【《生物膜特性和检测分析的实验材料与方法综述》6500字】

生物膜特性和检测分析的实验材料与方法综述目录TOC\o"1-3"\h\u16870生物膜特性和检测分析的实验材料与方法综述 1202031.1实验装置 1122831.1.1生物膜法工艺装置 1123831.1.2滤柱接种与启动 3206441.1.3纳米气泡发生器性能 399751.2水质分析方法 6277251.3生物膜特性分析检测方法 7149191.3.1生物量 7208831.3.2胞外聚合物 7139421.3.3生物膜结构分析与表征 9154031.3.4脱氢酶活性检测 11122541.3.5比耗氧速率与比氨氧化速率 1183221.4分子生物学分析 121.1实验装置1.1.1生物膜法工艺装置本研究中主要采用小试试验规模的生物滤柱进行，由有机玻璃制成，放置于图2-1生物滤柱结构示意图Fig2-1.DiagramofexperimentalBAF如图2-1所示，滤柱高1.0m，内径为5.5cm，为防止水流贴壁流动，每间隔0.3m设有1cm厚的边壁环。滤柱侧壁共设计有8个液相取样口，间隔为15cm，对向侧壁设计有8个直径为5cm的滤料取样口，间隔为15cm。柱内自下而上填充有鹅卵石承托层（高度10cm）以及3~5mm粒径的火山岩滤料层，滤层高度为120cm。滤柱下方设有独立曝气混合室，内径5.5cm，高10cm，实验中机械曝气对照组在曝气混合室内设有微孔砂芯曝气头，通过空气压缩机进行机械曝气，其流量通过气体玻璃转子流量计控制；实验组不设曝气头，在设有内回流的实验工况下，曝气混合室作为进水与回流的混合场所，回流与进水在混合室内均匀混合后通过穿孔板和承托层进入滤层。本研究滤柱均采用上向流，滤柱进水与回流均通过蠕动泵（保定兰格Lead-2，中国）控制，设计水力负荷为0.36m3/(m2·h)。滤层反冲洗周期为48小时，反洗时间为10min，包括2min气洗（气洗强度0.2m2/h）,气水联合反洗1min（水洗强度0.1m3/h），循环2次以剥脱过量生长的生物膜，最后水洗滤柱4min（水洗强度0.1m3/h）完成反冲洗过程。本研究中的低温试验部分在恒温控制室中进行，恒温控制室由双层钢化玻璃搭建，并通过保温材料密封，通过空调机组和低温冷水循环泵控制环境温度和进水温度，温度控制精度±1.0℃。1.1.2滤柱接种与启动本研究中接种污泥取自哈尔滨某污水处理厂（45.78°N,126.65°E）的二沉池，其悬浮固体浓度（Mixedliquidsuspendedsolids,MLSS）约为2200mg/L。污泥经过24h培养与稳定后接种到生物滤柱中，接种量为每滤柱500mL。接种后滤柱闷曝48h，出水中主要指标稳定即认为启动成功，可进行实验运行。1.1.3纳米气泡发生器性能1.1.3.1纳米气泡发生条件优化本研究中的纳米气泡通过自制增压-减压发生器原位发生在模拟废水中，涡轮增压泵（20NPD，日本Nikuni流体）同时吸入原水箱中的模拟废水和空气，吸入的气水两相剧烈混合，在压力增大的情况下水中的可溶性气体（如氧气）溶解度上升，溶解在水相中进一步分散，再经过快速减压装置，此时过饱和的气体逸出形成纳米气泡。自行搭建的增压-减压发生器可调节气水比与增压/减压压力差，以获得不同粒度和总含氧量的气泡，本研究准备过程中即通过响应面法研究了气水比、压力差和温度条件对纳米气泡粒度和溶氧效果的影响，分别通过发生后15分钟平均粒度和发生30分钟后的溶解氧浓度作为评价指标，结果如图2-2所示。图中可以看出，当气水比提高、压力差降低时，不能有效溶解气体，仅靠泵动力分割气体效率较低，产生的气泡粒度非常大，也就难以提高溶解氧水平。经过响应面法优化获得的纳米气泡最佳发生参数为压力差0.37Mpa，气水比为0.2。