CN119487179A 培养细胞片及其制造方法、化合物或药物的评价方法、以及培养细胞片的品质评价方法 （王子控股株式会社）

2025.01.03PCT/JP2023/0248662023.07.05WO2024/010020JA2024.01.11本发明的课题在于提供不使用特定的药剂且由心肌细胞构成的成熟化的培养细胞片及其辅肌动蛋白抗体检出的棒状结构体的长度方向的频率、即根据下述式(1)求得的取向度为23%状结构体的数量)/(棒状结构体的总数)×1002在对所述培养细胞片使用抗α一辅肌动蛋白抗体进行免疫染色并用显微镜观察得到的取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量要件A1：MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β要件A2：MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋要件B1：CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量与ACTB(β一肌动蛋白)的基因表达量之比要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与A所述制造方法包括使用细胞片形成用构件来培养心肌细所述细胞片形成用构件具备用于形成培养细胞各平坦部具有沿第一方向延伸的形状，并且所述3所述第一方向交叉的第二方向排列，各凹凸部包含填埋彼此相邻的所述平坦部之所述凹凸部在被彼此相邻的所述平坦部夹持的凹部的底面具备多个在细胞片形成用构件的厚度方向上，所述凹凸部中的前端面的12.一种化合物或药物的评价方法，其使作为评价对象的化合物或药物作用于权利要13.根据权利要求12所述的化合物或药物的评价方法，其对选自培养细胞片的生理学取向度(％)＝(众数值±15°以内所含的棒状结构体的数量(ii)在活细胞成像中，显示从运动矢量的众数值的角度起±5°的角度的矢量的数量要件A1：MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β要件A2：MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋要件B1：CKM(肌酸激酶，M型)的基因表达量与ACTB(β一肌动蛋白)的基因表达量之比要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与A(vi)将活细胞成像中所检出的收缩速度设为CV(m/sec)、松弛速度设为RV(m/sec)时，4(viii)构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化5iPS细胞等干细胞源性细胞的试验，可以消除因种属差异产生的药剂响应性的差异。特别需要使源自人iPS细胞等干细胞的心肌细[0009]专利文献1是通过使用特定的培养基而使之成熟为成体样心肌细胞，不能排除该培养基含有的成分对心肌细胞产生除成熟以外[0010]本发明的目的在于提供不使用特定的药剂且由心肌细胞构成的成熟化的培养细[0012]本发明的上述课题可以通过以6[0017]＜4＞根据＜13＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件A1及要[0020]＜5＞根据＜14＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件B1及要[0023]＜6＞根据＜15＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件C1～要Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为运亚基α1)的基因表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为0.87以[0028]＜7＞根据＜16＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件D1～要7[0031]要件D3：HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHA/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.75以[0032]要件D4：HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHB/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.95以[0033]＜8＞根据＜17＞中任一项所述的培养细胞片，其满足以下的要件E1～要表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比[0041]要件E8：BCL2(BCL2凋亡调节因子)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极化持续时间为600msec以上，并且8[0050]＜15＞一种培养细胞片的制造方法，其是＜114＞中任一项所述的培养细用构件的厚度方向上，前述凹凸部中的前端面的高度与前述平坦部的高度<114＞中任一项所述的培养细胞片。