CN119487204A 使用阻断剂检测核酸扩增产物的方法 （稀有生物科学公司）

2024.11.08PCT/EP2023/0558982023.03.08WO2023/170152EN2023.09.14本发明提供了一种检测混合物中两种或更多种不同标记的高分子量核酸产物的方法，其合物中加入解析剂以促进不同标记的产物的解的相互作用。产物优选为滚环扩增(RCA)或超级RCA产物，并且解析剂优选为牛血清白蛋白22.一种在样品的一种或多种核酸分子中检产生包含针对两种或更多种靶核酸序列的生成的核酸产物320.根据权利要求1至19中任一项所述的方法补拷贝的多个重复，其中与多个重复杂交的挂锁探针通过连接环化，用于RCA以产生第二4同一反应混合物中差异化标记的RCA或其他核酸扩增产物的解析。这在靶核酸序列的检测增，其中第二轮RCA反应的产物(第二RCP)与第一轮反应的产物(称作第一RCP)相连。[0007]这种RCA(特别是sRCA)方法所提供的灵敏度，意味着它们已应用于稀有或低丰度5例的第一RCP的单体重复杂交(直接或间接)，并且每个这样的挂锁探针可以产生第二RCP。[0009]任何依靠使用标签来区分大型核酸产物的多重检测技术的一个共同问题是不同[0010]该问题不限于RCP的检测，也适用于任何包含或提供大量标记位点的大型或高分点，例如WO2011/094669中所描述的RNAscopeTM技术。虽然RNAscopeTM是为原位杂交检测核酸产物包含多个用于掺入或连接标签的位点。标记的核酸产物携带或包含多个标签拷6可以将不同的组合和/或比例两个或多个标签(从标签种类的意义上来说)用于各产物，这们可以是包含核酸单体单元或寡核苷酸分子的多个[0023]核酸产物可以作为可检测信号或标志物产生，用于检测方法中靶分析物的检测[0024]更具体地，核酸产物可以在用于检测靶核酸分子中的靶核酸序列的方法中产靶核酸序列或靶核酸分子可以是检测方法的靶分析物，或检测方法的分析物的报告核酸。[0034](a)对于每个靶核酸序列，产生高分子量核酸产物作为该序列的检测分析反应产7差异化标记并且可以与另一种核酸产物区分开，并且其中在(a)中核酸产物的产生期间或[0038]在一个实施方案中，标记混合物包含能够与核酸产物杂交的标记的检测寡核苷[0040]在上述任一方面的一个实施方案中，RCP通过靶核酸序列特异性的环化挂锁探针成了可容易地标记和检测的大型核酸产物，例如RCP，在许多分析方法中作为最终反应产8上是可由杂交在一起的单个核酸分子或多个单独的核酸分子或寡核苷酸组成的这种位点可以是序列，在本文中称为检测序列，它为包含检测序列。9于或适应于产生这样的产物的任何扩增反应来产生，包括例如PCR、重组酶聚合酶扩增连接或通过杂交连接在一起，其中单体可各自包为“检测寡核苷酸”)的杂交标记的检测序列。单体可以是RCP或其他扩增产物中的重复、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与沃森一克里克型或类似的碱基对相互作用[0059]解析剂可以是任何通常用于在检测方法(例如在免疫分析中)中阻断分析试剂的所述血清蛋白可以来自单一血液来源或多个血液来源，即来自不同的动物个体和/或来自[0067]α球蛋白的特点是其在碱性或带电溶液中高度流动的能力，包括α1抗胰蛋白酶[0072]虽然解析剂的主要优点是在检测步骤中减少标签之间的[0078]因此，反应混合物中蛋白质解析剂的浓度范围可以为0.001_0.1或更具体地浓度是0.01％(按重量计或w/v)。反应混合物中非蛋白质解析剂的浓度范围可以为0.01_最大浓度是0.5％(按重量计或w/v)。检测步骤期间去污剂的最小浓度可以是例如至少是0.01％(按重量计或w/v计)。学发光产物。一个示例是广泛用作标签的辣根过氧化物酶(HRP)。在过氧化物存在的情况从而使其可以被检测到。(如标记的HCR单体)或标记的杂交寡核苷酸来构建核标记的寡核苷酸可以通过充当中间寡核苷酸或夹心寡核苷酸的检测寡核苷酸间接杂交至在挂锁探针中。检测序列的互补序列将掺入到RCP中。检测序列可以对挂锁探针具有特异物中，例如RCA反应混合物，或包含在生成HCR聚合物产物时的包含HCR单体的反应混合物包含在第一和/或第二或进一步(如最终)RCA步骤的反应混合物中，或包含在所有RCA步骤通过包含已知浓度的一种或多种对照核酸分子，和/或将靶核酸序列的检测水平与已知对以通过检测其上的一种或多种表面蛋白来检测和区分特定的或选定的前列腺体或其他细的任何分析物(例如蛋白质或其他生物分子或小分子)进行分析的过程中使用或生成。因分子可以是或可以衍生自编码(即前体mRNA或mRNA)或非编码RNA序列(例如tRNA、rRNA、环可以通过靶核酸序列的探针(特别是挂锁探针)的环化来产生。挂锁探针可以有多种形包含通过裂解打开或解折叠发夹以释放核酸结构域，所述核酸结构域可以环化以形成RCA[0113]为了实现连接，需要连接的3'端和5'端("可连接"的3'端和5'端)与第一个RCP中并且每个部分的另一端与共同的连接模板杂交。