《编制说明-菊花主要病虫害绿色防控技术规程》

中国农药工业协会团体标准《菊花主要病虫害综合防治技术规范》编制说明一、标准编制背景(一)任务来源、起草单位与起草人由中国农业科学院植物保护研究所、湖北省生物农药工程研究中心、中国医学科学院药用植物研究所承担“菊花主要病虫害综合防治技术规范”的制定工作。中国农药工业协会负责整个标准制定的组织实施和技术把关，拟定工作方案，修改标准草案形成标准征求意见稿，并负责征求各相关单位、专家和社会公众意见并提出相应的处理意见，编制标准送审稿，组织召开标准审定会，修改形成标准报批稿，并上报标准。中国农业科学院植物保护研究所等单位负责调研，收集相关资料和试验样品，开展验证试验，起草标准草稿，参与征求意见的处理、标准送审稿编制和标准审定会等。表1主要起草人员信息及任务分工姓名单位职称专业特长分工颜冬冬中国农业科学院植物保护研究所研究员农药学，全面主持标准的制定项目负责人，负责组织标准起草、资料收集、建立分析方法、文本完成、市场调研、数据处理、收集和汇总各企业意见，标准评审汇报等工作胡洪涛湖北省生物农药工程研究中心副研究员农药学，调研、基础数据收集协助项目负责人组织标准起草、资料收集、建立分析方法、文本完成、市场调研、数据处理、收集和汇总各企业意见，标准评审汇报等工作王秋霞中国农业科学院植物保护研究所研究员农药学，标准咨询指导协助项目负责人组织标准起草、资料收集、建立分析方法、文本完成、市场调研、数据处理、收集和汇总各企业意见，标准评审汇报等工作曹坳程中国农业科学院植物保护研究所研究员农药学，标准咨询指导负责提供样品、产品质量台账和企业标准，对建立分析方法及指标的确认及反馈征求意见方文生中国农业科学院植物保护研究所副研究员农药学，调研、基础数据收集负责提供样品、产品质量台账和企业标准，对建立分析方法及指标的确认及反馈征求意见李园中国农业科学院植物保护研究所副研究员植物病理学，调研、基础数据收集负责提供样品、产品质量台账和企业标准，对建立分析方法及指标的确认及反馈征求意见徐常青中国医学科学院药用植物研究所研究员昆虫学，调研、基础数据收集负责提供样品、产品质量台账和企业标准，对建立分析方法及指标的确认及反馈征求意见（二）标准起草的背景与意义菊花是我国传统重要的花卉和中药材品种之一，既具有观赏价值，又可作食用药用。在国内种植广泛，形成了观赏菊花和药用菊花两大产业。在安徽亳州、浙江桐乡等地，药用菊（亳菊、滁菊、贡菊、怀菊、杭菊等）种植历史悠久，规模庞大；在云南、广东、江苏等地，观赏菊花（切花、盆栽菊等）也是花卉产业的重要组成部分。以湖北麻城为例，2023年全市菊花种植面积达16万亩，干花年产量约1.7万吨，全产业链产值约50亿元。菊花产业已成为不少地区农民增收、乡村特色经济发展的支柱。然而，菊花种植过程中病虫害发生种类多、危害重。主要病害包括叶枯病、枯萎病、霜霉病等，主要虫害有菊蚜虫、蛴螬、地老虎等。这些病虫害可导致菊花减产、花品质量下降，严重时甚至毁灭性损失。长期以来，生产上对菊花病虫害的防控主要依赖化学农药喷施，存在一些突出问题：一是过度和不规范用药导致病虫产生抗药性、药效下降；二是部分高毒高残留农药的使用造成产品农药残留超标风险，危及消费者健康和出口贸易；三是化学农药的大量使用破坏田间生态平衡，天敌生物受害，环境污染加剧。随着人们对农产品质量安全和生态环境保护要求提高，传统粗放的防治方式已经难以为继。国家层面高度重视农作物病虫害绿色防控工作。《农作物病虫害防治条例》明确要求坚持“预防为主、综合防治”的植保方针和绿色防控理念。农业部门近年来实施农药减量控害行动和绿色防控示范县创建，多次提出提高主要作物绿色防控覆盖率的目标。菊花作为一类重要经济作物，其病虫害绿色防治迫在眉睫。然而，我国目前尚无针对菊花病虫害绿色防控的国家标准或行业标准，一些地方虽制定了地方标准，但适用范围有限，技术水平参差不齐，缺乏全国性的统一技术规范。制定《菊花主要病虫害绿色防控技术规程》团体标准，旨在凝练各地成熟有效的菊花病虫害综合防治措施，推广高效低风险的绿色防控技术，降低对化学农药的依赖，提高菊花产品质量安全水平，推动菊花产业绿色、健康、可持续发展。这对保障农民增收和消费者饮食用药安全、促进生态文明建设具有重要意义。二、主要工作过程为向中国农药工业协会提出标准制定建议与申请，2024年9月年成立了以中国农业科学院植物保护研究所、湖北省生物农药工程研究中心、中国医学科学院药用植物研究所为起草单位的编制小组。2025年1月至2025年3月，项目启动后，编制组首先进行了充分的前期准备：收集国内外菊花病虫害防治相关科研资料、文献和现行标准，调研菊花主产区病虫害发生情况及防控现状。编制组赴典型产区开展实地调研，走访菊花种植基地和相关企业，了解生产一线的主要病虫种类、发生规律以及现有防治措施效果，为标准制定提供第一手资料。2025年4月至2025年6月，在调研基础上，编制组结合各单位的科研积累和实践经验，反复讨论拟定了标准的框架和主要技术内容提纲。随后进入试验验证和完善阶段：编制组在菊花主产区布置了绿色防控技术示范试验，对拟纳入标准的关键技术措施进行田间验证，收集技术参数和防治效果数据。2025年7月至2025年10月，完成了标准草稿的编写，主要起草人包括：颜冬冬、胡洪涛、王秋霞、曹坳程、方文生、李园、徐常青。2025年10月，向中国农药工业协会提出了标准制定建议与申请。三、标准编制原则及主要技术内容的确定1.标准编制原则标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际接轨，注重标准的通用性、适用性、配套性和可操作性。确保标准既保持技术上的先进性，又具有经济上的合理性。标准制定过程中严格遵守国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。与同体系标准和相关的各种基础标准以及配套使用的基础标准等相关标准相衔接，遵循政策和协调统一性原则。本文件制定过程中严格按照GB/T1.1-2020的规定编写，力求做到技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。2.主要技术内容的确定2.1范围本文件规定了菊花主要病虫害绿色防控的术语与定义、防治原则、主要病虫、绿色防控技术、施药防护、建立安全生产管理档案的内容。本文件适用于菊花主要病虫害的绿色防控。制定依据：国家大力推进“农药减量增效”和“绿色防控”行动计划，在湖北等菊花主产区田间试验结果表明，综合运用农业、生物、物理及化学防治措施，可显著降低病虫发生率、减少化学农药施用量、改善生态环境；具体结果见“试验验证的分析”。2.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB2763食品安全国家标准食品中农药最大残留限量GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则GB12475农药贮运、销售和使用的防毒规程NY/T393绿色食品农药使用准则NY/T496肥料合理使用准则通则GB/T8321农药合理使用准则NY/T1276农药安全使用规范总则NY/T2725氯化苦土壤消毒技术规程NY/T3129棉隆土壤消毒技术规程JB/T14083自走式精旋土壤火焰杀虫机制定依据：本标准选用的规范性引用文件主要依据现行国家与行业标准体系的衔接性、可操作性及菊花栽培实际管理需要。2.3术语与定义2.3.1病虫害综合防治Integratedpestmanagement协调运农业防治、生物防治、化学防治、物理防治、植物检疫等多种防治措施，将有害生物控制在经济允许水平以下，同时减少对环境和生态的影响。2.3.2土传病害Soil-bornediseases土传病害是指由土传病原物侵染引起的植物病害，侵染病原包括真菌、细菌、线虫、病毒等。2.3.3土壤消毒Soildisinfestation为控制土传有害生物，采用物理、化学、生物或几种技术联合处理，杀灭耕作层土壤有害生物的措施。