2026 血管芯片技术要求与标准解读

血管芯片通用技术要求 前 引 范 规范性引用文 术语和定 技术要 外 细胞来源组件性能生物性能

………………………………………质控设置试验方法外观

………………………………………………………透光 密封 工作温度耐受 生物相容 血管壁面剪切应 生物组织形 生物组织活 脉管组织可灌注性及流动 血管屏障功 标识标签和随行文 标识和标 随行文 包装运输和贮 包装运输贮存

………………………………………………………附录资料性)检测方 外 透光率密封性

………………………………工作温度耐受 生物相容 血管芯片中三维脉管网络的构 基于闭合循环灌流系统的血管芯片一氧化氮释放检 脉管组织可灌注性及流动性评 血管芯片中免疫荧光染色方 无菌检 支原体检 人类免疫缺陷病毒检 乙型肝炎病毒检测丙型肝炎病毒检测外源病毒因子检测

………………………………………………参考文献

…………………… 血管系统是人体循环功能的核心单元不仅在物质运输能量交换和信息传递中扮演着关键角色其结构与功能的完整性也是众多重大疾病发生发展的病理基础。因此在生物医学研究药物研发与毒性评价等领域构建能够高度模拟人体血管生理与病理状态的体外模型具有至关重要的意义。血管芯片作为一种新兴的器官芯片技术通过融合微流控工程细胞生物学与生物材料学成功构建了活体血管内皮细胞与细胞外基质的三维微血管结构。该技术能够精确控制流体剪切力等关键生理参数为研究血管生物学药物血管毒性肿瘤转移炎症反应及代谢性疾病等提供了高度仿生的体外研究平台。目前全球范围内相关产品与研究的数量激增但因缺乏统一的技术规范不同厂商开发的血管芯片在结构设计核心组件培养体系功能评价指标等方面存在显著差异导致数据难以比较与互认严重阻碍了该技术的标准化产业化及其在监管科学中的应用。为解决上述挑战推动我国血管芯片技术的健康有序发展并为其在药物筛选疾病模型构建及个性化医疗等领域的可靠应用提供技术依据特制定本文件。血管芯片通用技术要求范围本文件界定了血管芯片的术语和定义规定了技术要求质控设置标识标签和随行文件以及包装运输和贮存描述了相应的试验方法。本文件适用于以微流控芯片为载体的血管芯片的设计生产和检验规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。包装储运图形符号标志透明塑料透光率和雾度的测定3环境试验第2部分试验方法试验密封工业产品使用说明 总5医疗器械生物学评价 第5部分体外细胞毒性试验2医疗器械生物学评价 第2部分样品制备与参照材料生物芯片基本术语生物基材料术语定义和标识微流控芯片核酸恒温扩增仪技术要求中华人民共和国药典5年版)术语和定义4界定的以及下列术语和定义适用于本文件微流控芯 以硅玻璃金属材料高分子聚合物等材料为基材利用微纳加工精密注塑等加工技术加工而成的生物芯片注包括一个或多个微管道微阀微泵微反应池腔室等功能单元能够完成芯片内液体气体流动的精准操控从而实现某种特定的生化反应功能。来源有修改透光 透过试样的光通量与射到试样上的光通量之比注:用百分数表示来源有修改密封 芯片及其附属材料防止内装物溢出或其他物质进入的特性。来源]血管芯 能在微流控芯片中生成具有可灌注性屏障功能生化分泌活性的三维脉管网络的微型培养器件生物相容 各种材料与生物体之间相互作用后产生的各种复杂的生物物理化学等反应及其对生物反应过程和反应结果的影响的性能来源灌注 微流控芯片生成的血管内皮脉管腔在压力梯度驱动下允许流体通过相互连接的管腔进行灌注的能力血管屏障功 微流控芯片形成的血管内皮脉管腔能够限制管腔内部与间质之间水分子蛋白质脂质及细胞等的选择性交换。