图2-220℃下发生条件响应曲面图Fig2-1.Responsesurfacediagramofgeneratorcontrollingfactorsat20℃1.1.3.2纳米气泡粒度通过上一节对气泡发生条件进行优化，利用动态光散射（DynamicLightScattering，DLS）粒度仪（布鲁克海文90PlusZeta，美国）检测原水中纳米气泡粒度分布，如图2-3所示。图2-3纳米气泡粒径分布Fig.2-3Logisticsizedistributionofinsitunanobubbles气泡发生时有较多的微米气泡伴生，可在水中观察到乳白色雾状气泡（图2-4(a)），这些气泡快速上升离开系统（图2-4(b)），气泡粒度会出现缓慢的增大，考虑到本研究中稳定水箱循环时间为1h，气泡进入反应器时为纳米气泡。利用激光共聚焦荧光显微镜（Confocallaserscanningmicroscopy,CLSM）直接观察到纳米气泡（图2-6(c)），同样表明纳米气泡可在水中存在较长的时间。图2-4含纳米气泡水成像：（a）纳米气泡发生10s；（b）静置5分钟后；（c）静置30min后CLSM成像Fig.2-4Imageofnanobubble-containedwater:(a)10saftergeneration;(b)5minaftergeneration;(c)CLSMimage(30minaftergeneration)1.1.3.3纳米气泡供氧能力评价本研究中以20°C时的氧总传质系数（KLa(20)）作为量化指标。根据Capodici等[68]的方法，清水充氧实验使用水银温度计和荧光式溶解氧探头（LDO，美国哈希）实时监测水箱中温度和溶解氧（Dissolvedoxygen,DO）浓度。水箱与自制的微纳米气泡发生器相连，清水循环通过发生器后携带纳米气泡的水回到水箱中发生氧传递过程。通过插值法计算试验温度下饱和溶解氧值（Cs）。试验温度下氧总传质系数KLa(T)通过式（2-1）计算：lnC 通过式（2-2）将试验温度下的KLa(T)换算成为20°C时的氧总传质系数KLa(20):KLa(20)根据经典的双膜理论，纳米气泡中的氧气首先溶解进入水相中，在浓度梯度的驱使下，途经生物膜表面附着的“水膜”进入生物膜（生物相）内部，这一过程氧分子自由扩散遵循菲克定律（Fick’sLaw）。如式（2-3）所示，两相综合氧转移效率（Oxygentransferefficiency,fD）为纯水与生物膜中氧扩散系数之比。fD式2-4所示，Horn和Morgenroth等利用微电极监测的随生物膜厚度（z）变化的实时溶解氧（Cb）曲线和水中溶解氧（Cw）随时间（t）变化计算得到纳米气泡供氧时的氧转移效率，式中V为检测装置体积：fD水中纳米气泡供氧量通过改进的碘量法进行计算[69]。据式（2-5）计算单位氧转移能耗W（单位：KW/gO2）：W=P式中：P——发生器功率（KW）；Q——经过发生器的流量（L/h）；MO——发生条件下纳米气泡供氧量（mg/L）。1.2水质分析方法本研究中跟踪监测的常规水质指标包括COD、氨氮（NH4+-N）、亚硝氮（NO2--N）、硝氮（NO3--N）、pH、DO等。实验采用人工配水，其主要成分及浓度参考郭泓利等[70]对全国典型城市污水处理厂进水水质的分析报导设置，人工配水中的成分来源如表2-3所示。表2-3实验配水成分表Table2-3Compositionofsyntheticwastewater.