制定依据：相关术语的定义依据相关文献的科普介绍。2.4防治对象2.4.1病害菊花主要病害有叶枯病、枯萎病、霜霉病等。主要病虫害发生条件和症状见附录A。2.4.2虫害菊花主要虫害有菊蚜虫、蛴螬、地老虎等。制定依据：菊花主要病害包括叶枯病、枯萎病、霜霉病等；主要虫害包括菊蚜虫、蛴螬、地老虎等,制定依据参照文献1。2.5防治原则贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，因地制宜，综合运用农业防治、生物防治、化学防治等措施，实现菊花主要土传病害的有效防控与可持续治理。菊花中农药残留限量应符合GB2763的要求。制定依据：贯彻以“预防为主，综合防治”的植保方针。2.6防控技术2.6.1农业防治2.6.1.1选用抗（耐）病品种选用健壮植株，培育健壮菊苗。种植时采用种苗消毒措施，推广发展脱毒苗。制定依据：病虫害绿色防控首先应从源头抓起，选用抗病（耐病）品种和健康无病的种苗。病毒病是菊花生产中的重要问题，感染病毒会导致植株矮化、产量降低，商品价值严重下降。因此，通过茎尖快繁等技术培育脱毒菊花种苗十分必要，可明显降低病毒在田间的传播风险,制定依据参照文献2。2.6.1.2轮作实行轮作，合理间作，加强土、肥、水管理。清除前茬菊花宿根和枝叶，实行秋冬深翻，减轻病虫害危害基数。制定依据：长期连作会导致土传病原菌和地下害虫卵的累积，增加病虫害发生风险。研究表明，菊花连作2～3年后植株死亡率可高达60%，产量和品质大幅下降。因此，在菊花种植中实行与非菊科作物的轮作或间作是必要措施，可打破病原物生活循环，降低土壤中病菌和害虫基数，制定依据参照文献3。2.6.1.3田园卫生在菊花生长过程中，发现病株及时拔除，并采用药剂进行局部处理；收获后，及时清除菊花残体或在残体上喷施秸秆腐熟菌，使菊花残体腐烂。制定依据：清洁的田园环境可切断病虫害传播循环。菊花生长期一旦发现病株或病叶，应及时拔除或剪除，并将病残体集中深埋或高温堆沤处理，避免病原菌和害虫滋生蔓延。加强田间卫生还能防止病虫越冬：菊花收获后要彻底清除残枝落叶并销毁，以消灭越冬虫源和侵染源，制定依据参照文献4，5。2.6.1.4栽培管理适时播种，培育壮苗，合理密植，及时调整植株，适时采收，保护地栽培科学调节光照和温、湿度合理肥水，肥料使用应符合NY/T496的规定。实行氮、磷、钾肥平衡施肥，提倡增施生物肥或经无害化处理的有机肥，减少化肥用量，追肥宜采用肥水一体化。强降雨后及时清沟沥水，避免阴雨天进行农事操作。制定依据：通过改进栽培措施增强植株健康，可提高菊花抗病虫能力并抑制病虫发生。一是适期播种定植并培育健壮菊苗，避免幼苗期遭受病虫侵染。二是合理密植，保持通风透光的种植密度（如行株距约70×30cm），防止过度郁闭，以降低白粉病、红蜘蛛等病虫害发生风险。三是科学调节栽培环境，保护地种植时控制好光照、温湿度，避免高湿不通风条件，以减少灰霉病等真菌病害发生概率。同时在雨季做好排水，中耕松土提高土壤通气性，尤其是在强降雨后及时清沟沥水，制定依据参照文献6，7。2.6.1.5水肥管理加强肥水管理，防治土传病害的传播和蔓延。推荐使用滴灌或喷灌进行浇水，生育期早期采用滴灌进行浇水，中后期可采用喷灌进行浇水。推荐测土配方施肥、增施有机肥。制定依据：水肥管理与土传病害的发生密切相关。推广滴灌或渗灌等灌溉方式代替大水漫灌和叶面喷灌，可降低田间湿度和叶面潮湿度，从而明显减少真菌和细菌性病害的滋生。研究指出，传统喷灌常使叶片长时间潮湿，易滋生霉菌，而滴灌保持叶片干燥可使相关病害发生率大幅下降。施肥方面，应遵循NY/T496等标准进行平衡施肥，注意氮、磷、钾养分配比，避免偏施氮肥导致植株徒长感病。提倡增施腐熟有机肥和生物有机肥，以改良土壤理化性状，促进菊花根系发育，提高植株抗逆性，制定依据参照文献8。2.6.2物理防治2.6.2.1人工捕杀采用人工捕捉害虫，摘除病叶集中销毁。制定依据：在病虫害初发阶段，利用人工方法直接清除害虫可以降低虫口密度，控制虫害蔓延。例如，对成虫较大的菊花害虫，可选择其活动迟缓的时段（清晨或傍晚）进行人工捕捉、拍打捕杀。对于发生在叶片或枝条上的菊花卵、幼虫和病叶，也可及时人工摘除并集中销毁，以减少后续传播源，制定依据参照文献9。2.6.2.2理化诱控利用害虫的趋避性，使用灯光、色板、异性激素等诱杀，或有色地膜等拒避害虫。制定依据：利用害虫的趋光性、趋色性和化学信息素趋向，可采取灯光、色板及性诱剂等进行诱杀，降低田间害虫基数。例如，在菊花田间悬挂黄色黏虫板可有效诱集并粘杀蚜虫、粉虱等有翅成虫，悬挂蓝色黏虫板则可诱杀蓟马等薊马类害虫。性信息素诱捕器针对特定鳞翅目害虫（如夜蛾类）的成虫具有专一诱引作用，可在田间布设诱捕盒诱杀斜纹夜蛾、甜菜夜蛾等成虫以干扰其交配产卵。2.6.2.3防虫网阻隔采用防虫网等材料控制虫害。制定依据：在温室、大棚等设施栽培中广泛采用防虫网等物理屏障来隔离虫源，以保护菊花免受害虫侵入。防虫网具有机械阻隔作用，能有效防止蚜虫、粉虱等传毒昆虫进入棚室，从而减少病毒病的传播风险。2.6.3生物防治2.6.3.1生物菌剂预防土传病害，宜在播种或定植前使用木霉菌、芽孢杆菌等生物菌剂进行土壤处理；防治蚜虫、甜菜夜蛾等害虫，宜在害虫发生初期或低龄幼虫期，使用金龟子绿僵菌，球孢白僵菌或甜菜夜蛾核型多角体病毒等生物农药。药剂和使用见附录B。制定依据：：利用拮抗微生物预防和治理菊花土传病害是绿色防控的重要措施之一。在菊花播种或定植前，可施用木霉菌（Trichodermaspp.）或芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis等）制成的生物菌剂对土壤进行处理，抑制土壤中病原真菌的生长繁殖。田间试验表明，在土传病害较重的地块施用上述生防菌剂后，菊花根腐病、枯萎病等病害的发生率明显降低。制定依据参照文献10。2.6.3.2生物农药使用生物源农药，如微生物农药和植物源农药。制定依据：生物源农药是指来源于生物体的农药，包括微生物农药和植物源农药等，在菊花病虫害绿色防控中具有不可替代的作用。微生物农药如苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,BT）制剂对菊花上的夜蛾类幼虫、防治菊花食心虫等具有高效杀虫活性；阿维菌素（由放线菌产生的发酵产物）对螨类和食叶害虫也有良好的防治效果。此外，植物源农药如烟碱、苦参碱、除虫菊素等从植物中提取的活性物质，对菊花常见害虫（蚜虫、蓟马等）有驱避和毒杀作用，同时对天敌和环境影响较小。2.6.3.3释放天敌利用食蚜蝇防治蚜虫，保护和利用菊花地中的瓢虫、蜘蛛、草蛉、寄生蜂、鸟类等有益生物，减少对天敌的伤害。制定依据：保护和利用害虫天敌是菊花有害生物综合治理的核心措施之一。菊花种植环境中存在丰富的天敌资源，例如捕食性瓢虫、草蛉、蜘蛛、食蚜蝇和寄生蜂等，它们能以捕食或寄生方式抑制多种害虫种群2.6.4化学防治2.6.4.1种苗处理种苗可采用药剂进行浸种消毒处理，后按照常规方法播种。制定依据：对菊花种子、扦插苗等繁殖材料进行适当的药剂处理，能够消除潜在病原菌，确保苗木健康。播种前可采用种子消毒，例如用适宜的杀菌剂浸种以杀灭表面和内部携带的真菌病菌；扦插繁殖时可将菊花插穗在生根剂和广谱杀菌剂溶液中蘸根处理，再行扦插。2.6.4.2土壤消毒对于土传病害严重地块在菊花种植前可进行土壤消毒处理。土壤消毒可使用的药剂包括氯化苦、棉隆、威百亩等。按照NY/T2725和NY/T3129的规定进行氯化苦和棉隆土壤消毒处理，消毒7d~15d后，揭膜敞气，经安全性测试后，移栽。制定依据：土壤中的残留病原和虫卵是菊花连作病虫害高发的重要原因，对于曾经暴发过严重土传病害的田块，在下茬菊花种植前进行土壤消毒十分必要。化学土壤消毒通常采用土壤熏蒸技术：在整地时施入土壤消毒剂后覆膜密闭，通过产生的有毒气体杀灭土壤中的病原菌、害虫以及杂草种子，达到消毒目的。2.6.4.3生育期药剂防治 对菊花整个生育期的病虫害进行精确诊断和监测，根据主要病虫害发生情况，优先选择高效、低风险农药防治。