血管壁面剪切应 由相邻流体层之间的速度梯度所产生的方向平行于血管壁的摩擦力注:单位是帕斯卡技术要求外观芯片应结构完整组分齐全无泄漏无破损功能结构区域应无影响产品质量特征的明显划痕破损或其他明显可见缺陷细胞来源构建血管芯片的细胞组成应以血管内皮细胞为主体在成纤维细胞的支持下促进血管内皮脉管腔的生成并可进一步引入平滑肌细胞与周细胞等提升其结构与功能的完整性。细胞来源可通过人体组织分离与提取干细胞定向诱导分化以及细胞系培养等方式获得。组件性能透光率微流控芯片中用于血管内皮脉管腔培养的空腔室其在390nm~780nm可见光波段的光谱透光率应不低于该芯片及其附属材料最小透光率的0%。密封性微流控芯片中用于血管内皮脉管腔培养的各独立腔室之间以及芯片及其附属部分的任何部位不应发生试剂串扰或泄漏工作温度耐受性用于血管内皮脉管腔培养的微流控芯片及其附属材料在使用工作温度0℃范围内且试验时间应不少于2倍的正常试验条件工作时间外观应无形变无破损密封性测定结果应符合2要求。生物相容性应选用对血管内皮细胞或组织无细胞毒性的材料作为微流控芯片的基片及附属材料生物性能血管壁面剪切应力应明确血管芯片中流体壁面剪切应力的大小。壁面剪切应力值的参考范围在生物组织形态血管芯片中的血管内皮细胞应具备自组装能力形成相互连接分支丰富细胞间具有紧密连接的中空管状结构。所形成的脉管结构应具备清晰的腔面边界网络连续且无大面积缺损并完整覆盖预设的通道或三维基质区域从而构成一个高度组织化的微血管网络结构。生物组织活性应明确血管芯片中脉管网络能够模拟生理条件下血管中的内皮细胞功能能够实现一氧化氮等活性物质的正常分泌与及时清除。采用硝酸还原酶法进行检测时其NO分泌峰值应不低于且各次独立检测结果的相对标准偏差应不大于8%。脉管组织可灌注性及流动性应明确血管芯片可形成具有灌注性的脉管网络并通过相互连接血管芯片的微通道反应室微泵或其他功能部件模拟生理条件下血管内的可持续性血液流动。血管屏障功能应明确血管芯片的屏障功能屏障功能应满足以下条件所构建血管芯片中脉管内皮腔具有一种或多种紧密连接蛋白如1等的表达在显微镜下观察到紧密连接蛋白的表达紧密连接蛋白呈现连续的环状表达而非斑片状分布质控设置应从连续生产的三批血管芯片产品中每批随机抽取0张芯片作为样本。所有样本应在重复性条件下进行独立检测其性能指标检测结果应符合4的要求。产品出厂前应按照中华人民共和国药典5年版的要求进行包括细菌真菌支原体及特定病毒在内的病原微生物检测所有检测项目结果均应合格。试验方法外观目视检查透光率按照0的规定将微流控芯片的血管内皮培养腔室置于分光光度计或符合波长要求的光功率计检测窗口直接测定其透光率具体检测方法见附录A中。密封性按3的第6章进行密封性试验具体检测方法见。试验条件如下试验温度在微流控芯片最高工作环境温度以上1~5条件试验持续时间保持不少于2倍的正常试验条件工作时间检测漏泄的方法用与背景形成清晰对照的检测液体目测工作温度耐受性微流控芯片在偏离工作温度0℃的条件下时间不小于2倍正常试验时长检测其是否渗漏观察外观有无变形或破损具体检测方法见。生物相容性按照5的规定通过细胞形态学观察及细胞活性分析来检测微流控芯片基片及其附属材料是否存在细胞毒性具体检测方法见。血管壁面剪切应力根据7℃恒温条件下培养基的动力黏度预设流量及血管芯片的流道几何形状计算其壁面剪切应力。具体而言对于圆形截面的灌流流道按照公式进行计算对于长方形截面的灌流流道则按照公式进行计算。灌流流道的宽度应为高度的0倍以上。随后根据目标壁面剪切应力值利用相应公式反推计算出所需的培养基体积流量Q。通过注射泵将培养基以该计算流量稳定均匀地灌注至血管芯片中从而在芯片内实现设定的壁面剪切应力。为保障流速的准确性采用微流量计对注射泵的实际输出流量进行校准确保灌注条件的可靠与稳定式中τ壁面剪切应力μ培养基的动力黏度Q体积流量R圆截面的半径式中τ壁面剪切应力μ培养基的动力黏度