学特性的变化及运动功能的变化中的至少一代谢抑制剂及其他生理活性物质组成的组中的至少一种现有化合物或其[0054]＜19＞一种品质评价方法，其是由心肌细胞构成的培养细胞片的品质评价方法，9Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为运亚基α1)的基因表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第45天的任意天为0.87以[0072]要件D3：HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHA/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.75以[0073]要件D4：HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHB/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.95以表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比[0082]要件E8：BCL2(BCL2凋亡调节因子)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基[0088](xi)构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极[0089](xii)在测定细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，通过添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂，氧消耗速率与β氧化抑制剂添加前相比减少至胞片形成用构件的结构与浅底盘一同显示的立体图，(b)是放大显示细胞片形成用构件的[0096]图5是显示MYL3(肌球蛋白轻链3)基因的表达量与ACTB(β一肌动蛋白)基因的表达[0097]图6是显示MYH7(肌球蛋白重链7)基因的表达量与MYH6(肌球蛋白重链6)基因的表CKMT2(线粒体肌酸激酶2)基因及LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)基因的表达量的经时变化的图[0099]图72是显示CKM基因的表达量与ACTB(β肌动蛋白)基因的表达量之比(CKM/与ACTB基因的表达量之比(CKMT2/ACTB)以及LDHA基因的表达量与ACTB基因的表达量之比[0101]图7_4是显示CACNA2D1基因的表达量与ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚基α1)基因的表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)、KCNJ2基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)、KCNE1基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(KCNE1/ATP1A1)以及SCN5A基因的表达量与ATP1A1基因的表达量之比(SCN5A/ATP1A1)的经时[0102]图7_5是显示LPL(脂蛋白脂肪酶)基因、ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)基因、HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)基因及HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能[0103]图7_6是显示LPL基因的表达量与ACTB(β_肌动蛋白)基因的表达量之比(LPL/ACTB基因的表达量之比(HADHA/ACTB)以及HADHB基因的表达量与ACTB基因的表达量之比[0104]图7_7是显示PPARGC1A(PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)共激活子1α)基[0105]图7_8是显示PPARGC1A基因的表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)基因的表达量之比(PPARGC1A/HIF1A)、ESRRA基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(ESRRA/HIF1A)、VEGFA基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(VEGFA/HIF1A)以及APLN基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(APLN/HIF1A)的经EMCN(内皮粘蛋白)基因及BCL2(BCL2凋亡调节因子)基因的表达[0107]图7_10是显示FABP3基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(FABP3/HIF1A)、因的表达量之比(EMCN/HIF1A)以及BCL2基因的表达量与HIF1A基因的表达量之比(BCL2/[0112]图11_2是显示使用活细胞成像装置测定得到的收缩速度与松弛速度之比(CV/RV)[0113]图12是显示利用钙成像解析测定得到的在培养第5天的Duration、Interval及[0115]图14是显示利用活细胞成像解析测定得到的各化合物对培养细胞片的影响的图[0116]图15_1是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(E_4031)对培养细胞片的影响[0117]图15_2是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(奎尼丁)对培养细