基于NGS的肿瘤全景变异检测探针设计专家共识2026版解读-Panel设计与探针验证质控

EXPERTCONSENSUSONPROBEDESIGNFORNGS-BASEDCOMPREHENSIVEGENOMICPROFILINGINONCOLOGY(2026EDITION)肿瘤全景变异检测探针设计专家共识（2026版）ProbeDesignforNGS-BasedGenomicProfiling从靶区筛选到探针验证与变更：把NGS探针池设计的全流程技术规范一次讲清专家共识解读｜分子病理与二代测序实验室专业培训用，具体检测方案以现行规范与产品说明为准全景变异检测CGP/NGS探针池设计PANEL&PROBE性能验证与质控VALIDATION&QC本课件不含单位名称与个人姓名；配图来自公开知识共享图库，仅用于教学示意，不含患者身份信息。CONTENTS目录以实验设计视角拆解探针池设计：界定检测范围与共识总览，落实基因分级、区域设计、双层架构与基因组合、性能验证，最后落到生信报告与变更质控。01检测范围与共识总览全景变异检测定位与6条纲领共识02目标基因的选择与分级本地化变异分级与基因三分类03目标区域的差异化设计基因变异与基因组指标的差异化覆盖04双层架构与基因组合功能层加质控层与推荐列表05探针设计与性能验证设计要素与测序数据质控06生信报告与探针变更检测能力评估与变更管理201CHAPTERONE检测范围与共识总览DETECTIONSCOPEANDCONSENSUSOVERVIEW全景变异检测的定位与技术空白四类基因变异与三项基因组指标6条纲领性技术共识与推荐级别从临床可用到临床可信301·检测范围与共识总览全景变异检测：单次覆盖数百基因4图片DNA双螺旋分子模型（公开知识共享图片）•二代测序（nextgenerationsequencing，NGS）已成为肿瘤基因检测的主流方法•全景变异检测（comprehensivegenomicprofiling，CGP）可在单次检测中评估数百个以上基因的多种变异•同时覆盖基因变异与复杂基因组标志物，提高检测全面性与准确度•探针设计是NGS检测的起始环节，其质量决定靶向捕获效率与均一性•目前CGP产品均属实验室自建方法（laboratorydevelopedtests，LDT），缺乏统一监管规范探针池是NGS全流程的初始反应体系，捕获效率与特异性直接决定结果准确度01·检测范围与共识总览共识覆盖的关键环节5目标基因与区域选择GENE®ION•临床预期用途、基因临床价值与证据等级是选择依据•变异类型与基因组指标决定区域设计•首次提出基因证据等级分类体系探针设计与性能评估PROBE&PERFORMANCE•鸟嘌呤与胞嘧啶（GC）含量、熔解温度、交叉杂交与探针长度是主要影响因素•用标准品与临床样本评估捕获效率与均一性•构建多层级性能验证体系探针变更与质控CHANGE&QC•供应商变更、浓度调整、序列修改三类情形•变更后重新评估并更新生信流程•形成探针池设计全流程技术规范共识针对CGP检测产品的关键环节达成6条纲领性技术共识，系统提出探针池设计全流程技术规范01·检测范围与共识总览检测覆盖的变异类型与基因组指标61SNVSINGLENUCLEOTIDEVARIANT单核苷酸变异：单个碱基替换，是最基础的点突变，需锁定热点与功能结构域2InDelINSERTION/DELETION插入与缺失：小片段增减，复杂位点可用野生型加突变型探针组合提升检出3CNVCOPYNUMBERVARIATION拷贝数变异：基因拷贝数目增减，推荐覆盖全编码区或满足算法最小外显子要求4SVSTRUCTUREVARIATION结构变异：含融合等重排，断点富集区多位于复杂非编码区5标志物TMB·MSI·HRD肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