……(1……(2Q体积流量w灌流流道的宽度h灌流流道的高度生物组织形态将血管内皮细胞与支持细胞如成纤维细胞等按特定比例混合并包裹于纤维蛋白或胶原蛋白等水凝胶中。凝胶复合物注入微流控芯片的血管培养腔室并在灌注通道中持续灌注包含血管内皮生长因子的培养基。在动态培养条件下通常为血管内皮细胞在基质中迁移增殖并自组装最终形成具有分支和贯通管腔的三维微血管网络。可通过活细胞成像与免疫荧光染色等方式对形成的网络进行形态与功能验证具体检测方法见。生物组织活性通过构建一个由泵储液器与血管芯片组成的循环灌流系统可对血管芯片内的三维血管脉管施加设定的流体剪切力。在力学刺激下脉管内皮细胞会分泌O等活性物质。继而收集循环培养基检测其中O等目标物质的浓度即可量化内皮细胞在剪切力刺激下的特异性释放水平以评估其功能响应具体检测方法见。脉管组织可灌注性及流动性采用灌注示踪法评估血管芯片中脉管组织的可灌注性与流动性。向脉管组织灌注荧光微球或可溶性染料作为示踪剂利用延时显微成像技术实时捕捉其在脉管网络内的运动轨迹与空间分布。通过分析示踪剂的运移路径与填充情况对脉管组织的灌注性与流动性进行评估具体检测方法见。血管屏障功能通过对紧密连接蛋白如1等标志物进行特异性染色来实现对血管芯片中脉管的屏障功能评估。在共聚焦显微镜下观察其在内皮细胞间的连续性分布形态与结构完整性具体检测方法见标识标签和随行文件标识和标签产品的包装箱盒上的标识和标签应符合1的有关规定随行文件产品的随行文件应包括说明书说明书的编制应符合9的有关规定随行文件应标明血管芯片培养腔室数量培养腔室尺寸包装运输和贮存包装产品的包装应满足如下要求在所有的贮存运输条件下包装能保证内容物的特性和性能不变产品采用适宜的包装容器且包装的密封条的任何损坏都清晰可见运输产品的运输应满足如下要求按照制造商规定的运输包装要求对产品进行包装按照制造商规定的密封条件温度要求防紫外线/防辐射等条件进行运输在运输过程中避免碰撞或强烈震动贮存产品应根据制造商规定的要求进行贮存附录A资料性)检测方法外观目视检查。观察微流控芯片结构是否完整组分是否齐全是否无泄漏无破损功能结构区域是否无划痕破损或其他明显可见缺陷。透光率方法来源按照检测对象微流控芯片中用于血管内皮脉管腔培养的空腔室主要仪器积分球式雾度计配备C光源或A光源方法原理使用积分球式雾度计检测通过试样的总透射光通量和入射光通量计算出透光率。对于每个试样透光率按公式计算以百分数表示。 1t式中Tt透光率T2通过试样的总透射光通量T1入射光通量试样要求试样表面应清洁无划痕无油污无灰尘。试样尺寸应足够大能完全覆盖积分球的入射光和出射光窗口。至少测试3个试样取平均值精确到%。检测结果符合1的要求密封性方法来源按照检测对象用于血管内皮脉管腔培养的微流控芯片检测条件检测温度设置应高于正常试验条件温度的%试验时间设置应不少于2倍的正常试验条件工作时间。