胞片的影响[0118]图15_3是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(西沙必利)对培养细胞片的影[0119]图15_4是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(异丙肾上腺素)对培养细胞片[0120]图15_5是显示利用钙成像解析测定得到的化合物(DMSO)对培养细胞片的影响的[0121]图16_1是显示利用活细胞成像解析测定得到的化合物(异丙肾上腺素)对培养第[0122]图16_2是显示利用活细胞成像解析测定得到的化合物(米力农)对培养第15天的[0123]图17是显示通过活细胞成像解析测定得到的化合物(多柔比星)对培养第15天的[0124]图18是显示由添加作为β氧化抑制剂的乙莫克舍引起的氧消耗速率的变化的图[0128]取向度(％)＝(众数值±15。以内所含的棒状体用直线进行标记，接着仅将所标记的直线作为图像进行保存，再使用解析软件(A_ZO_过使用以该方法培养出的细胞，从而能够实现源自人iPS细胞等的心肌细胞在创新药领域[0136]需要说明的是，只要在任一培养天数时上述式(1)所示的取向度满足上述范围即胞也可以是向患者等的成纤维细胞、血液细胞中导入转录因子而诱导成的诱导心肌细胞的心脏得到的原代培养(PrimaryCellCultu为这样的干细胞的具体例，可列举胚胎干细胞(EmbryonicStemCell、以下称为“ES细肌细胞优选为源自ES细胞或iPS细胞的心[0147]本实施方式的培养细胞片优选发生与心肌细胞的成熟化相伴随的特征性的基因表达量的变化。该特征性的基因表达量的变化例如记载于参考文献1(Circ.Res.2020AprPerKilobaseofexonperMillionmappedsequencereads)值。同样将总读段数设为100万并且用各基因的基因长进行了校正的片段数即FPKM(FragmentsPerKilobaseofexonperMillionmappedsequencereads)值、表示将各转录产物的读段数用基因长进行校正并且将总读段数设为100万时的转录产物数的TPM(TranscriptsPerMillion)值等[0150]本实施方式的培养细胞片优选MYL3(肌球蛋白轻链3)的基因表达量较多，在假定照上述参考文献1)，作为这样的同源异构体变化，已知有从MYH6(肌球蛋白重链6)向MYH7[0152]在本实施方式的培养细胞片中，MYH7基因的表达量与MYH6基因的表达量之比增加。在本实施方式的培养细胞片中，CKM基因的表达量在任一培养天数时优选为900TPM[0154]CKM基因与ACTB基因的表达量之比(CKM/ACTB)在任一培养天数时优选为1.80以[0155]在培养细胞片中，优选定位于线粒体的蛋白质即COX6A2(细胞色素C氧化酶亚基[0156]COX6A2基因与ACTB基因的表达量之比(COX6A2/ACTB)在任一培养天数时优选为[0159]在培养细胞片中，优选作为糖酵解系酶的LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量[0160]在本实施方式的培养细胞片中，LDHA基因的表达量在任一培养天数时优选为[0162]在培养细胞片中，优选与心肌钙离子通道的形成相关的CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)、与心肌钾离子通道的形成相关的KCNJ2(内向整流钾通道亚家族J成员替前述的ACTB而使用参与生成在细胞膜内外的Na+及K+梯度的ATP1A1(ATP酶Na+/K+转运亚assessmentofdrug_inducedeffectsoncontractilemotionpropertiesusinghumaninducedpluripotentstemcell_derivedcardiomyocytes,JournalofPharmacologicalandToxicologicalMethods,Volume105,Septem表达量在任一培养天数时优选为2100CPM以上，更优选为2200CPM以上，进一步优选为[0166]在本实施方式的培养细胞片中，KCNJ2基因的表达量在任一培养天数时优选为[0168]在本实施方式的培养细胞片中，KCNE1基因的表达量在培养第15天～第45天的任意天优选为50CPM以上，更优选为60CPM以上，进一步优选为70CPM以上，更进一步优选为[0170]在本实施方式的培养细胞片中，SCN5A基因的表达量在培养第15天～第45天的任肪酶)、定位于细胞内线粒体且与脂肪酸的β氧化相关的ACAT1(乙酰辅酶A乙酰转移酶1)、[0173]在本实施方式的培养细胞片中，LPL基因的表达量在培养第15天～第45天的任意[0175]在本实施方式的培养细胞片中，ACAT1基因的表达量在培养第30天～第45天的任[0177]在本实施方式的培养细胞片中，HADHA基因的表达量在培养第30天～第45天的任[0179]在本实施方式的培养细胞片中，HADHB基因的表达量在培养第15天～第45天的任心肌细胞的成熟化相关的雌激素相关受体ERR_α的ESRRA基因(雌激素相关受体α)、编码血[0184]PPARGC1A基因与HIF1A基因的表达量之比(PPARGC1A/HIF1A)在培养的任意天优选(参照Arany,etal.,HIF_independentregulationofVEGFandangiogenesisbythetranscriptionalcoactivatorPGC_1a,Vol4[0186]在本实施方式的培养细胞片中，ESRRA基因的表达量在培养第15天～第45天的任[0187]ESRRA基因与HIF1A基因的表达量之比(ESRRA/HIF1A