在无登记农药可用时，按当地农业农村部门的临时用药管理规定，选择相应的防治用药。使用农药应符合GB/T8321、NY/T1276、NY/T393的要求。药剂和使用见附录A。制定依据：在菊花整个生育周期中，应当坚持“预防为主、综合防治”的植保原则，科学合理地使用化学农药。首先，在病虫害尚处于低发水平时，尽量通过农业、物理、生物措施将其控制在经济阈值以下，避免不必要的化学干预。当预测主要病虫害可能暴发或已达到防治指标时，再有针对性地选用高效、低毒低残留的农药品种进行防治。优先选用对蜜蜂、天敌等安全的生物源或仿生农药，以及经过登记的专用农药品种，以降低环境风险。施药应对准靶标害虫或病害，确保喷雾均匀周到，避免过量和频繁用药，以防产生抗药性。对于菊花等食用或观赏两用类作物，还应严格遵守农药安全间隔期（PHI），即最后一次施药至采收应间隔足够天数以确保残留降解2.7施药防护田间喷药作业时，应采取佩戴防护口罩、手套、穿防护服等必要的安全防护措施。避免逆风或高温时段喷药作业，对施药周边有养蜂、养鱼和养蚕的，应采取避害措施。制定依据：参照GB12475-2006《农药贮运、销售和使用的防毒规程》和NY/T1276-2007《农药安全使用规范总则》，结合田间防护规范制定。防护要求兼顾农药安全、操作便捷及作业环境适应性，确保农户安全。2.8生产记录和档案管理生产过程中应详细记录防治对象、防治技术、使用时间、技术负责人、操作员等信息。化学防治时应建立农药使用档案，详细记录农药名称、农药来源、农药登记证号、剂型、有效成分、规格、防治对象、用药量、施用方式、施药器械、使用次数、安全间隔期、施药间隔期等信息，具体操作应符合附录B的要求。记录保存2年以上。制定依据：依据《农产品质量安全法》第三章“生产管理”条款及农业农村部农产品可追溯体系建设规范，要求建立菊花病虫防控档案，实现全程记录与可追溯，确保管理规范化与合规性。三、试验验证的分析、综合报告，技术经济论证，预期的经济效益、社会效益和生态效益(一)福白菊根腐病引起的连作障碍致病菌鉴定麻城市福白菊根腐病是危害福白菊产业健康发展的重要的土传病害，在连作时间超过3年，根腐病严重发生，引起严重产量损失，品质也显著下降。传统防治方法主要是应用化学药剂，如噁霉灵、甲霜灵等化学药剂进行灌根处理，不仅用药量大，而且耗时耗力，效果也不显著，并带来农残超标等环境和食品安全问题。然而，长期以来，缺乏对福白菊根腐病发生和危害的系统研究，导致根腐病在产区发生情况愈加严重。本研究在麻城市福白菊主产区开展了大量调查和取样分析，以及室内鉴定工作，掌握了福白菊根腐病发生和危害情况，明确了主要致病病原，为该病的防治打下坚实基础。1材料与方法1.1福白菊根腐病发病情况调查与病原鉴定 根腐病危害情况调查：2021年6月-7月间于麻城黄土岗镇伍家河村、张家墩村、菊园以及福田河镇纯阳山村、杨家洼村等5个点，采用目测方法调查根腐病发病情况并记录。病原菌分离：对福白菊根腐病病株进行采集。对福白菊根腐病病原菌采用组织分离法进行分离。将采集病株洗净晾干，取病健交界处约4mm×4mm的组织块，70%乙醇消毒30s后，再用3%次氯酸钠溶液消毒5min、无菌水漂洗3次，最后用灭菌滤纸吸干多余水分，接种于虎红培养基中央，28℃恒温培养箱中培养3d,待菌丝长出后采用挑取菌丝尖端法进行多次纯化。病原菌鉴定：将分离得到的菌株接种在PDA培养基上，28℃恒温培养箱中倒置培养5d，肉眼观察菌丝的生长状况、菌落颜色和质地；显微镜下观察孢子类型、孢子形状、有无隔膜等。据观察到的病原菌形态特征，参考《植物病原真菌学》对病原菌进行形态学鉴定。利用真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测定的rDNA-ITS序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析。使用MEGA7.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定菌株的种类。病原菌接种鉴定：采用分生孢子悬浮液进行活体灌根接种。将纯化后的病原菌在PDB液体培养液中28℃振荡(160r/min)培养3d，过滤除去菌丝体，配置成浓度为106个孢子/mL的分生孢子悬浮液，对1个月苗龄的健康福白菊进行伤根处理，并在根部接种分生孢子悬浮液，每株接种5mL，重复10次，以接种无菌水为空白对照。接种后观察福白菊叶片枯萎及根部发病情况，待植株发病后进行病原菌的再次分离，将分离菌株的菌落、分生孢子形态等与原始接种菌株进行比较。1.2福白菊根腐病根部真菌多样性分析对健康(CK)、轻微发病(B1)与重度发病(B2)的福白菊根部真菌进行高通量测序。植物基因组DNA采用试剂盒(天根生化科技有限公司)进行提取。所得DNA使用NanoDrop2000和1%琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度和质量。首先采用通用引物(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA/GCTGCGTTCTTCATCGATGC)对植物真菌进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：98℃变性5min；98℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min(25个循环)；72℃时最终延伸5min。PCR扩增产物采用AgencourtAMPureBeads试剂盒纯化后，使用PicoGreendsDNA检测试剂盒进行定量，然后在上海派森诺生物科技有限公司IlluminaMiSeq平台上进行pair-end测序(2×300bp)。2结果与分析2.1麻城福白菊根腐病发生情况对麻城不同地点不同种植年限的福白菊进行根腐病调查发现(表1)。伍家河连作4年发病率为20%，连作6年发病率为62%。张家墩连作2年发病率为13%，连作4年发病率为24%，连作5年发病率为30%。菊园连作4年发病率为26%。纯阳山连作两年发病率为11%，连作4年发病率为22%，连作5年发病率为43%。杨家洼连作3年发病率为10%，连作5年发病率为17%，连作6年发病率为39%。连作障碍田地福白菊幼苗大量死亡与萎蔫(图1)，并且与健康植株对比，其植株矮小，分枝数少，根系不发达(图2)，严重影响产量。表1麻城福白菊不同连作年限根腐病发生情况地点连作时间(年)调查总株数死苗数萎蔫数总发病数发病率(%)伍家河41001552020610052106262张家墩21008513134100159242451002553030菊园41002062626纯阳山21005611114100157222251003494343杨家洼310055101051001251717610026133939图1健康田地(A)与连作障碍田地(B)图2患病植株(左)健康植株(右)2.2福白菊根腐病根部真菌多样性分析福白菊根腐病根部真菌多样性分析显示，在所有处理中Fusarium是最主要的菌群(图3)，占总菌群的9.34%−46.51%。B1(轻病)与B2(重病)中的Fusarium相对丰度分别为36.38%和46.51%，与CK(9.34%)相比显著增加了289.47%与397.89%(P<0.05)，说明镰刀菌是主要的致病菌。图3福白菊根腐病根部镰刀菌含量2.3福白菊根腐病病原菌分离与鉴定病原菌分离：对福白菊根腐病病原菌进行分离鉴定，其中分离得到的真菌主要为腐皮镰刀菌(表2)，共35株，每个取样点分离得到的腐皮镰刀菌数量分别为8、6、7、8、6，占每个地区分离真菌总数的66.67%−88.89%。每个取样点分离得到的尖孢镰刀菌数量分别为2、0、2、0、1，占每个地区分离真菌总数的0%−18.18%。而分离得到的其它真菌数量分别为1、3、2、3、2，占每个地区分离真菌总数的11.11%−33.33%。