投加物质模拟污染物投加量生产商食品级葡萄糖（99%）COD93.8-470mg/L山东西王糖业硫酸铵（AR）NH4+-N95-235.7mg/L天津巴斯夫化工有限公司磷酸二氢钾（AR）TP21.9mg/L天津致远化学试剂有限公司氯化钙（AR）Ca2+0.1g/L天津致远化学试剂有限公司硫酸镁（AR）Mg2+0.1g/L天津永晟精细化工有限公司根据化学计量关系，每升人工配水中加入复配微量元素1mL[14]和碱度补充（NaHCO3:N投加质量比5:1）。常规水质检测参考国家标准检测方法和《水和废水监测分析方法》（第四版），方法和仪器设备如表2-4所示。表2-4常规水质监测方法与设备信息Table2-4Measurementsandequipmentsofwaterqualityindexs水质指标检测方法使用仪器生产商COD快速密闭催化消解法紫外-可见分光光度计北京普析通用NH4+-N纳氏试剂光度法NO2--NN-(1-萘基)-乙二胺光度法NO3--N麝香草酚光度法pH玻璃电极法台式pH计上海雷磁DO荧光电极法便携式溶氧仪美国哈希1.3生物膜特性分析检测方法1.3.1生物量生物量通过600℃下烧失的可挥发生物量（Volatilesuspendedsolids,VSS）作为计量。从固体取样口取出约2g（湿重）火山岩滤料，去离子水轻轻淋洗3次去除表面粘附的悬浮物，转移到干燥的清洁坩埚（重量记为W1）中，在105℃鼓风干燥烘箱中烘干至恒重（重量记为W2）；将坩埚转移到600℃马弗炉内灼烧2h，置于干燥器内冷却，称取重量记为W3，坩埚中加入超纯水20mL进行超声清洗3次，再次烘干坩埚及剩余的滤料，称重记为W4。单位重量滤料的生物量计算方法如式（2-6）所示：M=W1.3.2胞外聚合物1.3.1.1胞外聚合物的提取 由于生物膜紧密地附着在火山岩滤料上，本研究中采取Li和Yang[71]报导的热提取法（Heatextractionmethod）进行胞外聚合物（EPS）提取。取约5g（湿重）滤料置于50mL离心管中，去离子水浸洗3遍后加入30mL预加热到70℃的0.05%NaCl溶液，旋涡振荡1min，离心10分钟后吸取上层液体，经过0.45μm滤膜过滤后获得LB-EPS溶液。剩余固体再次加入30mL预加热到60℃的0.05%NaCl溶液，在60℃下水浴10min后离心，上清液经过0.45μm滤膜过滤后即为TB-EPS溶液。1.3.1.2蛋白与多糖定量分析蛋白（Protein,PN）和多糖（Polysaccharides,PS）是EPS中最主要的两种成分，其中包括多种胞外酶等细胞外活性物质与纤维素等结构基质，对生物膜的产生和结构特性具有重要意义。本研究中分别采用福林酚法和苯酚-硫酸法检测蛋白和多糖的含量：蛋白定量分析采用牛血清蛋白（赛国生物科技，中国）作为标准物质，检测用磷钼酸—磷钨酸（福林酚试剂）购于上海国药试剂集团，使用前避光保存在4°C冰箱中。配置Na2CO3（20g/L）与NaOH（4g/L）混合液（A液，使用前现配）、酒石酸钾钠溶液（20g/L,B液）、CuSO4·5H2O溶液（10g/L，C液），实验前按照100:1:1配比混合A、B、C液，加盖混匀静置30min。在10mL离心管中加入1mL待测EPS溶液，加入5mL上述混合液混匀后反应10min，加入福林酚试剂0.5mL混匀后避光静置，反应30min后在750nm处检测吸光度，通过标线计算蛋白浓度。多糖定量分析采用烘干24h并保存在干燥皿中的葡萄糖（天津基准，中国）作为标准物质，预先配置80%(v/v)苯酚溶液保存在4°C冰箱中；测试前取80%(v/v)苯酚溶液稀释为5%(v/v)苯酚溶液使用，在10mL玻璃试管中添加1mL待测EPS溶液，加入1mL5%苯酚溶液和5mL优级纯浓硫酸混匀反应30min，在490nm处测量吸光度，通过标线计算多糖浓度。