CN119487054A 用于预防和治疗狂犬病毒感染的组合物和方法 （瑞普利科特生物科学公司）

2024.12.06PCT/US2023/0656772023.04.12WO2023/201263EN2023.10.19用于预防和治疗狂犬病毒感染的组合物和且特别涉及编码经修饰的甲病毒病毒基因组或述核酸分子的重组细胞和药物组合物以及此类21.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码经修饰的甲病毒基因组或自我复制RNA序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体或两者中任一者的2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述抗原决3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述抗原4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述抗原决定簇包含所述RABV_G的抗原位5.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述包膜糖蛋白G是毒性狂犬病毒6.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述包膜糖蛋白G是选自以下的狂7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述包膜糖蛋白G是FluryLEP株的包膜糖8.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述多肽构建体包含稳定所述9.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述经修饰的甲病毒基因组或10.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中编码所述多肽构建体的核酸序列12.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述经修饰的甲病毒基因组或srRNA是属于VEEV/EEEV/WEEV组、或SFV组或SINV组的甲病毒的经修饰的甲病毒基因组或马脑炎病毒(EEEV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、西方马脑炎病毒(WEEV)或辛德比斯病毒314.根据任一前述权利要求所述的核酸构建体，其中所述核酸序列与选自SEQIDNO:17.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和根据权利要求1_18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中将所述组合物用递送媒介物配制到递送系统中，其中所述递送系统包括脂质体、病毒复制子颗粒(VRP)、基于脂质的纳米颗粒20.根据权利要求18_19中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质以脂质与RNA约21.根据权利要求18_20中任一项所述的药物组合22.根据权利要求18_21中任一项所述的药物组合24.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答或治疗狂犬病感染的方法，所述方法包括27.根据权利要求26所述的方法，其中所述中和抗体应答包含大于0.5IU/mL的中和抗法)单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地4[0001]本申请要求2022年4月13日提交的美国专利申请号17/720,002的优先权，将文献以及此类核酸分子、重组细胞和组合物用于在细胞培养物或活体中产生所需产物的用途。还提供了用于引发有需要的受试者的免疫应答的方法，以及用于预防和/或治疗狂犬病毒成威胁。在没有暴露后预防的情况下出现临床症状发作后，这种疾病总是致命的(WHOepidemiologicalrecord2010.32期(85):309_320.Rabiesvaccine:WHOpositionpaper)。WHO预计每年有55000例狂犬病相关死亡，并且超过1000万人接受暴露后治疗可靠。WHO不建议使用神经组织疫苗，并且强烈鼓励向贫困群体增加现代高质量疫苗的供5[0009]本文提供的公开文本提供了对先前生产狂犬病疫苗的尝试中存在的问题的解决文本的一些实施方案提供了含有编码经修饰的甲病毒基因组或自我复制RNA(srRNA)的序列的核酸构建体，其中编码所述经修饰的甲病毒基因组或srRNA的病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体或两者中任一者的抗(c)本公开文本的药物组合物。本公开文本的特定方面进一步提供了用于制RNA(srRNA)的核酸序列的核酸构建体，其中编码所述经修饰的甲病毒基因组或srRNA的病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变[0015]在一些实施方案中，所述包膜糖蛋白G是毒性狂犬病毒株或无毒性狂犬病毒株的[0016]在一些实施方案中，所述包膜糖蛋白G是选自以下的狂犬病毒株的包膜糖蛋白G：6[0018]在一些实施方案中，所述经修饰的甲病毒基因组或srRNA不包含编码病毒结构蛋[0019]在一些实施方案中，编码所述多肽构建体的核酸序列可操作地连接至启动子序[0020]在一些实施方案中，所述经修饰的甲病毒基因组或srRNA是属于VEEV/EEEV/WEEV[0021]在一些实施方案中，所述核酸序列与选自SEQIDNO:6_11的核酸序列具有至少为第一疗法与至少一种另外的疗法组合地施用本的原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图获得对本公开文本的特征和优点[0027]图1是示出来自编码狂犬病毒糖蛋白(RABV_G)的不同srRNA载体的RNA复制的条形[0028]图2是示出来自不同srRNA载体的狂犬病毒糖蛋白(RABV_G)的相对表达的条形7剂量srRNA_RABV_G(0.15ug)后14天通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测量的中和抗体应答。被认为具有保护性的0.5IU/ml的中和抗体滴度用蓝线描绘。示出了统计数据(**<时间内使用3剂方案来引发免疫保护并且由于免疫应答的持久性差需要定期接种加强针的细胞中表达包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体或两者中任一者的抗原决定簇组或srRNA的病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G供了重组细胞，所述重组细胞经基因工程化以包含本文公开的核酸分子中的一种或多种。