检测方法向微流控芯片中的血管内皮脉管腔培养腔室及两侧培养基腔室分别灌注天狼星红染料溶液随后置于2℃空气循环干燥箱中保存。为确保有效性试验期间需定期检查并维持各腔室染料溶液充盈避免干涸。试验结束后将微流控芯片置于白色吸水纸上目测检查微流控芯片是否存在液体泄漏。检测重复至少3次且每个批次均应设置不少于3个平行试样。检测结果符合2的要求工作温度耐受性方法来源按照检测对象用于血管内皮脉管腔培养的微流控芯片检测条件微流控芯片应在使用工作温度0℃范围内且试验时间不少于2倍的正常试验条件工作时间外观应无形变无破损。检测方法具体检测方法包括如下方面将微流控芯片置于7℃空气循环干燥箱中保存。试验结束后目测微流控芯外观应无形变无破损密封性测定按照密封性测试方法见进行。检测重复至少3次且每个批次均应设置不少于3个平行试样。将微流控芯片置于7℃空气循环干燥箱中保存。试验结束后目测微流控芯外观应无形变无破损密封性测定按照密封性测试方法见进行。检测重复至少3次且每个批次均应设置不少于3个平行试样。检测结果符合3的要求生物相容性方法来源按照检测对象采用微流控芯片浸提液处理人脐静脉内皮细胞通过观察细胞形态变化并检测细胞活性综合评估其潜在细胞毒性检测方法试验分组试验设立阴性对照组与阳性对照组作为参照。检测重复至少3次且每个批次均应设置不少于3个平行试样浸提液制备按照2的规定在无菌条件下对微流控芯片进行纵向切割充分暴露其内部密封的中间腔道脉管培养腔室及两侧的培养基腔道。将切割后的芯片片段按体积的终浓度与细胞培养基混合置于7℃培养箱中浸提以获取微流控芯片浸提液。浸提液稀释使用经37预平衡4h的完全培养基作为稀释溶剂将原浸提液定义为%浓度依次稀释为%%%8h结果判定形态学观察采用倒置显微镜观察细胞形态并按照浸提液细胞毒性形态学定性分级标准进行判定。当毒性分级大于2级时判定样品具有细胞毒性作用。细胞活性分析通过四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性。与阴性对照组相比若实验组细胞活性下降幅度大于%则判定为存在细胞毒性。检测结果符合4的要求血管芯片中三维脉管网络的构建方法原理基于纤维蛋白原在凝血酶催化下聚合形成纤维蛋白水凝胶的生化特性构建三维细胞培养体系。将C与人肺成纤维细胞按特定比例共包裹于该水凝胶中并通过补充生长因子模拟体内的血管生成微环境。此体系能显著增强血管网络的稳定性和成熟度并诱导C自组装形成具有管腔结构的三维脉管网络。构建方法细胞准备分别扩增HUVEC与确保细胞状态良好并处于对数生长期用于后续实验凝胶复合物制备以构建L凝胶体系为例。在预冷的无菌离心管中按以下顺序精确加入各组分并使用移液器轻柔吹打混匀全程注意避免产生气泡。