T-SHQAP 019-2025 人肝前体细胞

T/SHQAP019—2025人肝前体细胞Humanhepaticprogenitorcells2025-09-01发布2025-10-01实施发出发出布版ⅠT/SHQAP019—2025前言 Ⅲ 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5原材料和辅料 6制备的一般要求 7技术要求 8检验方法 9检验规则 12废弃物处理 附录A（规范性）细胞活率——细胞计数法 附录B（规范性）细胞标志蛋白及免疫原性测定——流式细胞术 附录C（规范性）细胞功能指标——ELISA法 附录D（规范性）免疫调控——流式细胞术 附录E（规范性）成瘤性——软琼脂克隆形成试验 参考文献 ⅢT/SHQAP019—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市医药质量协会提出并归口。本文件起草单位：上海慧存医疗科技有限公司、上海赛立维生物科技有限公司、上海交通大学医学院附属仁济医院、椎元医学技术（上海）有限公司、青岛慧存生物科技有限公司。本文件首期承诺执行单位：上海慧存医疗科技有限公司、上海赛立维生物科技有限公司、椎元医学技术（上海）有限公司、上海赛尔维医疗科技有限公司、力擎医药科技（上海）有限公司、博鳌超级医院、和元和美（上海）有限公司、和元生物技术（上海）股份有限公司、上海驭邦医药科技有限公司、青岛慧存生物科技有限公司。1T/SHQAP019—2025人肝前体细胞本文件规定了人肝前体细胞制备的原材料和辅料、制备的一般要求，以及人肝前体细胞的技术要求、检验规则、标签以及包装、储存及运输和废弃物处理要求，描述了人肝前体细胞的检验方法。本文件适用于人肝前体细胞的制备和检验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19815离心机安全要求GB/T26497电子天平GB/T22062—2020显微镜目镜分划板JJF1308—2011医用热力灭菌设备温度计校准规范JJF1665流式细胞仪校准规范YY/T0588流式细胞仪中华人民共和国药典（2025年版）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。人肝前体细胞humanhepaticprogenitorcell肝脏内具有自我更新、高度增殖和肝向分化特性的细胞。细胞种子cellseed已通过鉴定证明适用于生物制品生产或检测的，来源于人或动物的，由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养以及基因工程构建的均一细胞群体。主细胞库mastercellbank；MCB由细胞种子培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备获得并分装于容器的同质和均一的悬液。工作细胞库workingcellbank；WCB由主细胞库的细胞经培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备并分装于容器的同质和均一的悬液。2T/SHQAP019—2025原材料rawmaterial生物制品生产过程中使用的所有生物材料和化学材料。辅料excipient生物制品在配制过程中所使用的辅助材料。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AFP：甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein）ALB：白蛋白（Albumin）ASGR1：去唾液酸糖蛋白受体1（AsialoglycoproteinReceptor1）CD：分化簇（ClusterofDifferentCFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster）Fix/PermKit：固定/通透化试剂盒（Fixation/PermeabilizationSolutionKit）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）GMP：药品生产质量管理规范（GoodManufacturingPractice）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HGF：肝细胞生长因子（