要的受试者中引发免疫应答或治疗狂犬病感染的领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。8或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括例如，Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(第1_3卷,1992)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)；Pickar,DosageCalculations(1999)；以及Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版,2003,Gennaro编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。9基酸序列的不连续部分可以由上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。如果根据上下文原本不清楚近似程度，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的用采用如下所述的默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,NucleicAcidsRes.12:387,析软件采用其默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter(大学大道1710号，威斯康星州麦迪逊，53705)的GeneticsComputerGroup的序列分析案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中[0053]nsP1蛋白是具有鸟嘌呤一7一甲基转移酶(MTase)和鸟苷酸转移酶(GTase)活性的末端结构域中的MTase基序催化甲基从S一腺苷甲硫氨酸(AdoMet)转移到GTP分子的N7位置白与细胞膜缔合的特征。α螺旋两亲性环和棕榈酰化位点的存在允许nsP1蛋白和含有nsP1的复制复合物可能通过nsP1与膜阴离子磷脂的相互作用锚定在质[0054]nsP2蛋白具有多种酶活性和功能作用。N末端区域含有具有超家族1(SF1)解旋酶确定为仅负责病毒复制复合物的RNA合成特性。RdRp通过负链RNA参与基因组RNA的复制以[0057]甲病毒基因组的5'端三分之二编码病毒RNA转录和复制所必需的多种非结构蛋白处的切割会影响基因组复制期间RNA模板的使用。此位点位于狭窄的裂口的底部并且不易心核衣壳蛋白C和作为异二聚体缔合的包膜蛋白P62和E1)的翻译模板。病毒膜锚定的表面3'端处的p26S亚基因组启动子转录。P62向E2和E3的蛋白水解成熟会导致病毒表面发生变组RNA的5'端被翻译成具有RNA聚合酶活性的多蛋白(nsP1_4)，其产生与基因组RNA互补的将负链分别用作产生以下两种RNA的模板：(1)与通过翻译产生其他nsP的次级病毒的基因的细胞内引导其自身的自我扩增或自我复制所需的所有遗传信息。为了引导其自身的复制和转录所需的顺式作用RNA序列。这些序列可以在复制过程中与其自身编码的蛋白质或种或多种5'病毒或缺陷型干扰RNA序列、编码生物活性甲病毒非结构蛋白(例如，nsP1、任何已知的、天然存在的甲病毒的srRNA的长度不同。在本公开文本的一些实施方案中，(糖蛋白)和L(RNA依赖性RNA聚合酶)。位于基因组3'和5'端的前导和尾非翻译区位于结构蛋白的核酸序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体或两者中任一者的抗原决定簇的多肽构建体的编码序列替代。还提供了重组细胞和细胞培养物，所述重组细胞和细胞培养物已经被工程化以包括如本文公开毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分已被包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体[0068]本公开文本的核酸分子可以具有以下任何[0069]本公开文本的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，甲病毒srRNA载体缺乏编码甲病毒srRNA载体的病毒结构蛋白CP、[0070]在一些实施方案中，甲病毒srRNA载体缺乏编码一种或多种病毒结构蛋白的核酸[0072]在一些实施方案中，甲病毒srRNA载体包含含有CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQIDNO:2)的序列。在一些实施方案中，甲病毒载体包含含有载体包含含有CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQIDNO:2)的序列和含有GACCGCTACGCCCCAATGACCCGACCAGC(SEQIDNO:3)的序列。替代编码经修饰的甲病毒基因组或srRNA的病毒结构蛋白的核酸序列的至少一部分。原则其包含编码序列和足够的调节信息以引导细胞中编码序列的适当体内和/或离体转录和/或翻译。可以将多肽构建体的编码序列插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或受试列或其他核酸序列的组合)可操作地连接的编码蛋白质的基因或[0074]本文所述的核酸构建体包括狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)、其变体或两者中任一者的抗原决定簇的编码序列，所述编码序列编码含有能够引发免疫应答的表位的多肽。RABV_G的变体可以涵盖如下多肽的编码序列，所述[0075]本文所述的核酸构建体还可以包含狂犬病毒的包膜糖蛋白G(RABV_G)或其抗原决功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接促进相互作用的亲和力的那些残基。抗体抗性病毒变体的组套鉴定。