病原菌鉴定：对所采集的患有根腐病的福白菊进行病原菌的分离培养，所分离得到的菌体菌丝白色、棉絮状(图4A)，分生孢子呈椭圆状、镰刀型，有1个隔膜(图4B)，初步鉴定为镰刀菌(Fusarium)。采用通用引物ITS1/ITS4扩增出菌株WH02的rDNA-ITS长度为541bp，在NCBI数据库中进行同源性序列比对结果见图5。该菌株的rDNA-ITS序列与FusariumsolaniG6(Genbank登录号：OM283617)相似性最高，为99.63%。综合形态学和rDNA-ITS鉴定结果，将该菌株鉴定为腐皮镰刀菌WH02(FusariumsolaniWH02)。病原菌接种鉴定：接种30天后，接种腐皮镰刀菌WH02的福白菊幼苗叶片萎蔫，根部腐烂(图6)，发病率达到60%，而未接种的发病率为0%(图7)。再次对发病组织进行分离、培养、纯化，结果表明仍为腐皮镰刀菌。表2麻城福白菊根腐病病原菌鉴定取样点菊花病株数分离病原镇村腐皮镰刀菌占比尖孢镰刀菌占比其它占比黄土岗伍家河6888.89%221%111.11%张家墩7666.67%00%333.33%菊园6763.63%218.18%227.27%福田河纯阳山6872.72%00%327.27%杨家洼5666.67%111.11%218.18%图4菌株WH02菌落和孢子图5基于rDNA-ITS基因序列的系统发育树括号中序号代表菌株的登录号；分支点上的数字代表bootstrap值；标尺代表进化距离图6WH02组(A)和CK组(B)植株图7WH02组(A)和CK组(B)发病率2.4、腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌特异性检测技术以镰刀菌特有序列为目标片段，建立实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法，通过特异性试验和灵敏度试验检测结果显示该qPCR方法对镰刀菌具有良好的特异性(图8−10)。检测方法如下：qPCR反应体系(20μL)为：10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各1μL、ddH2O3μL、稀释50倍的DNA模板5μL，每个样品3次重复，反应条件设置为：95℃保温3min，PCR反应40个循环(95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸40s)，72℃保温2min。以10倍梯度稀释质粒DNA绘制标准曲线。镰刀菌所用引物为(ATGGGTAAGGARGACAAGAC/GGARGTACCAGTSATCATG)，腐皮镰刀所用引物为(GGAACAGACGGCCCTGTAAC/AGAGCCAAGAGATCCGTTGTT)，尖孢镰刀菌所用引物为(ACAACTCCCAAACCCCTGTG/GAGTTTAGGGGTCCTCTGGC)。图8镰刀菌引物验证1：疫霉菌；2：立枯丝核菌；3：核盘菌；4：炭疽菌；5：腐皮镰刀菌；6：尖孢镰刀菌；7：稻瘟菌；8：角担菌图9腐皮镰刀菌引物验证1：疫霉菌；2：尖孢镰刀菌；3：腐皮镰刀菌；4：立枯丝核菌；5：核盘菌；6：炭疽菌；7：稻瘟菌图10尖孢镰刀菌引物验证1：疫霉菌；2：立枯丝核菌；3：核盘菌；4：腐皮镰刀菌；5：尖孢镰刀菌结论1.明确福白菊根腐病在麻城市菊花主产区的发生情况，连作2-3年发生较为严重，连作5年以上产量损失特别严重。2.明确了腐皮镰刀菌是福白菊根腐病的主要病原菌，建立了镰刀菌、腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌的特异性检测技术。

（二）福白菊根腐病高效生防菌研发福白菊根腐病作为危害最大的土传病害之一，目前主要的防治方法分为化学防治、生物防治、农业防治等。化学防治是目前最主要的防治措施，但长期大量地使用化学农药，不仅导致病原菌产生较为严重的抗药性，而且造成环境和食品安全问题。农业防治主要包括种植抗病品种、改变种植制度或方式，其中以选育抗病品种最为经济有效，但病原菌变异快，品种抗性易丧失，且缺乏高抗细菌性病害的商业化品种。生物防治是利用有益微生物来防控病害的方法，同化学防治相比，该方法不仅环境兼容性好，对土壤、水体等无污染，而且在农产品中无残留。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是近年新发现的一种芽孢杆菌属细菌，具有抑菌活性好、抗菌谱广等特点。继续深入研究该菌的抗菌机制和完善生产加工工艺，将为开发新一代防控土传病害的生物农药奠定良好基础。1材料与方法1.1生防菌菌株鉴定形态学鉴定：将−80℃甘油管保存的菌种在LB平板上活化，28℃条件下培养24−48h，观察菌落形态，采用Guo等人方法[24]制备样品用于扫描电镜观察。生理生化鉴定：与《常见细菌系统鉴定手册》所述方法进行生理生化鉴定，包括革兰氏染色、V−P测试、葡萄糖利用、木糖利用、甘露糖利用、蛋白水解、H2O2酶、乳糖、淀粉水解等测试。16SrRNA序列扩增与同源分析：采用CTAB法提取菌株JJYY基因组DNA，参照前人方法进行基因组DNA提取和采用16SrRNA通用引物27F(5′−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3′)/1492R(5′−CTACGGCTACCTTGTTACGA−3′)进行PCR扩增，测序后在NCBI网站上进行BLAST比对，并利用MEGA11.0软件采用邻接法构建系统发育树。1.2菌株JJYY对土传病原菌EC50测定采用乙酸乙酯萃取法提取菌株JJYY代谢产物，所得提取物于−20℃冰箱保存。分别采用比浊法和菌丝生长抑制法测定提取物对4种土传病原细菌(番茄青枯菌、生姜青枯菌、胡萝卜软腐果胶杆菌、菊果胶杆菌)和5种土传病原真菌(腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、核盘菌、疫霉菌、立枯丝核菌)的EC50。1.3菌株JJYY对3种土传病害的防控效果评价对番茄青枯病防控效果的评价。将3种不同浓度的JJYY发酵液(108、107、106CFU/mL)按10mL/株灌到4−6叶期番茄苗根部，24h后接种5mL浓度为108CFU/mL的番茄青枯菌，链霉素作为化学药剂对照，无菌水作为空白对照，每个处理10株，3个重复。幼苗放置于温室中培养：温度30℃，12h光照，12h黑暗。接种15d后，观察发病情况，调查病情指数，番茄青枯病病情分级标准如下：0级：无症状；1级：1%−25%萎蔫；2级：26%−50%萎蔫；3级：51%−75%萎蔫；4级：76%−100%萎蔫。对福白菊根腐病和辣椒枯萎病防控效果的评价。试验分别采用温室培养健康的4−6叶期福白菊和辣椒幼苗，方法如下：将不同浓度的菌株JJYY发酵液(108、107、106CFU/mL)按照10mL/株灌入幼苗根部。24h后，灌入5mL107个孢子/mL腐皮镰刀菌孢子悬浮液(福白菊)，或尖孢镰刀菌孢子悬浮液(辣椒)。30%噁霉灵1000倍液为阳性对照，无菌水作为空白对照。每个处理10株，3个重复。温室培养条件：温度28℃，12h光照，12h黑暗。接种30d后，分别调查福白菊与辣椒病情指数。菊花根腐病病情指数分级标准如下：0级：叶片无症状；1级：1%−25%叶片枯萎变黄；2级：26%−50%叶片枯萎变黄；3级：51%−75%叶片枯萎变黄；4级：76%以上叶片枯萎变黄。辣椒枯萎病病情分级标准如下：0级：叶片无症状；1级：1%−25%叶片枯萎；2级：26%−50%叶片枯萎；3级：51%−75%叶片枯萎；4级：76%−100%叶片枯萎，植株死亡。1.4菌株JJYY抗菌成分分离和鉴定采用反相制备液相色谱对菌株JJYY发酵提取物进行初步分离纯化，使用氮吹仪将分离组分干燥后使用甲醇进行溶解使其浓度为2mg/mL，采用牛津杯法对分离得到的组分进行对青枯菌的抑制活性的检测，分别取100µL加入至牛津杯，每个组分重复3次，甲醇为对照，对有活性的组分采用超高效液质联用进行分析。根据组分的分子离子、碎片离子、紫外吸收光谱及保留时间等数据，查阅相关文献进行化合物初步鉴定。