F与C的共培养比例建议范围为-VEC的终密度约为7纤维蛋白原工作液5凝血酶工作液0凝胶灌装与聚合使用预冷的移液器将上述细胞与凝胶的混合物缓慢注入微流控芯片的血管内皮脉管培养腔室中注意避免产生气泡。随后将芯片置于7℃培养箱中静置50使纤维蛋白原充分聚合形成包裹细胞的三维纤维蛋白水凝胶。血管内皮脉管网络培养与形成向微流控芯片两侧的培养基通道中加入血管内皮细胞完全培养基。将微流控芯片置于7℃培养箱中连续培养培养基每h更换一次。在此过程中C将在水凝胶内发生自发性的迁移增殖与细胞间连接最终形成贯通的三维中空管状网络。检测结果符合2的要求基于闭合循环灌流系统的血管芯片一氧化氮释放检测方法原理旨在模拟体内血液流动对血管内皮细胞的力学刺激并定量评估其功能性响应。通过构建一个由泵储液装置和血管芯片组成的闭合循环灌流系统对芯片内的三维血管内皮脉管施加特定的壁面剪切应力。脉管含有的内皮细胞在流体剪切应力刺激下会分泌一氧化氮。通过收集循环培养基并使用硝酸还原酶法测定其中O浓度峰值即可间接量化内皮细胞在力学刺激下的O释放水平。主要设备与试剂主要设备与试剂包括血管芯片已完成内皮细胞接种并成功形成三维有管腔屏障功能完善的脉管网络的微流控芯片;泵可精确控制流速以产生目标壁面剪切应力储液装置无菌的培养基储液池或储液瓶管路生物相容性良好的无菌管如硅胶管内径与芯片接口匹配内皮细胞培养基硝酸还原酶法NO测定试剂盒酶标仪系统连接详细步骤计算目标流速参照6所述方法经计算确定泵的设定流速值。随后施加目标壁面剪切应力并进行持续4h灌注刺激。灌注结束后收集循环培养基作为待测样品组装闭合循环系统以单个血管芯片为单位按以下顺序连接各个组件形成一个独立的闭合回路储液装置泵管血管芯片的流体入口→血管芯片的流体出口→返回储液装置连接细节连接步骤包括使用适当长度的管路确保回路顺畅无扭曲或压折将所有接口处管与芯片管与储液装置确保紧密连接防止灌流过程中漏液或引入气泡 在系统组装完成后可先用无菌PBS缓冲液进行短暂灌流以排出管路和芯片腔道中的气泡确保流体畅通。系统初始化将闭合循环灌流系统置于7℃恒温环境如细胞培养箱。向储液装置注入预定体积例如0的预温培养基。系统启动时应先以较低流速如目标流速的%运行50该步骤旨在使流体平稳过渡从而有效排出血管网络中的气体并确保其结构被培养基完全浸润为后续实验建立稳定的初始条件。灌注刺激与样品收集施加刺激将闭合循环灌流系统的流速调整至6中计算得到的目标流速开始正式灌注刺激。记录此时为T=0h。整个灌流过程在37℃环境下持续进行4h样品收集在T4使用无菌移液器从储液装置中小心吸取一定体积例如1mL)的循环培养基。将培养基作为待测样品并立即置于-20或-80冰箱冻存以备检测。血管芯片中一氧化氮检测采用硝酸还原酶法测定样品中的NO浓度。实验同步设立空白组与标准组与样品测定组一同检测吸光度值。最后根据公式计算3式中

