积，代入回归方程计算其浓度。7.2含量计算按下式计算试样中目标肽类组分的含量：w=\frac{c\timesV\timesf}{m\times10^6}式中：w——试样中目标组分的含量，单位为克每千克（g/kg）；c——由标准曲线得到的试样溶液中目标组分的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；f——试样稀释倍数（未稀释时f=1）；m——试样取样质量，单位为克（g）；10⁶——单位换算系数。7.3结果表示当检测结果≥0.01g/kg时，保留两位有效数字；当检测结果＜0.01g/kg时，保留一位有效数字或表示为“未检出（＜方法检出限）”。8方法学验证指标检出限（LOD）：0.05μg/L~0.5μg/L（S/N≥3）；定量限（LOQ）：0.1μg/L~1.0μg/L（S/N≥10）；回收率：82.7%~109.5%（低、中、高三个添加水平）；相对标准偏差（RSD）：1.1%~6.7%（n=6）；线性范围：各组分在规定浓度范围内线性关系良好（R²≥0.996）。9注意事项9.1标准品应密封避光保存，避免高温和潮湿环境；标准溶液配制后应及时使用，超过有效期需重新配制。9.2样品前处理过程中应控制超声温度≤30℃，避免目标组分降解。9.3质谱仪使用前需进行质量校准，定期维护离子源和色谱柱，确保仪器性能稳定。9.4试验过程中应使用低吸附容器，减少肽类组分的吸附损失。9.5若试样中含有高浓度基质干扰物，可适当增加稀释倍数或采用固相萃取法进一步净化。附录A（资料性附录）7种肽类组分的化学信息序号中文名称英文名称分子式相对分子质量CAS编号1肌肽CarnosineC9H14N4O3226.23305-84-02谷胱甘肽GlutathioneC10H17N3O6S307.3370-18-83铜肽Glycyl-L-histidyl-L-lysineC14