1.5菌株JJYY对腐皮镰刀菌的抗菌机制根据JJYY提取物对福白菊腐皮镰刀菌EC50测定结果，将JJYY提取物调整为EC50与EC90，与腐皮镰刀菌孢子共培养，反应体系如下(10mL)：PDB培养基8mL，腐皮镰刀菌孢子液1mL(108个孢子/mL)，JJYY提取物1mL，甲醇作为对照(CK)。28℃，150r/min条件下培养2h，进行扫描电镜观察、RNA提取与转录组测序。2结果与分析2.1菌株JJYY鉴定形态学鉴定结果：菌株JJYY在LB培养基上生长的菌落呈乳白色、半透明状，表面褶皱，有黏性(图11A)。菌体为杆状，大小为2.0−3.5μm(图11B)。生理生化鉴定结果：菌株JJYY生理生化鉴定结果见表3。该菌株革兰氏染色、V−P测试、葡萄糖利用、木糖利用、甘露糖利用、蛋白水解、H2O2酶、乳糖、淀粉水解、脲酶、甘油、果糖利用、蔗糖利用、柠檬酸盐利用阳性，甲基红、硝酸还原阴性。16SrRNA鉴定结果：采用通用引物27F/1492R扩增出菌株JJYY的16SrRNA长度为1000bp(GenBank登录号：OQ749654)，在NCBI数据库中进行同源性序列比对(图12)，该菌株的16SrRNA序列与B.velezensisGS-7(Genbank登录号：MT365117)相似性最高，为99.80%。综合形态学、生理生化和16SrRNA鉴定结果，将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)JJYY。图11菌株JJYY菌落和菌体图A：LB培养基上的菌落；B：菌体扫描电镜图表3菌株JJYY的生理生化分析结果TestitemsResultTestitemsResultGramstain+Proteolysis+Methylredtest−Catalase+V−Ptest+Lactose+Nitratereduction−Starchhydrolysis+Citrate+Urease+Glucose+Glycerol+Xylose+Fructose+Mannose+Sucrose++：阳性反应；−：阴性反应图12菌株JJYY基于16SrRNA基因序列的系统发育树括号中序号代表菌株的登录号；分支点上的数字代表bootstrap值；标尺代表进化距离2.2菌株JJYY对重要土传病原菌EC50测定菌株JJYY代谢产物对9种土传病原菌的EC50测定结果见表4。对4种土传病原细菌的EC50在0.940−1.092mg/mL之间，对菊果胶杆菌的EC50最小(0.940mg/mL)，然后依次为生姜青枯菌(0.949mg/mL)、胡萝卜软腐果胶杆菌(1.069mg/mL)、番茄青枯菌(1.092mg/mL)；对5种土传病原真菌的EC50在2.733−3.678mg/mL之间，对腐皮镰刀菌的EC50最小(2.733mg/mL)，然后依次为尖孢镰刀菌(2.900mg/mL)、疫霉菌(3.001mg/mL)、核盘菌(3.377mg/mL)、立枯丝核菌(3.678mg/mL)。表4菌株JJYY对9种土传病原菌的EC50测定结果类型植物土传病原菌宿主EC50(mg/mL)回归方程r2细菌R.solanacearum番茄1.092Y=0.529X−0.5210.932R.solanacearum生姜0.949Y=0.724X−0.6210.920P.carotovorum油菜1.069Y=0.517X−0.4950.945P.chrysanthemi魔芋0.940Y=0.648X−0.5360.944真菌F.solani福白菊2.733Y=0.157X−0.3320.936F.oxysporum辣椒2.900Y=0.136X−0.2990.929S.sclerotiorum油菜3.377Y=0.122X−0.3350.951P.capsica辣椒3.001Y=0.092X−0.1700.932R.solani黄瓜3.678Y=0.095X−0.2760.9452.3菌株JJYY对3种土传病害的防控效果评价菌株JJYY对番茄青枯病、菊花根腐病和辣椒枯萎病的防控效果见表5。在3种不同浓度JJYY发酵液处理中，以108CFU/mL处理对番茄青枯病的病情指数最低(10.83)且防效最高(87.74%)，其防效与链霉素处理相比无显著差异(90.57%，P>0.05)，高于107CFU/mL处理(84.91%)，显著高于106CFU/mL处理(69.81%，P<0.05)。对菊花根腐病的防效（图13），以108CFU/mL处理病情指数最低(13.33)且防效最高(82.02%)，其防效高于107CFU/mL处理(77.53%)，显著高于106CFU/mL处理(60.67%，P<0.05)，而与噁霉灵处理相比无显著差异(84.27%，P>0.05)。对辣椒枯萎病的防效，以108CFU/mL处理的病情指数最低(14.17)且防效最高(80.00%)，其防效高于107CFU/mL处理(75.29%)，显著高于106CFU/mL处理(61.18%，P<0.05)，而与噁霉灵处理相比无显著差异(82.35%，P>0.05)。表5菌株JJYY对3种土传病害的防控效果处理番茄青枯病菊花根腐病辣椒枯萎病病情指数防效(%)病情指数防效(%)病情指数防效(%)106CFU/mL26.67±3.82b69.81±4.32b29.17±5.20b60.67±7.02b27.50±4.33b61.18±6.11b107CFU/mL13.33±3.82c84.91±4.32a16.67±1.44c77.53±1.95a17.50±2.50c75.29±3.53a108CFU/mL10.83±1.44c87.74±1.63a13.33±2.89c82.02±3.89a14.17±3.82c80.00±5.39aStreptomycin8.33±3.82c90.57±4.32a−−−−Hymexazol−−11.67±1.44c84.27±1.95a12.50±2.50d82.35±3.53aCK88.33±1.44a−74.17±7.22a−70.83±2.89a−−：无；同列数据后不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著图13菌株JJYY对福白菊根腐病防效A：106CFU/mL；B：107CFU/mL；C：108CFU/mL；D：恶霉灵；E：CK2.4菌株JJYY抗菌成分分离和鉴定菌株JJYY代谢产物经反向制备液相色谱分离获得30个组分，如图13所示其中9个组分表现出抗青枯菌活性，保留时间(retentiontime，RT)分别为13.30、13.65、14.18、15.30、15.75、16.80、17.30、18.93、24.90min，其抑菌圈半径(Inhibitionzoneradius，IR)在0.60cm−1.70cm之间。质谱分析结果表明组分4(RT:15.30min)最大紫外吸收峰值为227nm；264nm，ESI−MSM/Z：663.46[M−H]−，687.53[M+Na]+，正离子模式下主要碎片离子为349.34、367.36、385.57，得出该化合物分子量为664.46；组分8(RT:18.93min)最大紫外吸收峰值为226nm；262nm，ESI−MSM/Z：487.63[M−H]−，511.53[M+Na]+，正离子模式下主要碎片离子为349.44、367.55，得出该化合物分子量为488.35。这2种化合物质谱特征与文献报道的macrolactinD和7−O−malonyl−macrolactinA的分子量和碎片离子完全一致，因此将其初步推断为macrolactinD和7−O−malonyl−macrolactinA。另外7个组分因成分复杂，有待进一步纯化鉴定。