)在培养的任意天优选为0.55[0188]在本实施方式的培养细胞片中，VEGFA基因的表达量在培养的任意天优选为[0189]VEGFA基因与HIF1A基因的表达量之比(VEGFA/HIF1A)在培养的任意天优选为0.65[0191]APLN基因与HIF1A基因的表达量之比(APLN/HIF1A)在培养的任意天优选为0.005[0192]在本实施方式的培养细胞片中，FABP3基因的表达量在培养的任意天优选为[0193]FABP3基因与HIF1A基因的表达量之比(FABP3/HIF1A)在培养的任意天优选为5.0[0194]在本实施方式的培养细胞片中ESM1基因的表达量在培养的任意天优选为5CPM以[0195]ESM1基因与HIF1A基因的表达量之比(ESM1/HIF1A)在培养的任意天优选为0.002[0196]在本实施方式的培养细胞片中，EMCN基因的表达量在培养第7天以后的任意天优[0197]EMCN基因与HIF1A基因的表达量之比(EMCN/HIF1A)在培养第7天以后的任意天优[0198]在本实施方式的培养细胞片中，BCL2基因的表达量在培养第7天以后的任意天优[0199]BCL2基因与HIF1A基因的表达量之比(BCL2/HIF1A)在培养第7天以后的任意天优[0202]使用基于膜电位选择性地标记线粒体的荧光色素以及选择性地标记核的荧光色[0203]作为基于膜电位选择性地标记线粒体的荧光色素，可例示ThermoFisher[0207]另外，测定上述每个细胞的线粒体的面积及线粒体的亮度时的细胞接种条件为6[0209]对于由心肌细胞构成的培养细胞片，可以检测与心肌细胞的收缩/松弛相伴的运矢量(速度、方向、数量)，由此能够进行心率(BR：beatingrate)、收缩速度(CV：[0211]relaxationvelocit[0229]构成本实施方式的培养细胞片的细胞的动作电位80％再极化持续时间优选为[0234]培养液中所含的氧被细胞摄取后，在通过线粒体的氧化磷酸化而产生ATP的路径[0237]在测定构成本实施方式的培养细胞片的细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧物或药物起作用来评价化合物或药物对心肌[0243]本实施方式的由心肌细胞构成的培养细胞片的制造方法包括使用特定的细胞片形成用构件来培养心肌细胞的步骤，细胞片形成用构件具备用于形成培养细胞片的表面，埋彼此相邻的前述平坦部之间的多个高度差结构，前述高度差结构的间距为100nm以上且[0244]如图1的(a)所示，细胞片形成用构件100例如为载置于浅底盘的培养皿110的片[0245]如图1的(b)所示，细胞片形成用构件100的表面111具备多个平坦部130和多个凹[0246]如图1的(c)所示，各平坦部130为沿一个方向即第一方向(图1的(c)的上下方向)延伸的平坦面。各平坦部130在表面111的整体上沿与第一方向正交的第二方向(图1的(c)列。[0247]从与表面111相对的方向来看，构成凹凸部140的各凸部141位于例如三角格子的[0249]从使心肌细胞的伸长方向与第一方向对齐的观点出发，凸部141的间距满足下述邻的平坦部130间的第二方向(短边方向)上的长度为凹凸[0253]平坦部130的宽度及凹凸部140的宽度为例如作为培养对象的细胞的大小(5μm以[0256]如图1的(d)所示，凹凸部140可以在彼此相邻的凸部141之间以及平坦部130与同的空间即凹部142在凹凸部140中沿第一方[0257]在细胞片形成用构件100的厚度方向上，凹部142的底面与平坦部130之间的长度平坦部130之间的高低差为边界高度差。凹部142的底面与各凸部141的前端面的高低差为第一方向。结果在沿表面111的二维方向上展开的细胞片中能够使细胞的伸长方向对齐于[0264]需要说明的是，由于细胞片形成用构件100的表面111具备平坦部130和凹凸部140，因此能够对于对平坦部130的粘附占优势的细胞和对凹凸部140的粘附占优势的细胞涂布于基材，也可以对经刺激响应性材料处理的基材使用下述记载的方法来进行结构加[0269]如图2所示，细胞片形成用构件的制造方法包括形成凹版150的工序和通过凹版[0270]凹版150的下表面具备：具有沿第一方向(与纸面正交的方向)延伸的形状且沿与坦部之间的多个高度差结构构成的凹凸部。凹版150的平坦部是用于通过转印来形成细胞片形成用构件100的平坦部130的部分。凹版150的凹凸部是用于通过转印来形成细胞片形法中的至少一种在原版中嵌入与凹版150的表面形状对应件100的细胞悬浮液的细胞为优先对平坦部130粘附的细胞S1，也为虽然相较于平坦部130胞S1的取向性通过平坦部130的结构及对其进行划分的凹凸部14占劣势但粘附至凹凸部140的细胞S2来反映由平坦部130进行的取向性调控。结果如图3的过虽然相较于凹凸部140占劣势但粘附至平坦部130的细胞S1来反映由凹凸部140进行的取合物或药物进行评价。作为生理学特性的变化，可例示上述的钙瞬变的观察中的BR、弛时间(Relaxationduratio[0303]要件B2：LDHA(乳酸脱氢酶A亚基)的基因表达量与ACTB的基因表达量之比(LDHA/Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(CACNA2D1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNJ2/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为酶Na+/K+转运亚基α1)的基因表达量之比(KCNE1/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天运亚基α1)的基因表达量之比(SCN5A/ATP1A1