HepatocyteGrowthFactor）HIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HNF4α：肝细胞核因子4α（HepatocyteNuclearFactor4Alpha）IL-2：白细胞介素-2（Interleukin-2）LAC：白细胞活化混合液（LeukocyteActivationCocktail）MMP1：基质金属蛋白酶-1（MatrixMetalloproteinase-1）PBMC：外周血单个核细胞（PeripheralBloodMononuclearCells）PHA：植物血凝素（Phytohemagglutinin）RPMA：反相蛋白质微阵列技术（ReversePhaseProteinMicroarray）TNF-α：肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor-alpha）TP：梅毒螺旋体（TreponemaPallidum）5原材料和辅料5.1起始原材料的来源应符合法律法规和伦理要求。起始原材料供者应签署书面的合法有效的知情同意书，并建立起始原材料数据库，保护供者隐私信息。5.2应建立和执行供者评估及筛选方法，供者应至少筛查HBV、HCV、HIV、TP，结果应均为阴性。筛查。5.4应建立和执行组织或细胞的采集、运输、交接与储存方法。3T/SHQAP019—20255.5用于人肝前体细胞消化分离培养的容器、清洗液、灌注液、消化液、运输液、培养基等辅料应符合相关的质量要求，应包括但不限于供应商资质审核认证、产品质量报告和批次检验报告等。5.6不宜使用动物血清或其他动物源成分，如应该使用，应确认无特定动物源性病毒感染。6制备的一般要求6.1人肝前体细胞培养所需的基础设施和环境条件，应依据GMP及其附录、《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》生物安全要求，满足产品质量控制需要的洁净条件并避免微生物污染和交叉污染。6.2制备方应对制备操作人员进行培训，建立考核标准，人员培训考核合格后，方可进行制备操作。6.3制备方宜建立人肝前体细胞的细胞种子库、主细胞库和/或工作细胞库。6.4在一个制备周期中，同一供者来源、同一WCB来源、同一生产线、同一工艺制备、同一代次、同一天收获、质量均一的产品为一批。6.5人肝前体细胞应长期于-130℃以下的环境冻存，并有相应的冻存记录，冻存记录内容至少应包含6.6人肝前体细胞的制备应有标准操作规程，制备过程应符合标准操作规程的要求。信息。6.8人肝前体细胞培养或使用时，细胞代次不应超过限定代次。6.9企业应建立产品标识和追溯系统，应采用经验证的计算机化系统，实现对产品从供者到患者或从患者到供者的双向追溯。7技术要求人肝前体细胞应符合表1中的技术要求。表1人肝前体细胞技术要求类别项目技术要求理化性质外观为均一的细胞混悬液可见异物无可见异物6.0~8.0渗透压摩尔浓度900mOsmol/kg~1200mOsmo细胞活性细胞活率解冻后，细胞活率≥80.0%细胞鉴别细胞形态细胞贴壁生长，上皮样，卵圆形或多边形细胞标志蛋白ALB+、HNF4α+、CD44+、CD90+应≥90.0%CD34+、CD45+应≤2.0%染色体检查（500）染色体核型染色单体和染色体断裂≤26结构异常≤10超二倍体≤5亚二倍体≤904T/SHQAP019—2025表1人肝前体细胞技术要求（续）类别项目技术要求细胞鉴别染色体检查（500）多倍体≤17细胞功能可溶性因子分泌水平MMP1≥1500pg/mLHGF≥1500pg/mL免疫原性HLA-DR，DP，DQ+应≤2.0%淋巴细胞增殖抑制试验抑制淋巴细胞增殖淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验抑制淋巴细胞分泌TNF-α生物安全性异常毒性检查动物全部健存且无异常反应，体重增加微生物安全性无菌检查阴性支原体检查阴性细菌内毒素检查<1.0EU/mL成瘤性软琼脂克隆形成试验无阳性克隆团形成8检验方法采用目视法，在自然灯下进行外观检查。8.2可见异物按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部0904可见异物检查法第一法灯检法进行试验。按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部0631pH值测定法进行试验。