图14分离得到9种抗菌组分对青枯菌抗性结果A：组分1(RT：13.30min，IR=1.30±0.10cm)；B：组分2(RT：13.65min，IR=1.43±0.06cm)；C：组分3(RT：14.18min，IR=1.33±0.06cm)；D：组分4(RT：15.30min，IR=1.03±0.10cm)；E：组分5(RT：15.75min，IR=1.70±0.10cm)；F：组分6(RT：16.80min，IR=0.60±0.00cm)；G：组分7(RT：17.30min，IR=1.03±0.06cm)；H：组分8(RT：18.93min，IR=1.53±0.10cm)；I：组分9(RT：24.90min，IR=1.30±0.10cm)；J：甲醇处理2.5菌株JJYY对腐皮镰刀菌的抗菌机制菌株JJYY提取物对腐皮镰刀菌孢子扫描电镜结果显示(图15)，在EC50与EC90浓度下，未见腐皮镰刀菌孢子萌发，且孢子发生明显破裂，内容物溢出。CK组腐皮镰刀菌孢子可见明显芽管萌发，且没有明显的细胞碎片堆积，孢子形态完整。转录组分析显示，在CK-vs-EC90组中共检测到3510个差异表达基因(图16)，其中上调1470个，下调2040个；在CK-vs-EC90组中共检测到1278个差异表达基因，其中上调465个，下调813个。差异基因按照Qvalue富集的前20条KEGG途径分别如图17所示。CKvsEC90分别有33、33、29、27、10、6和15个基因显著富集于内质网中的蛋白质加工、淀粉和蔗糖代谢、真核生物核糖体的生物发生、剪接体、乙醛酸与二羧酸代谢通路中。CKvsEC50分别有15、13、13、11、10个基因显著富集于过氧化物酶体、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、乙醛酸与二羧酸代谢、丙酮酸代谢通路中。图15菌株JJYY提取物与腐皮镰刀菌孢子作用扫描电镜结果A：EC90；B：EC50；C：CK图16CKvsEC90与CKvsEC50差异表达基因图17KEGG富集散点图A：CKvsEC90；B：CKvsEC503结论贝莱斯芽孢杆菌JJYY具有高效的生防潜力，可对多种土传病害起到良好的抑制效果，并可通过抑制腐皮镰刀菌的孢子萌发、破坏镰刀菌孢子结构、抑制菌丝生长、抑制镰刀菌转录表达而发挥抗菌作用。（三）麻城福白菊根腐病连作障碍绿色防控技术土壤熏蒸是目前防治土传病害的重要方法之一，常见的土壤熏蒸剂包括氯化苦和棉隆等。但由于氯化苦的高毒性在中国被禁止使用。棉隆是一种低毒农药，可以控制各种病害，使用方便。然而，它显著降低了土壤微生物多样性和酶活性。土壤微生物对生态系统中的土壤养分循环、碳固存和作物生长至关重要。本研究在麻城市5年连作田上，采用田间试验研究了棉隆熏蒸以及菌株JJYY结合施用对福白菊根腐病的防治效果，并进一步研究了对福白菊花头生物活性化合物含量、土壤化学性质和酶活性以及微生物群落变化。旨在为促进菊花产业的健康发展，制定一种生态友好的防治福白菊根腐病的策略，并开发一种更好的熏蒸土壤与土壤生物活化相结合的方法。材料与方法1.1试验时间和地点试验于2021年4月9日~2021年11月20日，在麻城市黄土岗镇伍家河村进行。1.2试验处理采用随机分布设计，在小区中建立了5个处理，每个处理3个重复。每个地块的面积为60.0m2，长10.0m，宽6.0m，由深度0.4m，宽0.3的隔离行分隔。处理1(DZ)：棉隆熏蒸，该处理于4月9日进行，按照300kg/hm2剂量进行棉隆熏蒸处理，并覆盖薄膜20天，之后掀开薄膜敞气10天。处理2(Bv)：通过灌根法施用生物菌剂JJYY，总用量为225kg/hm2，在整个生长季节使用三次，每次使用75kg/hm2。将JJYY发酵液稀释100～200倍，分别于5月9日、7月10日和9月20日灌根。处理3(DB):在DZ熏蒸后施用JJYY，相应的操作方法分别参考处理1和2。处理4(DBO):利用JJYY、有机肥和棉隆熏蒸。处理方法如下：在DZ熏蒸田内，将有机肥料以3000kg/hm2的用量撒入幼苗周围的土壤表面，然后参照处理2施用JJYY。处理5(CK):不进行任何处理。福白菊苗于5月9日人工移栽，11月5日至20日收获。1.3样品采集在收获结束时，每个地块按照五点取样法，从15cm深的处采集土壤样本。土壤样品通过2毫米筛网，以去除残渣。每个土壤样品分为两部分：第一部分在-80℃下冷冻，用于Miseq测序和qPCR分析，另一部分在4℃下储存，用于土壤理化性质测定。1.4土壤理化性质测定参照《土壤农化分析》中的测定方法，土壤pH的测定采用电位法(水:土=2.5:1)，土壤有机质(Soilorganicmatter，SOM)含量的测定采用重铬酸钾氧化−容量法，通过连续流动分析测定NH4+-N和NO3--N的含量。速效磷(AvailableP，AP)含量的测定采用碳酸氢钠浸提法，速效钾(AvailableK,AK)含量的测定采用乙酸铵提取法。1.5福白菊产量与品质测定从每个小区收集的花头进行蒸汽杀青处理，然后在70℃下用热空气干燥10小时，以进一步测定产量和其他指标。为了检测福白菊生物活性化合物，将福白菊花头研磨成粉末并通过2mm的筛网。按照《中国药典》中描述的方法提取和测定绿原酸、木犀草素以及总黄酮含量。1.6土壤DNA提取与qPCR检测土壤基因组DNA采用FastDNASPINKit试剂盒进行提取。采用qPCR技术测定土壤镰刀菌以及土壤氮循环基因丰度，包括，包括固氮酶(nifH)、氨单加氧酶(AOA-amoA)、氧化亚氮还原酶(nosZ)、脲酶(UreC)和反硝化基因(nirS)的丰度。qPCR反应体系(20μL)为：10μLSYBRGreenMasterMix、上下游引物各1μL、ddH2O3μL、稀释50倍的DNA模板5μL，每个样品3次重复，反应条件设置为：95℃保温3min，PCR反应40个循环(95℃变性20s，退火20s，72℃延伸40s)，72℃保温2min。以10倍梯度稀释质粒DNA绘制标准曲线。所用引物见表6。表6本研究所用引物序列基因引物名称序列(5′-3′)退火温度(℃)nifHnifHFAAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC60nifHRbTGSGCYTTGTCYTCRCGGATBGGCATAOA-amoACrenamoA23fATGGTCTGGCTWAGACG55CrenamoA616rGCCATCCATCTGTATGTCCAnirSnirSCd3aFAACGYSAAGGARACSGG55nirSR3cdGASTTCGGRTGSGTCTTSAYGAAnosZF-1181CGCTGTTCITCGACAGYCAG55R-1880ATGTGCAKIGCRTGGCAGAAureCUreC-FTGGGCCTTAAAATHCAYGARGAYTGGG55UreC-RGGTGGTGGCACACCATNANCATRTCFusariumEF1ATGGGTAAGGARGACAAGAC60EF2GGARGTACCAGTSATCATG1.7福白菊土壤细菌与真菌高通量测序将提取的土壤DNA的浓度和质量分别使用NanoDrop2000分光光度计和1.8%琼脂糖凝胶电泳测定。采用细菌通用引物(ACTCCTACGGGAGGCAGCA/CGGACTACHVGGGTWTCTAAT)与真菌通用引物(CTTGTGTCATTTAGAGAAGTAA/GCTGCGTCTTCATCGATGC)分别扩增细菌的16SrRNA区域与真菌的ITS1区域，反应条件如下：95℃变性5min，25个循环(95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s)，最后在72℃延伸7min。PCR扩增产物采用AgencourtAMPureBeads试剂盒纯化后，使用PicoGreendsDNA检测试剂盒进行定量，然后在上海派森诺生物科技有限公司IlluminaMiSeq平台上进行pair-end测序(2×300bp)。测序所得原始数据使用QIIMEv1.8.0软件采用DADA2方法对测序原始数据进行质控、去噪、双端拼接、嵌合体去除，获得扩增序列变体(AmpliconSequenceVariants，ASVs)，代表序列与SILVAv132与UNITE数据库中序列进行同源序列比对并进行物种分类注释。