大多数狂犬病毒中和单克隆抗体是针对抗原位点II不连续构象表位(Prosniak等人2003.Developmentofacocktailofrecombinant_expressedhumanrabiesvirus_neutralizingmonoclonalantibodiesforaa330至338的连续构象表位，并且含有影响病毒致病性的两个带电残基K330和R333(Coulon等人1998.Anavirulentmutantofrabiesvirusisunabletoinfectmotoneuronsinvivoandinvitro.J.Virol.72:273_278；Dietzschold等人1983.Characterizationofanantigenicdeterminantoftheglycoproteinthatcorrelateswithpathogenicityofrabiesvirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:70_74；Seif等人1985.Rabiesvirulence:effectonpathogenicityandsequencecharacterizationofrabiesvirusmutationsaffectingantigenicsiteIIIof义，位于aa231处(Benmansour等人,“AntigenicityofRabiesVirusGlycoprotein,”J.Virol.65:4198_4203(1991)；Lafon等人1983.AntigenicsitesontheCVSrabiesvirusglycoprotein:analysiswithmonoclonalantibodies.J.Gen.Virol.64:843_8451)。已知抗原位点IV含有重叠的线性表位(Bunschoten等人,1989.Characterizationofanewvirus_neutralizingepitopethatdenotesasequentialdeterminantontherabiesvirusglycoprotein.J.Gen.Virol.70:291_298；Luo等人1997.Avirus_neutralizingepitopeontheglycoproteinofrcharacterizationofasequentialepitopeontherabiesvirusglycoproteinRG719.Microbiol.Immuno[0082]无毒性狂犬病毒株通常包括包膜糖蛋白G中的一个或多个突变(参见例如Flamand(1998))。举例来说，从激发病毒标准株(CVS)、CVS衍生物或Street_Alabama_Dufferin(SAD)Bern株分离的RABV_G的抗原突变体是无毒性的，所述抗原突变体G中位置333处的精酸替代，(Tuffereau等人,Arginineorlysineinposition333ofERAandCVSglycoproteinisnecessaryforrabiesvirulenceinadultmice.Virology.1989；172:206_212；Seif等人,Rabiesvirulence:effectonpathogenicityandsequencecharacterizationofrabiesvirusmutationsaffectingantigenicsiteIIIof代的重组病毒也是无毒性的(McGettigan等人,Second_generationrabiesvirus_basedvaccinevectorsexpressinghumanimmunodeficiencyvirustype1gaghave合物和方法的狂犬病毒株的非限制性例子包括FluryLEP株、FluryLEP_C株、FluryHEPON_99_2株、SAD_B19株、SH06株、SHRBV_18株、SNK_CTN株、SRV9株、StreetAlabamaMVPQVLLFVPLLGFSLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNEFSYMELKVGYISAIKVNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVTDLDPYDKSRVFPGGNCSGITVSSTYCSTNHDYTIWMPENLRLGTSCDIFTNSRGKRAFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSDETKWCPPGDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGSDGMQSSLLQQHMELLESSVIPLMHPLADPSTVFKDGDEVEDFVEVHLPDVHEQVSLGLPNWGKYVLMIAGALIALMLIIFLMTCCRRVNRPESTQSSLGETG[0085]在一些实施方案中，本文所述的核酸构建体中的RABV_G的编码序列编码SEQID的核酸构建体包含编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的RABV_G的核酸序列，其中SEQID序列的至少一个碱基用不同的碱基取代而不会导致由所述基因产生的多肽的氨基酸序列优选的密码子构建编码基因的合成核酸序列的技术可以通过本领域熟知的技术通过分析编码宿主细胞基因组的天然蛋白质的密码子使用的简并性及其相对丰度的计算方法来确子优化工具(/CodonOpt)或优化器在线密码子优化工具(http://在本公开文本的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可能会影响例如LeppekK.等人,CombinatorialoptimizationofmRNAstructure,stability,andtranslationforRNA_basedtherapeutics.bioRxiv.(Preprint).2021年3月30日.doi:10.1101/2021.03.29.437587中找[0089]可以将本公开文本的核酸构建体引入宿主细胞中以产生含有所述核酸分子的重定整合可以使用经典随机基因组重组技术或更精确的基因组编辑技术(如使用指导RNA引胞系的更多信息可以在例如LynnD.E.,Availablelepidopteraninsectcell组合物和方法的示例性蚊子细胞系包括来自以下蚊子物种的细胞系：埃及伊蚊(Aedes斯氏按蚊(Anophelesstephensi)、白魔按蚊(Anophelesalbimanus)、致倦库蚊(Culextritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(Culexbitaeniorhynchus)和安邦巨蚊各样的上文提到的宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。[0095]所公开的用于产生重组多肽的方法的非限制性示例性实施方案可以包括以下特重组多肽。[0098]本公开文本的药物组合物的非限制性示例性实施方案可以包括以下特征中的一体)隔离在局部沉积物中来保护抗原免受快速扩散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨[0101]在一些实施方案中，本公开文本的核酸构建体可以通过基于脂质的纳米颗粒[0102]适用于本文所述的组合物和方法的脂质可以是阳离子脂质、可电离的阳离子脂约30Mol在其他实施方案中，约40Mol在其他实施方案中，约45Mol在其他实施方[0104]适用于本公开文本的组合物和方法的示例性可电离脂质包括以下中描述的可电离脂质：PCT公开案WO2020252589A1和WO2021000041A1、美国专C12_200与胆固醇、C14_PEG2000和DOPE组合。