猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立

2026年猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立分离·原代培养·模型建立汇报导览01模型价值猪小肠上皮细胞的研究意义02分离方法酶消化与组织块两条路线03纯化培养成纤维细胞去除与条件优化04鉴定验证多维度确认模型建立05应用展望永生化细胞系与类器官前沿模型价值肠道是机体最大的免疫组织，上皮细胞是研究肠道功能的第一道窗口01细胞组成构建极性防线细胞呈典型顶端—基底极性：顶端面朝向肠腔，基底面朝向固有层。该极性是细胞成熟标志，也是体外培养中判断细胞状态的核心形态依据。吸收细胞占比80%~90%：柱状，顶端富含微绒毛，刷状缘分布蔗糖酶、乳糖酶及转运体杯状细胞占比5%~10%：释放黏蛋白形成黏液层潘氏细胞隐窝底部：分泌溶菌酶与防御素内分泌细胞与隐窝干细胞数量少但功能关键四重屏障支撑肠道功能小肠上皮细胞承担营养吸收与屏障防御双重使命，屏障功能具体由四层机制叠加实现。“小肠上皮屏障功能由物理、化学、免疫屏障与营养吸收转运四层机制协同实现。”猪胃肠道在形态、营养转运及发育上与人类婴儿高度相似，使猪小肠上皮细胞成为研究人类婴儿营养与肠道疾病的理想体外模型。物理屏障紧密连接形成“闸门”阻止内毒素与细菌经细胞间隙进入血液化学屏障溶菌酶、防御素、黏蛋白与乳铁蛋白构成抗菌网络免疫屏障TLR等模式识别受体识别病原相关分子模式，激活下游信号并招募免疫细胞营养吸收SGLT1葡萄糖主动转运GLUT5果糖被动转运顶端转运体氨基酸与小肽进入细胞隐窝绒毛轴维持动态更新隐窝—绒毛轴上皮更新骨架肠道干细胞位于隐窝底部，自我更新并分化为吸收细胞、杯状细胞等全部上皮类型；转运扩增细胞向上迁移分化，绒毛顶端细胞凋亡脱落。动态平衡稳态维持机制底部生出、顶部脱落，维持结构完整与功能稳定。研究窗口体内更新最快组织肠上皮为体内更新最快组织之一，适于研究增殖与分化调控。病理关联屏障损伤风险细胞受损则屏障破坏，典型如仔猪断奶后肠道损伤，凸显稳定原代培养模型的必要性。分离方法方法的选择决定细胞的得率与活力02联合酶消化法高效解离步骤1

联酶配方联酶配方XI型胶原酶（300000U/L）+I型中性蛋白酶（0.1g/L），直接灌注仔猪小肠腔内步骤2

取材标准取材标准出生

12小时内未吃初乳

的大白仔猪，剖腹剪取小肠段步骤3

操作流程操作流程PBS冲洗3次去黏液→灌注联酶混合液→37℃水浴振荡约30分钟→反复吹打→1000r/min离心5分钟收集细胞团步骤4

结果结果联酶消化室温约40分钟即可获得贴壁能力较强的IEC团块，缩短消化时间并降低细胞毒性损害组织块培养法温和迁出原理MECHANISM无需酶消化，依靠细胞自身迁移能力获得上皮细胞，对酶敏感细胞更友好。操作流程PROCEDURE新生仔猪小肠纵行剪开，PBS冲洗后剪成0.5~1mm³细块均匀摆放于培养瓶内壁，间距约0.5厘米翻转培养瓶加少量培养基，37℃静置2~4小时待贴附后缓慢翻回约3~7天可见细胞从组织块边缘迁出验证效果VALIDATION扬州大学团队稳定传11代，倒置显微镜下保持"铺路石"和上皮样形态同领域资料显示：22小时内贴壁分裂，10~12天汇合成单层，增殖能力强核心优势ADVANTAGE灌注消化优于机械剪碎，可获得形态完整、易贴壁的小肠绒毛细胞团两法对比指向传代边界四条分离路线各有所长，传代稳定性划定使用边界

酶消化法适合致密组织、需大量单细胞胰蛋白酶消化约1小时，多为单细胞，贴壁与生长能力较差胶原酶+中性蛋白酶联用兼顾得率与活力，为猪IEC分离主流机械分散与螯合剂处理多作辅助