使用Mothur软件计算微生物α多样性(Chao1和Shannon指数)。根际土壤代谢物提取分析基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术进行非靶向代谢组学研究。代谢物提取步骤如下：称取1g新鲜土样，加入5mL的80%甲醇∶水(V∶V)提取液，震荡涡旋1h后，在4℃超声波水浴中振荡裂解1h，取出后置于冰盒，然后于4℃，9500r·min-1条件下离心10min。吸取上清液，使用0.22μm滤膜过滤后注入上样瓶，使用DionexUltimate3000HPLCsystem进行液相色谱分离和质谱分析。结果与分析2.1不同处理对土壤理化性质的影响不同处理对土壤理化性质的影响见表7。四个处理(DZ、Bv、DB和DBO)NH4+-N含量分别为32.49、33.93、36.05、39.72mg/kg，与CK(26.40mg/kg)相比，显著增加了23.07%、28.52%、36.55%、50.45%(P<0.05)。NO3--N含量分别为41.21、52.02、40.66、45.48mg/kg，相比于CK(52.93mg/kg),DZ、DB和DBO处理NO3--N含量分别显著降低22.14%、23.18%、14.08%(P<0.05)，而Bv处理NO3--N含量降低了1.72%。AP含量分别为28.04、30.40、33.58、41.00mg/kg，相比于CK(33.53mg/kg)，DZ、Bv、DB、DBO处理AP含量变化幅度为-13.88%、-9.33%、-9.61%、22.28%，其中DZ与DBO处理达到显著水平(P<0.05)。AK含量分别为132.80、156.46、139.39、146.50mg/kg，与CK(156.46mg/kg)相比，DZ、DB、DBO处理AK含量显著降低了15.12%、10.91%、6.37%(P<0.05)，而Bv处理与CK无显著差异。SOM含量分别为25.46、25.53、26.11、26.28g/kg，相比于CK(26.72g/kg)分别降低了4.72%、4.45%、2.28%、1.65%。pH值分别为5.56、5.55、5.58、5.58，与CK(5.56)相比无显著差异。表7不同处理对土壤理化性质的影响TreatmentNH4+-N(mg/kg)NO3--N(mg/kg)AP(mg/kg)AK(mg/kg)SOM(g/kg)pHDZ32.49±2.01c41.21±3.41c28.04±2.38c132.80±6.07d25.46±1.39a5.56±0.04aBv33.93±2.27bc52.02±3.84a30.40±4.84bc156.46±5.75a25.53±1.20a5.55±0.03aDB36.05±3.74b40.66±2.03c33.58±6.01b139.39±6.87c26.11±0.96a5.58±0.02aDBO39.72±1.41a45.48±2.69b41.00±2.32a146.50±6.12b26.28±1.35a5.58±0.03aCK26.40±1.53d52.93±1.86a33.53±2.22b156.46±3.04a26.72±1.27a5.56±0.04aNote:valuesarethemeans±S.D.;valueswithdifferentlettersdiffersignificantly(P<0.05)asdeterminedbytheDuncantest.2.2不同处理对福白菊产量、品质与防效的影响不同处理对福白菊产量、品质与防效的影响见表8与图18。四种处理(DZ、Bv、DB和DBO)产量分别为2849.80、2236.85、3061.30、3447.40kg/hm2，相比于CK(1008.50kg/hm2)，产量分别显著182.58%、121.80%、203.55%、241.83%(P<0.05)。绿原酸含量分别为3.53、3.54、4.59、4.70mg/g，相比于CK(3.43mg/g)增加了2.92%、3.21%、33.82%、37.03%，其中DB与DBO处理达到显著水平(P<0.05)。总黄酮含量分别为66.61、66.77、68.12、71.67mg/g，相比于CK(60.50mg/g)显著增加了10.10%、10.36%、12.60%、18.46%(P<0.05)。木犀草苷含量分别为4.47、4.76、6.30、6.33mg/g，相比于CK(4.58)变化幅度为-2.40%、3.93%、37.55%、38.21%，其中DB与DBO达到显著水平(P<0.05)。镰刀菌的丰度分别为3.29×106、22.64×106、1.83×106、1.24×106copies/gdrysoil，相比于CK(58.71×106copies/gdrysoil)显著降低86.68%、61.44%、96.88%、97.89%(P<0.05)。对镰刀菌的防效分别为86.35%、61.31%、96.84%、97.91%。表8不同处理对福白菊产量、品质与防效的影响TreatmentYield(kg/hm2)Chlorogenicacid(mg/g)Totalflavonoids(mg/g)Luteoloside(mg/g)Fusarium(106copies/gdrysoil)Controlefficacy(%)DZ2,849.80±61.72c3.53±0.06b66.61±0.49c4.47±0.09b7.82±0.37c86.35±1.08aBv2,236.85±102.87d3.54±0.04b66.77±0.25c4.76±0.06b22.64±3.30b61.31±5.61bDB3,061.30±152.71b4.59±0.06a68.12±0.19b6.30±0.33a1.83±0.23c96.84±0.69aDBO3,447.40±61.46a4.70±0.22a71.67±0.10a6.33±0.16a1.24±0.28c97.91±0.29aCK1,008.50±98.44e3.43±0.13b60.50±0.24d4.58±0.72b58.71±5.60a-Note:valuesarethemeans±S.D.;valueswithdifferentlettersdiffersignificantly(P<0.05)asdeterminedbytheDuncantest.图18不同处理田间图片A：DZ；B：Bv；C：DB；D：DBO；E：CK2.3不同处理对土壤氮循环基因的影响不同处理对土壤氮循环功能基因的影响见表9。相比于CK，所有处理amoA基因丰度变化幅度为0%、10%、20%、16.67%，仅DB与DBO显著增加（P<0.05）。nifH基因丰度变化幅度为-4%、4.33%、16.00%、19.00%，仅DB与DBO显著增加（P<0.05）。nirS基因丰度变化幅度为-9.29%、7.28%、10.99%、20.63%，仅DB与DBO显著增加（P<0.05）。UreC基因丰度变化幅度为8.15%、9.00%、13.52%、23.95%，仅DB与DBO显著增加（P<0.05）。nosZ基因丰度变化幅度为-10.97%、2.45%、15.12%、24.14%，其中DZ、DB、DBO达到显著水平（P<0.05）。表9不同处理对土壤氮循环基因的影响(107copies/gdrysoil)TreatmentamoAnifHnirSUreCnosZDZ0.30±0.01b2.88±0.10b23.43±1.66d61.23±4.00d67.93±1.80dBv0.33±0.01ab3.13±0.31b27.71±0.86bc72.63±2.89bc78.17±2.93cDB0.36±0.02a3.48±0.10a28.67±0.70ab75.64±4.02ab87.84±3.69bDBO0.35±0.02a3.57±0.25a31.16±1.92a82.59±5.32a94.72±1.28aCK0.30±0.02b3.00±0.02b25.83±1.39cd66.63±5.65cd76.30±3.08c高通量测序数据分析细菌16SrRNA基因和真菌ITS1基因的Miseq测序分别获得37342和2451个ASVs(图19)。