在一些实施方案中，C12_200与DSPC和DMG_[0107]在一些实施方案中，本公开文本的LNP包括至少一种脂质。合适的脂质包括C12_[0108]在一些实施方案中，LNP递送系统中脂质与核酸的质量比是约100:1至约3:1、约磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰_磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油1_反式PE、1_硬脂酰_2_油酰_磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2_二反油酰基_sn_甘油_3_磷酸乙组合使用。[0118]在一些实施方案中，所述免疫原性组合物基本上是非免疫原性或最小免疫原性和/或药物组合物掺入到治疗剂中以用于治疗患有、疑似患有或者可能有高风险患上狂犬干扰素γ(IFNγ)。IFNγ的产生可以使用本领域已知的几种方法来测量，包括而不限于核酸构建体后14天通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)来测量。中和抗体应答也可以通过向动物(例如，小鼠或非人灵长类动物)注射本文所[0126]在另一个方面，本文提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的狂犬病感染的酸或碱(如磷酸二氢钠和/或磷酸二钠、盐酸或氢氧化钠)来调节pH(例如，调节至约7.2_的核酸构建体或重组多肽的治疗有效量(例如有效剂量)取决于所选择的核酸构建体或重疾病进展停止或至少减缓)来测量功效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或药物组合物)在治疗狂犬病感染中发挥作用的能力可以在用于人之前在合适的动物露后预防性疫苗接种预防来自狂犬病毒感染的疾病和死亡的CVS_26株、CVS_26(G_N204S)株、CYN1009D株、CYN1026D株、CYN1029D株、CYN1138D株、药物组合物以具有药学上可接受的载体的组合物并且以有效刺激免疫应答的量施用于受免疫应答所必需的剂量和并且经刺激受试者的免疫应答所必需的时间段施用初始系列的在制造和储存条件下必须也是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而单独地或作为第一疗法与至少一种另外的疗法(例如，第二疗法)组合地施用于所述受试[0138]本文还提供了用于实践本文所述方法的各种试剂盒以及用于制造和使用试剂盒种本公开文本的核酸构建体、重组细胞和/或重组多肽的一个或多个如上所讨论的皮下注但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识(第4版).ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborLaboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).MolecularCloning:ALaboratoryManual(第3版F.M.(1987).CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYorHuang,L.等人(2005).NonviralVectorsforGeneTherapy.SanDiego:AcademicPress；Kaplitt,M.G.等人(1995).ViralVectors:GeneTherapyandNeuroscienceMethodsManual:TheComprehensiveSourcebookofTechniques.SanDiego,CA:AcademicPress；Doyle,A.等人(1998).CellandTissueCulture:Laboratory(1994).PCR:ThePolymeraseChainReaction.Boston:BirkhauserPublisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:ALaboratoryManual(第2版).NewYork,NY:ColdSpringHarborLaboratoryPress；Beaucage,S.L.等人(2000).CNucleicAcidChemistry.NewYork,NY:Wiley,(包括至2014年的补充)；以及Makrides,S.C.(2003).GeneTransferandExpressioninMammalianCells.Amsterdam,NL:[0152]本实施例描述了为构建基础甲病毒载体(例如，不含目的异源基因)而进行的实[0153]基础EEEV载体(即不含目的异源基因)构建如下：从具有几个修饰的参考序列(GenbankEF151502)以四个约4kb的部分(TwistBioscience)从头合成基础EEEV载体。掺与结构多蛋白ATG起始密码子的位置匹配，并且3'T与结构多蛋白终止密码子TAA的位置匹插入SpeI位点的下游，用于随后的GibsonAssembly8程序(Gibson等人,Nat.Methods6,4)包含在EEEV基因组序列的上游，并且下游含有聚(A)序列，随后是切割识别位点上游的SapI位点。紧邻SapI位点下游的是T7终止子序列(5’_AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT_在五件式GibsonAssembly8反应(线性化的pYL骨架和四个合成片段)中合并以产生EEEV3’)的参考序列(GenbankAF369024)以四个约4kb的部分(TwistBioscience，ThermoFisherGeneArt)从头合成基础CHIKVS27载体，所述独特的限制性酶切位点替代CHIKV结AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT_3’；SEQIDNO:5)，随后是独特的限制性酶切位点架和四个合成片段)中合并以产生CHIKVS头合成基础SINVGirdwood载体，所述独特的限制性酶切位点替代SINV结构基因的编码序与结构多蛋白的终止密码子TGA的位置匹配)。将噬菌体T7RNA聚合酶启动子(5’_AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT_3’；SEQIDNO:5)，随后是独特的限制性酶切位点骨架和四个合成片段)中组合以产生SINVGirdwo[0157