)在培养第15天～第30天的任意天为0.87以[0312]要件D3：HADHA(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHA/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.75以[0313]要件D4：HADHB(羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)的基因表达量与ACTB(β肌动蛋白)的基因表达量之比(HADHB/ACTB)在培养第15天～第30天的任意天为0.95以表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基因表达量之比[0322]要件E8：BCL2(BCL2凋亡调节因子)的基因表达量与HIF1A(缺氧诱导因子1α)的基[0328](xi)构成培养细胞片的细胞在25℃溶液中的膜片钳试验中的动作电位80％再极[0329](xii)在测定细胞使用培养液中所含的氧的速率的氧消耗速率测定中，通过添加抑制脂肪酸的β氧化活性的β氧化抑制剂，氧消耗速率与β氧化抑制剂添加前相比减少至[0333]作为源自人iPS细胞的心肌细胞，使用了iCell心肌细胞(iCellCardiomyocyte[0334]冻结细胞样品在37℃的水浴中加温3分钟，使其融化。细胞液转移至50mL离心管×104个细胞/孔的浓度对预先加入0.05mg/mL的纤连蛋白40μL涂布2小时以上的96孔板接[0339]接种后的细胞在37℃的CO2[0341]作为源自人iPS细胞的心肌细胞，使用了iCell心肌细胞(iCellCardiomyocyte[0342]冻结细胞样品在37℃的水浴中加温3分钟，使其融化。细胞液转移至50mL离心管[0343]细胞浓度使用平板培养基进行调整，以6×104个细胞/孔的浓度接种至预先涂布[0344]在37℃的CO2培养箱中静置[0345]上述(1)及(2)中使用的NDCellAligner具有平坦部及凹凸部，各平坦部具有沿AFM测定凹凸部中的各凸部的高度得到的结果为：从凹部的底面至凸部的前端的高度平均后，加入作为一次抗体的抗α_辅肌动蛋白抗体(abcam公司制、Anti_SarcomericαActinin后，加入二次抗体(AlexaFluor647标记、lifetechnologies公司制、AlexaFluor(R)[0349]荧光图像的取得在60倍(物镜)下进行，肌节在激发波长640nm/荧光波长685nm下[0357]采集用取向性培养板和平面培养板培养的iCell心肌细胞(CM1)的培养天数第1[0358]对所采集的细胞进行破碎来提取RNA(使用TakaraBioInc.制的NucleoSpinBioinformatics,2020Mar10:标，对用取向性培养板和平面培养板培养的心肌细胞的基因表达量的经时变化进行了比质量计)等量混合并用于实验。认为基于RNA测序得到的基因表达解析的结果是5个孔的平为恒定量表达的ACTB(β_肌动蛋白)基因的表达量，在用取向性培养板培养的CM1和用平面养第7天以后的MYH7基因的表达量/MYH6基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中[0368]用取向性培养板培养的CM1与用平面培养板培养的CM1相比，与心肌收缩相关的[0369]在培养第15天以后，CKM基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为1161TPM(TranscriptsPerKilobaseMillion)以上，另一方面，在用平面培养板培养的CM1中为[0370]在培养第15天以后，COX6A2基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为875TPM[0372]另外，在培养第7天以后，LDHA基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为取向性培养板培养的CM1中为2.1以上，在用平面培养板培养的CM1中为1.7以下(图7_2[0374]培养第15天以后的COX6A2基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性培养向性培养板培养的CM1中为0.68以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.57以下(图7_2形成相关的CACNA2D1(电压门控钙通道辅助亚基α2δ1)、与心肌钾离子通道的形成相关的肌钠离子通道的形成相关的SCN5A(电压门控钠通道α亚基5)的表达量经时性地增加(图7_[0379]在培养第15天～第30天，CACNA2D1基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中[0380]在培养第15天以后，KCNJ2基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为1026CPM[0381]在培养第15天～第45天，KCNE1基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为[0383]在各培养板中，培养第15天～第30天的CACNA2D1基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.085以上，在用平面培养板培养的CM1中为[0384]培养第15天～第30天的KCNJ2基因的表达量/ATP1A1基因的表达量之比在用取向性培养板培养的CM1中为0.038以