不同处理中细菌ASVs的数量分别为5692−10758，真菌ASVs数量为301−986。细菌和真菌在各处理中的特有ASVs分别为3334−8835和126−650。图19土壤中细菌(A)和真菌(B)群落的Venn图2.5不同处理对土壤微生物α多样性影响不同处理对土壤细菌α多样性影响结果见图20A、9B。相比于CK，DZ处理细菌Chao1指数显著降低了14.69%(P<0.05)，Bv与DBO处理Chao1指数显著增加了40.75%与40.75%(P<0.05)，而DB与CK无显著差异。DZ处理细菌Shannon指数显著降低了12.72%(P<0.05)，Bv、DB、DBO处理Shannon指数显著增加了17.96%、7.40%与14.80%(P<0.05)。不同处理对土壤真菌α多样性影响结果见图20C、9D。相比于CK，DZ处理Chao1指数显著降低了10.25%(P<0.05)，而Bv、DB和DBO处理Chao1指数显著增加了204.34%、112.79%、170.46%(P<0.05)。DZ处理Shannon指数显著降低了43.31%(P<0.05)，而Bv、DB和DBO处理Shannon指数显著增加了71.25%、114.42%、126.51%(P<0.05)。图20不同处理对土壤细菌和真菌α多样性的影响A：土壤细菌的Chao1指数；B：土壤细菌Shannon指数；C：土壤真菌Chao1指数；D：土壤真菌Shannon指数2.6不同处理对土壤微生物β多样性影响细菌样品的PCoA分析显示(图21A)，第一主成分(PCo1)和第二主成分(PCo2)分别可以解释所有变量的36.9%和20.8%，两个主成分方差贡献率累计达到57.7%。除DZ处理外，其它处理组与CK显著分开。真菌样品的PCoA分析显示(图21B)，第一主成分(PCo1)和第二主成分(PCo2)分别可以解释所有变量的40.2%和23.4%，两个主成分方差贡献率累计达到63.6%。除DZ处理外，其它处理组与CK组显著分开。图21不同土壤处理土壤细菌(A)和真菌(B)群落PCoA分析。不同处理对门水平土壤微生物群落组成影响对门水平细菌群落的分析表明(图22A)，Proteobacteria是所有处理中最具优势的门，占总细菌门的42.12%−48.97%。其次是Actinobacteria、Patescibacteria和Firmicutes，占细菌门总数的5.09%−30.07%。与CK相比，四个处理(DZ、Bv、DB和DBO)的Proteobacteria相对丰度分别降低了9.50%、0.90%、12.34%和14.00%，除Bv处理外，均达到显著水平(P<0.05)。Actinobacteria的相对丰度变化幅度为-13.72%、2.71%、39.38%、67.61%，除Bv处理外，均达到显著水平(P<0.05)。Patescibacteria相对丰度变化幅度为51.07%、-90.26%、-49.67%、-71.21%(P<0.05)。Firmicutes的相对丰度变化幅度为3.63%、-86.53%、-21.64%、-33.90%(P<0.05)，除DZ处理外，均达到显著水平(P<0.05)。对门水平真菌群落的分析表明(图22B)，Ascomycota、Mortierellomycota和Basidiomycota是优势门，相对丰度占真菌门总数的0.32%%−95.89%。相比于CK，Ascomycota相对丰度降低了0.60%、81.76%、52.30%、22.47%，除DZ处理外，均达到显著水平(P<0.05)。Mortierellomycota相对丰度变化幅度为-36.16%、12067.95%、403.63%、988.23%，除DZ与DBO处理外，均达到显著水平(P<0.05)。Basidiomycota相对丰度增加了89.97%、388.50%、3911.00%、252.08%，仅DB处理达到显著水平(P<0.05)。图22不同处理在门水平的土壤细菌(A)和真菌(B)组成2.8不同处理对属水平土壤微生物群落组成影响对属水平细菌群落的分析结果表明(图23A)，Massilia、Saccharimonadales、Enterobacter、Saccharimonadaceae、Bacillus在所有处理中相对丰度最高。与CK相比，Massilia相对丰度分别显著降低了50.22%、95.77%、21.51%、45.98%(P<0.05)。Saccharimonadales相对丰度显著降低了8.46%、87.70%、48.02%、73.77%(P<0.05)。DZ、DB、DBO处理Enterobacter相对丰度变化幅度为49.18%、-98.94%、-89.55%，均达到显著水平(P<0.05)，而在Bv处理中未检测到Enterobacter。Saccharimonadaceae相对丰度变化幅度为204.22%、-99.25%、-59.65%、-64.36%，均达到显著水平(P<0.05)。Bacillus相对丰度显著降低了7.92%、83.17%、22.81%、57.53%(P<0.05)。对属水平真菌群落的分析结果表明(图23B)，Alternaria、Fusarium、Mortierella、Gibberella在所有处理中丰度最高。与CK相比，DZ处理Alternaria相对丰度显著增加了126.67%(P<0.05)，而Bv、DB、DBO处理显著降低了98.05%、95.87%、64.96%(P<0.05)。Fusarium相对丰度显著降低了98.40%、95.00%、86.68%、86.68%(P<0.05)。Mortierella相对丰度变化幅度为-36.16%、12067.95%、403.63%、979.14%，仅Bv与DBO处理达到显著水平。DZ、Bv、DB、DBO处理Gibberella相对丰度增加了2977.58%、1737.73%、2084.37%、65018.74%，仅DBO处理达到显著水平(P<0.05)。图23不同处理在属水平的土壤细菌(A)和真菌(B)组成2.9根际土壤代谢物分析对福白菊根际土壤中代谢产物进行分析，共检测到3368种代谢产物，其中制霉菌素等9种农药相对丰度结果见表10。与CK相比，制霉菌素含量显著降低了53.93%、45.11%、40.20%、56.56%(P<0.05)。土臭素含量显著增加了347.18%、637.63%、529.39%、2618.76%(P<0.05)。除DZ外，Bv、DB、DBO链霉素含量显著增加了23.37%、729.65%、2336.43%(P<0.05)。除DB与DBO外，DZ、Bv处理苯并噻唑含量显著增加了41.56%、29.57%(P<0.05)。杆菌素含量显著降低了94.96%、98.70%、98.03%、97.05%(P<0.05)。泰乐菌素含量显著降低了90.24%、91.73%、89.21%、95.74%(P<0.05)。抗霉素A含量显著降低了99.21%、99.86%、98.85%、99.71%(P<0.05)。DZ、DB、DBO吡唑醚菌酯含量显著增加了43.86%、83.86%、98.08%(P<0.05)，而Bv处理显著降低了107.61%(P<0.05)。诺氟沙星含量降低了173.36%、96.43%、5656.53%、58.79%，仅DB处理达到显著水平(P<0.05)。表10不同处理土壤农残相对丰度含量处理DZBvDBDBOCK制霉菌素10171.02±1376.66c12116.61±536.67b13201.12±1262.20b9588.81±268.71c22075.23±1022.7