性与同源重组缺陷等复杂基因组标志物全景变异检测在一次反应中同时评估基因变异与基因组标志物，最大限度提高检测全面性与准确度01·检测范围与共识总览6条纲领性技术共识一览7共识意见核心内容推荐级别共识意见1建立本地化基因变异分级标准，首次提出基因证据等级分类体系2A类共识意见2目标区域整合检测功能模块与质量控制模块2A类共识意见3形成常见实体瘤基因检测推荐列表并指导基因组合1类共识意见4探针设计纳入人群多样性并按关键要素筛选2B／2A类共识意见5用标准品与临床样本评估探针池检测性能1类共识意见6探针变更后评估性能并匹配更新生信分析流程2B类本表6条为纲领性技术共识，覆盖靶区筛选、探针设计、性能验证与变更管理四个环节01·检测范围与共识总览探针设计为什么需要标准8起始核心环节探针设计是NGS检测的起点，此前缺乏统一行业标准、临床指南或专家共识影响捕获效率探针设计质量直接影响探针的靶向捕获效率与均一性决定灵敏度特异性捕获效率与均一性进一步决定检测产品的灵敏度与特异性自建方法缺监管涵盖全面基因组标志物的CGP产品均属实验室自建方法，缺乏统一监督管理规范全流程已有指导样本处理、文库构建、生信分析、报告解读已有共识，唯探针设计环节空白支撑合规审查为实验室自建方法的合规性审查提供科学依据建立系统的探针设计、验证及变更标准，是保障NGS检测精准性与临床有效性的关键基石01·检测范围与共识总览从临床可用到临床可信91主流技术现状二代测序凭高通量与发现未知变异能力，成为肿瘤基因检测主流与首选方法2起始环节关键探针设计是NGS起始环节，此前尚未建立技术标准或评估体系3达成纲领共识6条围绕靶区选择、基因组合、性能评估、探针变更达成6条纲领性技术共识4全流程规范体系通过设计标准化、多层级性能验证与动态变更管理填补技术标准空白5合规依据目标为实验室自建方法合规性审查提供依据，推动从临床可用向临床可信转变统一技术标准强化实验室间结果可比性，为精准诊疗提供可验证的技术支持体系02CHAPTERTWO目标基因的选择与分级TARGETGENESELECTIONANDCLASSIFICATION循证分级体系与本地化共识意见1：基因三分类Ⅰ／Ⅱ／Ⅲ类基因与Ⅲ类策略性纳入变异四大类与图11002·目标基因的选择与分级四类循证分级体系各有侧重111体细胞变异解读指南2017年国际联合制定的体细胞变异解读指南，是国内影响范围最广、采用最多的分级体系2ESCAT量表2020年发布的分子靶点临床可操作性量表，评估靶点的临床可操作性3OncoKB证据等级精准医疗肿瘤数据库的证据等级规则4监管突变分级监管依据临床证据可靠程度进行的基因突变等级分类不同体系对变异等级划分存在细微差别，总体可归为四个大类（表2）02·目标基因的选择与分级共识意见1：本地化分级与基因三分类12分级本地化Ⅰ类具有明确临床意义的基因Ⅱ类具有潜在临床意义的基因Ⅲ类临床意义未明的基因在2017版体细胞变异解读指南基础上本地化：Ⅰ类A级证据含国内批准疗法（图1）变异分四大类明确意义、潜在意义、意义未明、无害或可能无害（表2）首次提出基因分类参考变异等级把基因分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，形成共识分级标准Ⅲ类策略性纳入整合有探索价值的Ⅲ类基因，规避证据升级导致频繁更新支撑MRD监测分子残留病灶（MRD）检测可获更多可追踪体细胞突变，提升灵敏度特异度02·目标基因的选择与分级目标基因选择的依据与Ⅲ类纳入13临床预期用途遗传筛查、辅助诊断、药物疗效预测、预后评估、复发监测等指导价值基因临床价值结合肿瘤生物标志物的临床可操作性判断纳入与否证据等级以循证分级体系为