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.115以下(图7_4性培养板培养的CM1中为0.003以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.007以下(图7_4取向性培养板培养的CM1中为0.87以上，在用平面培养板培养的CM1中为2.6以下(图7_4[0389]在培养第15天以后，LPL基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为3832CPM[0390]在培养第30天～第45天，ACAT1基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为[0391]在培养第30天～第45天，HADHA基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为取向性培养板培养的CM1中为0.46以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.43以下(图7_6[0394]培养第15天～第30天的ACAT1基因的表达量/ACTB基因的表达量之比在用取向性向性培养板培养的CM1中为0.79以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.74以下(图7_6向性培养板培养的CM1中为1.00以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.91以下(图7_6成和功能化有关的PGC_1α的PPARGC1A基因(PPARG共激活子1α)、编码与心肌细胞成熟化相(血管内皮生长因子A)、编码心肌组织中与心脏收缩相关的肌细胞因子的APLN基因蛋白样糖蛋白的EMCN基因(内皮粘蛋白)、与线粒体功能调节相关的BCL2基因(BCL2凋亡调[0399]在培养第15天以后，PPARGC1A基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为[0400]在培养第15天以后，ESRRA基因的表达量在用取向培养板培养的CM1中为3081CPM[0402]另外，在培养第7天以后，APLN基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为[0403]在培养第15天以后，FABP3基因的表达量在用取向性培养板培养的CM1中为[0406]在培养第7天以后，BCL2基因的表达量在用取向[0408]培养第7天以后的ESRRA基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性培养板[0409]另外，培养第7天以后的VEGFA基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性[0411]进而，培养第7天以后的FABP3基因的表达量/HIF1基因的表达量之比在用取向性性培养板培养的CM1中为0.018以上，在用平面培养板培养的CM1中为0.012以下(图7_10[0417]图像的取得在倍率60倍(物镜)下进行，线粒体在激发波长561nm/荧光波长617nm60倍下观察得到的视野的测定范围(尺寸：215μm×215μm的面积)中测定在荧光波长617nm细胞的面积(Area)和亮度(Intensity)进行比较。统计检验进行T_检验，确认到在风险率[0425]为了检测与接种至各培养板的心肌细胞的收缩/松弛相伴的运动变化，用SI8000[0435]根据以上的结果，在用取向培养板培养的CM2中收缩速度(CV)与松弛速度(RV)之[0442]利用CQ1(共聚焦荧光显微镜、横河电机株式会社制)对与接种至各培养板的心肌[0443]为了使Ca离子通量(Caionflux)可视化，向CM2中添加荧光Ca指示剂(Earl件，在激发波长488nm/荧光波长525nm、数据取得时间60秒下进行。另外，在解析中使用[0444]细胞使用以接种当天作为第0天而维持培养至第5天的CM2。从测定数据中选择钙[0445]用取向性培养板培养的CM2与用平面培养板培养的CM2相比，钙瞬变的波形峰的20％高度的线宽(Duration)和钙瞬变的波形的间[0449]据报道钙瞬变持续时间(20％高度的线宽(Duration))与动作电位持续时间具有[0450]Interval的时间受到心搏的影响，因此通常使用用心率校正后的值，随之，售的96孔板的底面来使用。关于基于膜片钳试验进行的细胞内电位的测定，对于25℃的位为68.6mV。另一方面，用平面培养板培养的CM2的动作电位80％再极化持续时间为[0459]药剂使用E4031、奎尼丁(Quinidine)、西沙必利(Cisapride)、异丙肾上腺素尼株式会社制)取得动画数据。在测定后立即将剂量1的浓度的各种药剂添加至同一孔板，间隔(CRD)，并比较了药剂对细胞运动的影[0488]向维持培养第6天的CM2中添加荧光Ca指示剂(EarlyToxcarditotoxicitykit、[0489]使用将用CQ1测得的钙瞬变的波形的峰设为100％时的20％波形宽度(Duration)、取向培养板培养的CM2中在添加了DMSO的对象组和药[0493]由这些结果可以说E_4031的添加对IKr阻断的影响更容易出现在用平面培养板培1、表5_2)。虽然心律不齐的发生率具有在取向培养板中略高的倾向，但是Duration、培养的CM2和用平面培养板培养的CM2具有[0525]着眼于动作电位的Duration的延长最为典型的IKr阻断剂的E_4031、类似的作用E_4031下的Duration延长作用，由此认为具有副作用容易出现在用平面培养板培养的CM2[0530]药剂使用异丙肾上腺素(