8.4渗透压摩尔浓度按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部0632渗透压摩尔浓度测定法冰点下降法进行试验。8.5细胞活率按照附录A进行试验。8.6细胞形态人肝前体细胞二维贴壁培养条件下，采用显微镜进行细胞形态观察。8.7细胞标志蛋白按照附录B进行试验。5T/SHQAP019—2025采用G分带技术，按照《中华人民共和国药典》（2025年版）三部0234生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制，对500个细胞中50个分裂中期细胞染色体带型进行检查。8.9可溶性因子分泌水平按照附录C进行试验。8.10免疫原性按照附录B进行试验。8.11淋巴细胞增殖抑制试验按照附录D进行试验。8.12淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验按照附录D进行试验。8.13异常毒性检查采用小鼠试验法和豚鼠试验法，按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则1141异常毒性检查法进行试验。8.14无菌检查按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则1101无菌检查法进行试验。8.15支原体检查按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则3301支原体检查法进行试验。8.16细菌内毒素检查按照《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则1143细菌内毒素检查法进行试验。8.17软琼脂克隆形成试验按照附录E进行试验。9检验规则9.1抽样方法在同一批次制备的细胞中，按照企业自建抽样规则随机取样。9.2检验每批次产品应进行放行检验，检验项目包括第7章中规定的所有项目，并附签字盖章的检验报告。6T/SHQAP019—20259.3判定规则使用符合第5章要求的原材料和辅料，制备过程符合第6章的要求，且放行检验项目全部符合第7章技术要求时，判为批合格；有1项及以上不符合要求时，判为批不合格。10.1包装标签的文字表述应以说明书为依据，不应超出说明书内容，不应加入无关的文字和图案。10.2应在人肝前体细胞产品包装上规定的位置进行信息标注，标注内容至少应包括细胞名称、规格、制备批号、储存条件、制备日期、有效期及制备商。11.1.1人肝前体细胞包装材料和容器应符合《中华人民共和国药典》（2025年版）的要求。11.1.2标签应与容器贴实，不易脱落，标签内容不应用粘贴或剪贴的方式进行修改或补充。直接印字的制品字迹应清楚。11.1.3外包装箱标签应包括细胞名称、制备批号和有效期，字迹清楚，不易脱落和模糊。11.2.1人肝前体细胞应存放在专用的、经验证且符合标签中储存条件要求（-130℃以下）的设备或设施中，仓储区应配备用于冷藏设备或设施的温度监控系统。11.2.2储存、运输设施设备应定期进行检查、清洁和维护，并建立记录和档案。11.2.3储存期间，人肝前体细胞应始终处于静置状态。11.3.1应根据细胞的使用要求，选择合适的承运机构。承运机构应具备相应的运输资质，如质量管理体11.3.2冻存的细胞应在低于-130℃条件下运输，非冻存细胞应在2℃~8℃条件下运输。细胞运输时的介质应能保证细胞质量。11.3.3用于运输的冷链设施或设备应进行验证，并定期进行再验证，应由专人负责对冷链运输设施设备进行定期检查、清洁和维护，并建立记录和档案。11.3.4应确保在运输过程中不经过X光辐射，不倾倒、重摔、混淆，全程不应打开冷链包装。11.3.5应全程记录细胞运输过程，包括但不限于细胞运输的方式、条件、路径、时间、人员、接收地址及细胞信息。12废弃物处理12.1剩余的原材料、不合格原材料以及废弃组织的处理，应符合伦理规范要求。12.2人肝前体细胞制备和检验过程中产生的不合格细胞和检验剩余细胞应有完整的废弃物暂存、运输记录，并选择有资质的废弃物处理机构。7T/SHQAP019—202512.3人肝前体细胞制备和检测过程中不合格的细胞、剩余废弃的细胞或组织，应在灭菌/灭活后，进行合法且符合伦理的处理。12.4人肝前体细胞制备和检验过程中产生的废弃物，需按照医疗废弃物进行分类处置，应符合生物安全的要求。8T/SHQAP019—2025（规范性）细胞活率——细胞计数法A.1仪器和设备荧光细胞分析仪应按照JJF1665的要求进行仪器校准。