依据，Ⅰ／Ⅱ类基因为核心整合Ⅲ类基因策略性纳入有探索价值的Ⅲ类基因，保持产品全生命周期竞争力规避频繁更新证据升级时只需补充验证相应变异位点即可追踪式更新满足全景分析覆盖基因组全景分析技术要求，为MRD提供更多可追踪突变共识意见1（推荐级别2A类）：建立本地化基因变异分级标准，首次提出基因证据等级分类体系02·目标基因的选择与分级变异分级本地化：Ⅰ类与Ⅱ类的调整14Ⅰ类变异CLASSⅠ•A级证据除境外监管批准疗法外，增加国内监管批准的疗法•专业指南纳入国内权威机构推荐的临床指南•具有明确临床意义，是检测产品的核心靶点Ⅱ类变异CLASSⅡ•C级证据同样增加国内监管批准疗法•具有潜在临床意义，作为重要补充•Ⅲ类基因临床意义未明，选择性纳入用于探索本地化在保留国际分级框架的同时，纳入国内获批疗法与指南（图1）02·目标基因的选择与分级共识意见115共识意见1·基因与变异分级推荐级别2A类建立本地化基因变异分级标准，首次提出基因证据等级分类体系。三分类•按临床意义把基因分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类•Ⅰ类含明确临床意义变异•Ⅱ类含潜在意义、Ⅲ类意义未明筛选框架•核心纳入Ⅰ、Ⅱ类基因•按预期用途整合有探索价值的Ⅲ类基因•满足基因组全景分析要求战略价值•规避证据升级导致频繁更新•为MRD提供更多可追踪突变•维持产品全生命周期竞争力02·目标基因的选择与分级基因分类的依据与推荐级别163类基因分类按临床意义把基因分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类4大类变异划分明确意义、潜在意义、意义未明、无害或可能无害Ⅲ类策略纳入整合有探索价值基因，支撑全景分析与MRD2A共识意见1本地化分级与基因证据等级分类的推荐级别本地化在2017版体细胞变异解读指南基础上，为Ⅰ类A级与Ⅱ类C级证据增加国内获批疗法03CHAPTERTHREE目标区域的差异化设计DIFFERENTIATEDTARGETREGIONDESIGN原癌与抑癌基因的不同覆盖策略SNV／InDel、CNV、融合的分型设计TMB、MSI、HRD的算法区域共识意见2的双模块整合1703·目标区域的差异化设计靶向捕获：探针覆盖决定检测性能18图片cDNA微阵列杂交点样图（公开知识共享图片）•目标区域选择依据基因变异类型、基因组指标与生信质控指标要求•原癌基因有明确热点与功能结构域，抑癌基因突变呈散发分布•探针覆盖的靶区直接决定灵敏度、特异度与均一性•差异化设计在覆盖广度与检测性能之间取得平衡•特定单核苷酸多态性（SNP）位点的策略性纳入可增强CNV分析准确度图示为微阵列杂交结果，用于示意靶向捕获的探针—靶标结合原理03·目标区域的差异化设计按变异类型的区域设计策略19SNV／InDelSTEP1•原癌基因锁定功能结构域与热点突变区•抑癌基因覆盖完整编码区序列CNVSTEP2•推荐覆盖全编码区•至少满足算法要求的最小外显子覆盖•结合算法需求添加参考SNP位点融合／SVSTEP3•核心靶区聚焦已知断点富集区•优先锁定高频融合伴侣保守断点•规避高重复与高同源区间指标区STEP4•按各标志物生信算法精准化设计•在满足性能下精细化调控覆盖•控制探针组合规模共识意见2（推荐级别2A类）：目标区域设计需系统整合检测功能模块与质量控制模块03·目标区域的差异化设计基因组指标的区域设计要点20TMB：编码区≥1Mb探针覆盖编码区在1Mb以上，常在临床价值基因基础上增加高频变异区域MSI：优选单核苷酸位点灵敏度与位点数量非线性相关，单核苷酸位点稳定性高、不依赖正常配对样本HRD：杂合频率0.4～0.6SNP空间分布均匀、杂合位点密度优先，排除偏离平衡、捕获不稳与高同源区域指标