在另一个实施方案中，两部分挂锁(2_[0115]可选地，用于产生RCP的RCA模板(或sRCA的第一RCA模板)可以是环化的靶核酸序[0116]HCR也是众所周知的并被广泛描述，并且HCR已被用作检测分析中的信号放大方[0117]WO2022/117769中描述了使用缺口填充挂锁探针的基于sRCA的检测方法，并且具[0122](c)使用环化的扩增子作为第一RCA模板进行第一RCA反应以产生第一RCA产物[0123](d)将第一RCP与对两种或更多种靶核酸序列具有特异性的两种或更多种不同的[0124](e)直接或间接连接杂交的锁式探针的末端，所述杂交的锁式探针的末端已与其[0125](f)使用环状挂锁探针作为第二RCA模板进行第二RCA反应，以生成含有环化挂锁探针的多个重复互补拷贝的第二RCP，其中针对反应混合物中待检测的各靶核酸序列生成[0126](g)向(f)的每个第二RCP提供一种或多种标签的多个拷贝，其中每个不同的第二物中包含解析剂以促进差异化标记的RCP解析，其中所述解析剂用于抑制不同标记之间的于检测的靶序列的互补物杂交的锁式探针(即已与其各自的靶序列互补物杂交的锁式探法的第二连接步骤中，连接已与其靶序列互补体杂交[0134]sRCA方法例如上述那些方法需要第一RCA步骤和至少以环状挂锁探针为模板的第存在的材料或已制备的制剂。天然存在的样品可以在进行本文的方法之前进行处理或加析产生的产物，如免疫PCR、免疫RCA或邻近检测(如邻近连接检测(PLA)或邻近延伸检测森克里克碱基配对或任何类似的碱基对相互作用形成双链体的核苷酸序列之间形成双链以及期望或有利的杂交的限制内，期望最小化挂锁探针的总长度以最小化进行RCA反应的[0148]例如，可以使用文献中已知的任一成熟的核酸分子分析大量重复序列可以通过用荧光或其他分光光度法可检测探针进行比例标记在大量此类产[0152]为了检测以均质形式产生的产物，可以将它们捕获或带[0155]图2：单管SuperRCA分析的流式细胞仪读数数据，显示(A)含BSA的反应中1%梯度稀释液。将包含用野生型基因组DNA梯度稀释的突变基因组DNA的基因组DNA样品分为本分析了330ngDNA(相当于100,000个人类单倍体基因组)，而ddPCR则使用了66ng(相当于20,000个人类单倍体基因组)。每个数据点都按三次生物重复的平均值计算，分别计算了[0158]图5：患者UPN126在诊断为AML前两年被诊断为原发性骨髓纤维化。根据NGS、SuperRCA和ddPCR的记录，AML确诊时(第0天)的骨髓样本显示出高水平的IDH2p.R140Q突变。通过SuperRCA和ddPCR分析对骨髓纤维化阶段的初始骨髓样本进行回顾性分析，[0159]图6：单管SuperRCA分析的流式细胞仪读数数据[0163]使用QIAampDNABlood迷你试剂盒(Qiagencat.51104)从BM细胞或全血中提取[0166]使用SuperFiDNA聚合酶(ThermoScientific)在25μLPCR反应中扩增基因组DN[0169]将1μL来自基于PCR的文库制备的各靶标与20μL纯化溶液混合，其中含有1XSuperRCA缓冲液(RarityBioscienceAB)、0.125μLExoI(ThermoFisherInc.)和[0173]通过RCA扩增含有靶核苷酸位置的环化的PCR产物链。将5μL1X(RarityBioscience)、1.8mMdNTP(Invitrogen)、2.5UPhi29聚合酶(NewEngland物(含有1XSuperRCA缓冲液(RarityBioscience)、3mMNAD(Sigma)、2.5UAmpligase[0177]将含有1XSuperRCA缓冲液(RarityBioscienceAB)、1.2μM引物和1U/μLLa钟。[0181]将含有SuperRCA产物ce)中稀释为含有对不同SuperRCA产物特异性的100nM荧光团标记的寡核苷酸探针的杂交[0183]SuperRCA分析中BSA的存在有助于通过防止突变体和野生型群体在溶液中聚集成簇来区分它们；BSA不存在将导致增加的图表右上角的群体(双阳性群体)。BSA的存在(图个门控的双阳性事件的百分比。下表1至表2示出了流式细胞仪检测到的每个反应的事件[0184]表1至2列出了流式细胞仪读数的原始数据，这些数据分别显示了含有BSA的1%[0191]单管SuperRCA分析用于分析样本中掺入不同水平的ID3至表6显示了流式细胞仪检测到的每个样本中不同丰度的IDH2p.R172K突变的事件数量。[0192]表3至6显示了流式细胞仪读数的原始数据，显示IDH2R172K突变的比例分别为[0202]将靶向包含IDH2p.R172K突变的DNA序列的PCR扩增子用于spike_in的DNA样本之前被诊断为伴有JAK2突变的原发性骨髓纤维化，在初次诊断两年后转变为继发性AML。IlluminaMiSeq平台进行测序，结果显示IDH2p.R140Q突变与先前已知的JAK2突变一起存在。通过SuperRCA和ddPCR分析进行的回顾性分析中，骨髓纤维化阶段的初始骨髓样本的变的DNA序列的PCR扩增子应用于患者DNA样本中，以进行SuperRCA预扩增步骤。然后将[0206]在单管SuperRCA分析中使用不同浓度的BSA来分析含有1.024％R132H突变的样[0207]从图6和表7至10中的数据可以看出，SuperRCA分析中BSA的浓度在0.002％到量计或w/v)作为解析剂的流