A.2试剂A.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检验用水应为符合GB/T6682要求的一级水。A.2.2磷酸盐缓冲液，pH值应为7.2~7.4。A.2.3能分辨活细胞和死细胞的染色液。A.3检测步骤A.3.1细胞悬液制备收集待检验细胞，用磷酸盐缓冲液（A.2.2）制备细胞悬液。A.3.2细胞染色将细胞悬液（A.3.1）与染色液（A.2.3）按照染色液说明书推荐的比例混合均匀。A.3.3细胞计数取混合均匀的细胞染色样品（A.3.2）上样至计数板，于荧光细胞分析仪（A.1.1）上读取活细胞密度和细胞活率。A.3.4计算与分析细胞活率（%）、活细胞密度（个细胞/mL）由仪器生成。A.3.5精密度在重复性条件下进行两次独立测定，两次检测结果的绝对误差应不超过其算术平均值的10%。9T/SHQAP019—2025（规范性）细胞标志蛋白及免疫原性测定——流式细胞术B.1仪器和设备B.1.1流式细胞仪流式细胞仪应符合YY/T0588的要求，至少具有红色、蓝色发射光，配备所使用的荧光通道相应的带通滤片。B.1.2水平离心机水平离心机应符合GB19815的要求。B.2试剂B.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检验用水均为符合GB/T6682要求的一级水。B.2.2磷酸盐缓冲液，pH值应为7.2~7.4。B.2.4含有4%多聚甲醛的组织固定液，于2℃~8℃保存。B.2.5含有0.5%曲拉通X-100缓冲液的磷酸盐缓冲液，即穿膜液，于2℃~8℃保存。B.2.6含0.3mol/L甘氨酸和10%羊血清的磷酸盐缓冲液，即封闭液，于2℃~8℃保存。B.3样品保存样品于2℃~8℃避光保存。B.4检验步骤B.4.1样品准备收集细胞样品，水平离心机（B.1.2）离心后弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（B.2.2）洗涤一遍样品，再用B.4.2抗体孵育B.4.2.1细胞表面标志抗体孵育选择细胞标志蛋白对应的抗体及同型对照抗体（B.2.3按照供应商提供的抗体说明书稀释抗体，稀释后的抗体与样品（B.4.1）混匀后，于适当条件孵育。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（B.2.2）B.4.2.2细胞内标志抗体孵育T/SHQAP019—2025清液。固定后的样品中加入穿膜液（B.2.5）重悬沉淀细胞，室温孵育后，水平离心机（B.1.2）离心，弃去上清液。穿膜后的样品中加入封闭液（B.2.6）重悬沉淀细胞，室温孵育后，水平离心机（B.1.2）离心，弃去上清液。按照说明书稀释细胞标志蛋白对应的抗体及同型对照抗体（B.2.3抗体与封闭后的样品混匀后，于适当条件孵育。孵育结束后用磷酸盐缓冲液（B.2.2）洗涤细胞，水平离心机（B.1.2）离心，弃去上清液。B.4.3重悬上机使用磷酸盐缓冲液（B.2.2）重悬细胞沉淀，流式细胞仪（B.1.1）上机检验。B.4.4圈门策略B.4.4.1建立散点图，横坐标：FSC-A，纵坐标：SSC-A，圈出目标细胞群，命名为Cells，排除细胞碎片和多细胞聚团。B.4.4.2建立散点图，横坐标：SSC-H，纵坐标：SSC-A，来源于细胞群Cells，命名为SingleCells。同型对照抗体组作为阴性对照，根据其荧光强度，在分群Cells的基础上圈出细胞群，排除没有被荧光抗体标记的阴性细胞和黏连细胞。B.4.4.3建立直方图，横坐标为细胞标志物标记的荧光素通道，来源于细胞群SingleCells，圈出阳性细胞群，细胞标志蛋白的阳性比例以百分数显示。T/SHQAP019—2025（规范性）细胞功能指标——ELISA法C.1仪器和设备C.1.1多功能酶标仪多功能酶标仪应能进行试剂盒推荐的波长检验。C.1.2水平离心机水平离心机应符合GB19815的要求。C.2试剂MMP1检测试剂盒、HGF检测试剂盒。C.3样品保存C.3.1试验组为人肝前体细胞培养3d的细胞上清液，于-60℃~-85℃保存。C.3.2对照组为人肝前体细胞培养用培养基，于2℃~8℃保存。C.4检验步骤C.4.1样品准备收集不少于2mL的人肝前体细胞培养3d的细胞上清液（C.3.1）于离心管中，用水平离心机（C.1.2）离心后取上清液，于-60℃~-85℃保存。C.4.2样品检测C.4.2.1按照试剂盒使用说明书推荐，将标准品稀释至推荐的标准曲线使用浓度。