（正式版）DB1307∕T 341-2020 《马铃薯脱毒试管（瓶）苗扩繁技术规程》

张家口市市场监督管理局发布ICS65.020.30B23DB13072DB1307/T341—2020本标准按照GB/T1.1规则起草。本标准由张家口市农业农村局提出并归口。本标准起草单位：张家口市种子管理站。本标准主要起草人：刘齐光、李金荣、杨博文、郑云、王曼、张永清、郭丽莎、吴印宗、杨晓红、赵祥、李艳清、马向辉、李中华、薛木易。马铃薯脱毒试管(瓶)苗扩繁技术规程核心苗3扩繁工作室3.1布局原则脱毒苗生产工作室布局应遵循方便消毒，减少污染的原则，遵守操作流室、灭菌室、配制室、观察室、扩繁室、培养室等，各房间应隔离。周图1工作室平面示意图DB1307/T341—202043.3设备、试剂脱毒试管（瓶）苗生产的设备、试剂参见附录A。3.4卫生要求3.4.1扩繁室、培养室应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次。3.4.2切繁前扩繁室应强制过滤通风，并提前2h开启紫外线灯，工作人员进入前关闭紫外线灯。切繁时扩繁室门窗应时刻紧闭，并保持干燥。3.4.3工作人员进入更衣室1，脱下外衣，换上拖鞋，签到处登记，然后进入更衣室2，换上新的拖鞋，穿好白大褂，戴上帽子到洗手池处用肥皂洗净双手，而后慢慢通过风淋室（风淋室内侧身两次进入更衣室3，换上软底鞋经过缓冲室（缓冲室应有消毒装置，可放置消毒剂，进入时鞋底消毒）并穿上无菌衣和无菌鞋，进入扩繁工作区。操作过程工作人员双手和工作台面要经常用75%的酒精擦拭。3.4.4每次使用超净工作台前，应提前20min打开紫外灯及风机。切繁时关闭紫外灯并打开照明灯保持风机开启状态，超净工作台面及内壁用75%酒精擦拭消毒，超净工作台换气滤网需每月更换一次。3.4.5操作使用的所有工具，使用前应高温灭菌。操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具每次使用前接触植物材料的部分应灼烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染。经灭菌的器械摆放在器械支架上。3.4.6发现污染材料及时清除出扩繁室，并做无害化处理。4扩繁操作4.1培养基使用MS培养基（配方参见附录B）或其他培养基。4.2试管（瓶）制作将配制好的培养基装入容器中，每瓶培养基厚度15mm左右，用封口膜（盖）封口；在121℃~122℃灭菌锅中灭菌21min～22min，取出后放置3d～7d待用。如发现被污染的培养基，及时清除。4.3扩繁材料选取选取经检测合格的基础苗。4.4扩繁操作4.4.1试管（瓶）口灭菌试管（瓶）口火焰灭菌，在拔封口膜（盖）前用火焰快速灼烧试管（瓶）口外侧，打开试管（瓶）后再瞬时灼烧试管（瓶）口及封口膜（盖）内侧。4.4.2切繁在酒精灯火焰附近，一只手斜握培养瓶，另一只手拿剪刀剪取脱毒苗茎段放入试管（瓶）。根据基础苗长势，确定切断长度，确保每个茎段至少有一个腋芽和一片叶片。用定植针将茎段均匀的向上插入或平铺在培养基上，使腋芽与培养基充分接触。4.4.3封口切繁后旋转试管（瓶）口，火焰灭菌数秒后迅速封口。54.5标识在瓶壁上注明材料名称缩写、编号、接种人员代号和接种日期。4.6培养条件将切繁后的试管（瓶）放在培养架上。培养室白天培养温度18℃~22℃,光照17h，光照强度2000Lx～3000Lx，夜间温度15℃~18℃。培养15d～20d，待茎段长出7～8个叶片可再次切段扩繁。6（资料性附录）脱毒试管（瓶）苗生产的设备、试剂A.1生产设备A.1.1风淋系统A.1.2超净工作台A.1.3空调、冰箱A.1.4紫外灯A.1.5高压灭菌锅A.1.6培养架A.1.7器械灭菌器A.1.8器械柜A.1.9器械支架A.1.10酒精灯A.1.11镊子、剪刀、定植针、解剖刀A.1.12试管（瓶）A.1.13封口膜、橡皮筋、封口盖A.2试剂A.2.1消毒剂A.2.295%酒精、75%酒精A.2.3pH试纸A.2.4附录B所用试剂DB1307/T341—20207（资料性附录）表B.1MS培养基储备液配制A磷酸二氢钾（KH2PO4）B硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5C5钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）硫酸铜（CuSO4·5H2O）55硼酸（H3BO3）D5注：配置母液A时，最后加氯化钙；配置母液B时，分别溶解硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，溶解时要