1.3.1.3胞外聚合物荧光组分分析 三维荧光激发-发射光谱（three-dimensionExcitation-EmissionMatrix,3D-EEM）是检测EPS中荧光组分的常用手段，本研究中使用荧光分光光度计（FP6500，Jasco，日本）进行EPS提取样本的三维荧光激发-发射光谱检测，扫描激发波长（Excitation,Ex）区间为220-450nm，步长：5nm；扫描发射波长（Emission，Em）区间为220-550nm，步长：1nm。狭缝宽度均为5nm。每次检测均在相同条件下检测新制超纯水三维荧光光谱进行背景扣除并对数据进行拉曼均一化处理（单位：R.U）以去除水的散射峰。经过预处理后，荧光光谱数据用两种分析方法进行解析：（1）腐殖质指数（Humicindex,HIX）和自生源指数（Bioresourceindex,BIX）。根据Maqbool等报导的计算方法[72]，如式（2-7）和式（2-8）所示：HIX=λem=435λem=480λem=300BIX=λem=380λem=430,λ（2）利用归一化数据矩阵绘制光谱图，并进行平行因子分析（Parallelfactoranalysis，PARAFAC）。操作步骤参照工具包附录、帮助文件以及相关文献描述[73]进行。模型中因子数的选择通过残差分析（ResidualAnalysis）和半分法（Split-halfanalysis）进行验证。 本研究中为探究温度对纳米气泡供氧的生物滤池中生物膜EPS荧光组分的影响，还对不同温度下生物膜EPS样本进行了二维相关光谱分析（Twodimensionalcorrelationspectroscopy,2DCOS），通过定量分析中获得的EPS浓度对样品进行稀释，使各样品EPS浓度相对误差小于5%。检测条件设定参考Chen等的报导[74]使用同一荧光光度计进行，采用的波长差（Δλ）为60nm。数据使用2dshige软件进行分析。1.3.3生物膜结构分析与表征1.3.3.1生物膜三维荧光成像利用CLSM获得生物膜的荧光三维成像图片。将附着有生物膜的样品从实验装置中取出后使用去离子水轻轻淋洗3次去除表面的粘附的杂质与溶液，分步进行多重荧光染色，染色过程在室温下按说明书操作流程避光进行，染料类型与结合物如表2-5所示。每种染料染色时间30min，每次染色后用PBS冲洗3遍洗去多余染料残留。全部染色完成后，使用CLSM显微镜（Ti-2，Nikon，日本）与随机软件NIS-ElmentsAR进行观察与图像信息采集。表2-5生物膜培养装置运行参数Table2-5Operationalparametersofbiofilmincubationdevices染料名称目标成分激发波长(nm)生产商苯基吲哚(DAPI)SYTO68核酸640405碧云天(中国上海)Invitrogen(美国)异硫氰酸荧光素(FITC)蛋白质488Sigma-Aldrich(美国)伴刀豆球蛋白A(ConA)α-多糖561Sigma-Aldrich(美国)卡尔弗鲁尔白(CW)β-多糖640Invitrogen(美国)1.3.3.2生物膜厚度滤料表面生物膜厚度选取最大厚度作为量化指标。本研究中生物膜最大厚度在总细胞染色图像基础上使用丹麦技术大学开发的专用分析软件COMSTAT1.1.1统计获得。其原理为计算图片中生物膜最高点与基底层之间的距离减去可识别的孔洞等空白区域，通过选择联通体积过滤器（Connectedvolumefiltering）计算方法来避免因为火山岩滤料不均匀造成的识别误差。考虑到生物膜生长的不均匀性，实验中在同一取样点至少取5个样品进行检测，取平均值作为测量结果。参考Ning等的方法[75]，生物膜内部好氧层/厌氧层厚度利用溶解氧微电极（Unisense，丹麦）所获取的生物膜纵向剖面溶解氧曲线进行计算。