C.4.2.2将稀释后的标准品和样品加入试剂盒提供的检测板内与包被板底的一抗共孵育，孵育完成后清洗检测板，去除残留洗涤液。C.4.2.3与带有荧光标记的二抗共孵育，孵育完成后清洗检测板，去除残留洗涤液。C.4.2.4检测板内加入显色剂，充分反应。C.4.2.5根据试剂盒使用说明书中推荐检测波长，使用多功能酶标仪（C.1.1）进行检测。C.4.3计算根据标准曲线获得的样品浓度与酶标仪读数换算公式，将样品的酶标仪读数带入公式计算，得到对应的样品浓度。T/SHQAP019—2025（规范性）免疫调控——流式细胞术D.1仪器和设备D.1.1荧光细胞分析仪荧光细胞分析仪应按照JJF1665的要求进行仪器校准。D.1.2流式细胞仪流式细胞仪应符合YY/T0588的要求。D.1.3水平离心机水平离心机应符合GB19815的要求。D.2试剂D.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检验用水均为符合GB/T6682要求的一级水。D.2.2磷酸盐缓冲液，pH值应为7.2~7.4。D.2.3消化酶，应选择重组蛋白酶。D.2.4能分辨活细胞和死细胞的染液。D.2.5含多种细胞生长所需的因子，对细胞的增殖和代谢具有支持作用的FBS。D.2.6活性不低于1×107U/mg的IL-2。D.2.7TNF-α,应为抗人单克隆抗体。D.2.8PHA、CFSE、LAC、Fix/PermKit。D.2.9RPMI1640完全培养基：移取1mLFBS加入8.99mLRPMI1640培养基中，充分混匀。D.3淋巴细胞增殖抑制试验步骤D.3.1样品组别试验样品分为试验组、阴性对照组、阳性对照组、空白对照组。D.3.2样品制备D.3.2.1将人肝前体细胞接种在细胞培养板中，过夜培养。D.3.2.2PBMC复苏后计数，并按照CFSE试剂盒说明书推荐量进行染色，染色结束后使用添加了IL-2、PHA的RPMI1640完全培养基重悬细胞。D.3.2.3取出过夜培养的人肝前体细胞，弃掉细胞培养板中培养基，加入染色并活化后的PBMC作为试验组；染色并活化的PBMC作为阳性对照组；染色但未活化的PBMC作为阴性对照组；活化但未染色的PBMC作为空白对照组，于适当条件培养3d~4d。T/SHQAP019—2025D.3.3样品检测混匀细胞培养板中的细胞，并转移至流式检测管中，水平离心机（D.1.3）离心，弃上清液；用磷酸盐缓D.3.4数据分析根据细胞大小和颗粒度设门，圈出目标细胞群，排除细胞碎片和多细胞聚团；根据阴性对照和空白对照圈出目的细胞的增殖信号。D.4淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验步骤D.4.1样品制备D.4.1.1将人肝前体细胞接种在细胞培养板中，过夜培养。D.4.1.2PBMC复苏后计数，并按照CFSE试剂盒说明书推荐量进行染色。D.4.1.3取出过夜培养的人肝前体细胞，弃掉细胞培养板中培养基，加入染色的PBMC作为试验组，两孔加入染色后的PBMC，分别用作阳性对照和同型对照，于适当条件过夜培养。D.4.1.4培养结束后加入适量LAC刺激剂并孵育，孵育后使用Fix/PermKit进行PBMC的固定和破膜，再加入抗人TNF-α抗体及其同型对照并孵育。D.4.2样品检测孵育结束后，混匀细胞并转移至流式检测管中，水平离心机（D.1.3）离心，弃上清液；用磷酸盐缓冲液流式细胞仪（D.1.2）上机检测。D.4.3数据分析根据细胞大小和颗粒度设门圈出目标细胞分群，排除细胞碎片和多细胞聚团；根据同型对照圈出目的细胞阳性区域。D.5计算式中：X——促进率/抑制率；Y1——供试品CFSE阳性结果，%；式中：T/SHQAP019—2025M——促进率/抑制率；N1——供试品TNF-α阳性结果，%；N0——阳性对照TNF-α阳性结果，%。T/SHQAP019—2025（规范性）成瘤性——软琼脂克隆形成试验E.1仪器和设备E.1.1电子天平电子天平应符合GB/T26497的要求。E.1.2荧光细胞分析仪荧光细胞分析仪应按照JJF1665的要求进行仪器校准。E.1.3水平离心机水平离心机应符合GB19815的要求。E.1.4倒置显微镜倒置显微镜应符合GB/T22062—2020的要求。E.1.5灭菌锅灭菌锅应按照JJF1308—2011的要求进行温度计校准。E.2试剂E.2.1除另有说明外，所有试剂均为分析纯，检验用水均为符合GB/T6682要求的一级水。E.2.2磷酸盐缓冲液，pH值应为7.2~7.4。E.2.3能分辨活细胞和死细胞的染液。E.2.4