组织块培养法适合保留细胞间相互作用、对酶敏感的场景这一数据为原代模型的使用代次划定了明确边界组织块法稳定传11代•第11代后细胞间隙变大、规则不明显，细胞开始凋亡•第15代出现大量凋亡并从瓶底脱落，仅很少细胞贴壁传代稳定性边界纯化培养纯度与条件是原代培养成败的关键03局部画圈法清除纤维污染成纤维细胞增殖快、抢占空间，是原代培养最棘手的污染源。经纯化处理，猪小肠黏膜上皮细胞纯度可达

90%以上，电镜与CK18免疫荧光染色结果均证实该纯度水平。01处理方案局部画圈法显微镜下标出成纤维细胞区域超净台内灭菌刮子刮除，PBS洗涤后继续培养必要时重复操作02预防策略源头抑制成纤维细胞对胰酶更敏感、贴壁更快的特性短时消化或短时贴壁后转移悬液逐步富集上皮细胞培养体系精细调控培养条件直接决定上皮细胞的存活与表型维持。培养条件的精细调控直接决定上皮细胞的存活与表型维持，需在血清浓度、生长因子与酸碱度之间取得平衡。培养体系调控关键参数血清浓度胎牛血清≤5%；过高浓度10%~20%促非肠黏膜上皮过度增殖少量异源细胞利于IEC生长：上皮与间质细胞存在相互作用生长因子EGF促IEC贴壁；与胰岛素合用促生长谷氨酰胺利于原代上皮细胞生长pH7.2~7.4最适范围，影响细胞内酶及生长因子活性培养基储存新鲜配制为佳；4℃低温储存不宜超过1周新方案含10%猪血清DMEM/F-12方案：维持中等跨上皮电阻、最低通透性、增强紧密连接蛋白膜定位，为标准化培养提供新选项鉴定验证多维度证据链锁定上皮细胞身份04免疫荧光锁定上皮身份CK18免疫荧光鉴定：上皮细胞特异性中间丝蛋白，阳性即确认上皮身份免疫荧光鉴定图操作流程4%多聚甲醛固定30分钟→5%BSA封闭20分钟→一抗37℃孵育1小时→SABC放大+DAB显色验证结果中国农业大学团队纯度达90%以上；扬州大学团队CK18抗原鉴定阳性电镜超微结构鉴定纹状缘整齐排列、紧密连接清晰可见，为上皮细胞结构与功能完整性的金标准形态学佐证倒置显微镜下多角状/卵圆形、单层铺路石状排列，与分子标志共同构成完整证据链增殖与核型双维验证增殖曲线体外增殖特征约22小时贴壁分裂6~7天明显增殖10~12天汇合成单层为换液传代排期提供参照核型分析染色体鉴定扬州大学团队确认染色体为二倍体排除恶性转化维持正常遗传背景形态学镜下观察倒置显微镜下多角状排列单层铺路石状排列确认上皮样形态分子标志免疫鉴定CK18阳性确认上皮身份与形态学构成完整证据链遗传背景遗传稳定性二倍体核型排除恶性转化三重证据链锁定原代模型成功建立应用展望从原代模型走向标准化与三维化05永生化细胞系标准化替代IPEC-J2细胞系来源未吮吸初乳新生仔猪空肠分离属性非转化空肠上皮模型形态具顶-基极性的柱状上皮标志表达紧密连接蛋白、黏蛋白MUC及多种营养素转运体活性兼具代谢与免疫活性培养90%DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，37℃、5%CO₂贴壁，1:2至1:3传代应用经消化婴儿配方奶粉处理未损害单层屏障完整性，游离氨基酸正常转运至基侧室保藏中国典型培养物保藏中心与ATCC均有Caco-2细胞来源肿瘤源性跨上皮电阻过高生理贴近度IPEC-J2更贴近生理状态，已成为体外婴儿营养研究中Caco-2的替代模型三维类器官延伸模型边界隐窝分离含3mMDTT、9mMEDTA及10μMY27632R›机械刮离以显微镜载玻片机械刮离隐窝›过滤经100μm滤器过滤›分离建系从冷冻保存的猪肠上皮隐窝出发，经分离、培养建立3D类器官›构建单层进一步构建细胞单层标准流程法国团队2023年在JoVE发表108步标准流程规模优势可制备多个肠段、多个动物来源的大量冷冻隐窝，显著减少对活体动物的需求研究进展与体系完善吉林大学团队丁酸钠激活GPR109A及Akt信号通路，上调紧密连接蛋白表达，改善肠道机械、免疫、化学及微生物四重屏障功能西南