如式（2-9）所示，生物膜指定深度z处溶解氧扩散进入通量（Diffusiveenteringflux）应为溶解氧扩散损失通量（Diffusivelosingflux）与氧消耗量（DOconsumption）之和，即：−D∂C 式中D为溶解氧的有效扩散系数，C为溶解氧浓度，OUR为耗氧速率（oxygenuptakerate），OUR取值若为正，说明在z深度生物膜为耗氧状态，即认为此深度为好氧区域；反之取值为负时认为此深度为厌氧区域。简化为式（2-10），并利用生物膜纵向剖面溶解氧曲线求取二阶导数计算OUR取值正负。Dd1.3.3.3生物膜荧光成分体积滤料表面荧光成分体积同样通过分析软件COMSTAT1.1.1进行计算获得。通过计算机识别并统计荧光染料在各图层所占的像素，结果根据成像面积进行均分，获得单位成像面积上的荧光成分体积，计算单位为μm3/μm2。需要注意的是，由于生物膜结构和分布都具有极强的异质性，统计荧光体积的绝对值并不具有比较意义，但我们可以从各成分之间的相对数量关系认识生物膜成分组成的特征。1.3.3.4生物膜表面形貌 本研究中使用ZEISSSigma500型扫描电镜（Scanningelectronmicroscope,SEM）来观察附着在滤料表面的生物膜表面形貌特征，参考Yang等的方法[76]进行预处理：从取样口随机提取新鲜的滤料，将其浸入1.5%戊二醛溶液1.5h（4℃）固定样品；弃除戊二醛溶液后加入pH=6.8的磷酸盐缓冲液冲洗3次，依次加入50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，100%乙醇脱水过程反复3次；先后用乙醇-乙醇异戊酯（1:1）混合溶液和乙醇异戊酯浸洗，置于室温鼓风干燥箱中至少干燥12h。观察前使用离子溅射仪（GikoIB-5，日本）喷铂金膜处理后进行观察。1.3.4脱氢酶活性检测 脱氢酶（Dehydrogenases，DHA）是细胞呼吸链中的一类重要氧化酶，与细胞氧化代谢与有机物分解具有紧密的联系，可反映微生物的代谢活性。本研究中利用脱氢酶催化2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC）生成红色三苯基甲臢（Triphenylformazan，TF）的特性对脱氢酶水平进行定量检测。检测步骤参考其他污水处理微生物检测方法[77,78]并针对生物膜在滤料/填料上的不均匀附着特性进行适当修改。简言之，取新鲜生物样品（活性污泥1mL,火山岩滤料5g或悬浮填料3颗），置于50mL离心管中，用去离子水浸洗3次，加入3mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Trishydroxymethylaminomethane-HCl,Tris-HCl）、1mLTTC溶液（0.4%，w/v），1mLNa2SO3溶液（0.36%，w/v）和5mL超纯水，混匀放入37℃恒温水浴在黑暗条件下150rpm震荡温育30min，加入1mL甲醛溶液终止反应后离心10min，弃去上清液，加入10mL丙酮并迅速加盖，重新混合均匀置于37℃恒温水浴提取TF，离心后吸取上清液在485nm处以丙酮为空白试样用分光光度计测定吸光度。1.3.5比耗氧速率与比氨氧化速率比耗氧速率（Specificoxygenuptakerate,SOUR）在溶解氧瓶中进行，预先取50mL生物膜样品，加入人工配制污水至300mL，在溶解氧仪实时监测下使用微孔砂芯曝气头进行机械曝气至溶解氧达到饱和；立即将混合液转入放有磁力转子的溶解氧瓶，用胶塞密封并保证瓶口形成水封，使用磁力搅拌器进行搅拌并使用溶解氧仪持续监测并记录溶解氧随时间变化DO(t)至溶解氧降至0.01mg/L以下。监测结束后，转移到定量滤纸过滤烘干，称量计算溶解