A测定-A空白A标准-A

×C标准

2CNO样品中的NO浓度;A测定测定组的吸光度值;A空白空白组的吸光度值;A标准标准组的吸光度值;C标准标准组的浓度;N样本测试前稀释倍数检测结果符合3的要求脉管组织可灌注性及流动性评估检测原理本实验通过重力势差驱动下将荧光标记的微球注入血管芯片的脉管腔网络中利用延时显微成像技术实时追踪微球在脉管腔内的运动轨迹从而直观地定性与评估血管脉管腔网络的连通性整体可灌注性及腔内流体的流动性。检测方法荧光示踪剂灌注将构建有脉管网络的微流控芯片从培养箱中移出并置于倒置荧光显微镜的载物台上。通过显微操作器或精密注射针将含有荧光微球等示踪介质的悬液自芯片的培养基腔室入口处注入。进而通过精密调节芯片入口与出口的液柱高度产生压力差以此驱动荧光示踪介质进入脉管腔内部。实时成像与数据采集在荧光示踪剂开始流入网络的同时启动显微镜的延时拍摄功能。使用低倍物镜如×或×)定位并观察脉管网络的整体轮廓然后切换至高倍物镜如×重点观察目标区域的微球运动细节。设置合适的拍摄参数如曝光时间采样间隔和总持续时间持续记录荧光微球在脉管腔内流动穿过整个网络并从出口端流出的全过程。数据分析通过分析获取的延时影像直接观察荧光信号是否能够充满并贯通整个预设的脉管网络验证其结构连通性与可灌注性。检测结果符合4的要求血管芯片中免疫荧光染色方案材料与试剂主要材料与试剂包括4%多聚甲醛固定液溶于PBS缓冲液现配现用或分装冻存PBS缓冲液磷酸盐缓冲液H通透液%%n%%使用针对或其他目标蛋白的特异性一抗使用带有荧光标记的二抗抗荧光淬灭封片剂移液器及无菌枪头设备主要设备包括生物安全柜共聚焦显微镜或高内涵成像系统湿盒具体操作步骤样品固定终止培养与清洗将构建有脉管网络的微流控芯片从培养箱中移出后首先使用无菌移液器缓慢沿侧壁吸出内部培养基。继而通过流体入口缓慢加入预温7℃或室温的S缓冲液对芯片进行清洗以去除培养基及残留血清蛋白。此过程需重复1次2次且所有操作均应控制流速旨在将流体剪切力降至最低防止损伤脆弱的血管内皮网络。固定通过芯片流体入口缓慢加入4PFA固定液确保充满整个流体通道。在室温下避光固定150。注意时间不宜过长以免导致抗原封闭和自发荧光增强固定结束后缓慢吸出用PBS缓冲液清洗芯片内部3次每次50以彻底去除残留的固定剂。通透与封闭通透向芯片流体入口缓慢加入%%n0通透液室温作用105。通透结束后用PBS缓冲液清洗3次每次5。封闭向芯片流体入口加入足量的封闭液如3%确保充满通道。将整个芯片放入湿盒中在室温下封闭1h,或4℃下过夜。一抗孵育配制一抗工作液用封闭液稀释1一抗。稀释比例需根据抗体说明书和预实验结果确定常见的起始稀释比例为。孵育一抗缓慢吸出芯片内的封闭液。加入稀释好的一抗工作液确保充满通道避免产生气泡。将芯片放入湿盒4℃下孵育过夜。二抗孵育清洗从4湿盒中取出芯片恢复至室温。吸出一抗PBS缓冲液清洗芯片内部3次~4次每次150以充分洗去未结合的一抗配制二抗工作液用封闭液稀释荧光标记的二抗。稀释比例通常为。从这一步开始后续所有操作都应在避光条件下进行以防荧光淬灭。孵育二抗吸出最后一次的PBS缓冲液。加入稀释好的二抗工作液避光室温下孵育1h~2h成像封片吸出二抗用PBS缓冲液避光清洗芯片内部3次~4次每次150。吸出最后一次的镜检向芯片流体通道内缓慢加入少量PBS缓冲液后立即使用共聚焦显微镜进行观察和图像采集显微镜观察使用共聚焦显微镜在多个随机视野下进行k扫描并获取血管内皮脉结构的高清三维图像以展示1在内皮细胞细胞膜连接处的连续线性分布。检测结果符合5的要求无菌检测方法来源中华人民共和国药典5年版的无菌检查法检测对象微流控芯片培养的血管内皮脉管检测结果若供试品管均澄清或虽显浑浊但经确证无菌生长判供试品符合规定若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长判供试品不符合规定。支原体检测方法来源中华人民共和国药典5年版的支原体检查法检测对象微流控芯片培养的血管内皮脉管检测结果若接种供试品的培养基均无支原体生长则供试品判为合格若疑有支原体生长可取加倍量供试品复试若无支原体生长供试品判为合格若仍有支原体生长则供试品判为不合格。人类免疫缺陷病毒检测方法来源中华人民共和国药典5年版检测对象微流控芯