区按生物信息学算法精准化设计，既优化系统效能又控制探针规模03·目标区域的差异化设计MSI与HRD的位点选择逻辑21MSI位点动态优化•尚无标准化技术规范•按算法筛选最佳微卫星位点组合•增加位点可能降低信噪比单核苷酸位点灵敏度更优•效能评估中灵敏度更优•可不依赖正常配对样本•稳定性高，常作核心靶区HRD筛选准则两条•空间分布均匀，消除检测盲区•优先中国人群杂合频率0.4～0.6三级排除去干扰•排除偏离哈迪-温伯格平衡位点•排除捕获稳定性欠佳位点•排除高同源高重复区域位点MSI建议补充单核苷酸位点以区分低度MSI亚型，HRD位点筛选遵循空间均匀与杂合密度优先03·目标区域的差异化设计质控四维度：保障检测可靠221肿瘤纯度推算QC1通过SNP基因分型实现，位点与数目需满足算法对杂合率与群体频率阈值要求2样本配对分析QC2判断肿瘤与正常配对关系，同样依赖SNP基因分型3污染率评估QC3识别样本交叉污染，保障结果可信4性别判断QC4在X／Y染色体异源区设计性别特异性探针，双盲检测准确度达99%以上质控区域不参与变异分析，却是保障检测系统可靠性的基石，构成质量保障层04CHAPTERFOUR双层架构与基因组合DUAL-LAYERARCHITECTUREANDGENEPANELS功能检测层与质量保障层常见实体瘤基因检测推荐列表复发指数RI的量化筛选单癌、多癌与泛癌的组合场景2304·双层架构与基因组合探针池的架构与质控设计24功能检测层FUNCTIONLAYER•包含基因变异检测关键靶区•涵盖SNV、InDel、CNV、SV•及TMB、MSI、HRD等指标靶区质量保障层QCLAYER•集成四位一体质控模块•肿瘤纯度与样本配对•污染率评估与性别判断个性化设计BYINTENDEDUSE•每个模块按预期用途定制•检测功能与质控效能动态耦合•实现全流程可追溯可验证完整探针池系统构建功能检测层与质量保障层双层架构，为技术审评提供标准化框架04·双层架构与基因组合共识意见2：区域设计的模块整合25肿瘤CGP检测产品探针池的目标区域设计，需系统整合检测功能模块与质量控制模块，并按预期用途个性化设计。1检测功能模块包含基因变异（SNV、InDel、CNV、SV）检测和／或基因组指标（TMB、MSI、HRD）检测的关键靶区2质量控制模块包含肿瘤纯度推算、样本配对分析、污染率评估与性别判断所必需的基因组区域3个性化设计每个模块的目标区域根据CGP检测产品的预期用途进行个性化设计04·双层架构与基因组合基因组合的三种场景261按预期用途BYINTENDEDUSE遗传筛查、辅助诊断、药物疗效预测、预后评估、复发监测的单一或复合场景2按肿瘤系统BYSYSTEM按妇科、消化、中枢神经等来源系统设计多癌检测产品3按治疗关联BYTHERAPY以某个基因组指标关联治疗方式，如免疫治疗或特定靶向治疗相关标志物共识意见3（推荐级别1类）：按预期用途、肿瘤来源系统或治疗方式关联进行基因组合，实现研发与临床双重经济学效益04·双层架构与基因组合文库与片段：捕获前的质量控制27图片琼脂糖凝胶电泳分离的DNA条带（公开知识共享图片）•探针池目标区域设计需整合检测功能模块与质量控制模块•完整探针池构建功能检测层与质量保障层双层架构•基因组合方式决定探针池规模与数据量规格•常见实体瘤基因检测推荐列表指导探针池设计•复发指数（recurrenceindex，RI）综合突变患者数、区域长度与队列总数评估图示为凝胶电泳分离结果，用于示意文库片段与捕获产物的质控原理04·双层架构与基因组合推荐列表与RI筛选281推荐列表来源整合国际肿瘤变异与基因组公共数据库与中国人群自建配对测序数据库2RI计算公式RI＝（Np／N）×（1000／L），Np为突变患者数、L为区域长度、N为队列总数3筛选阈值推荐RI≥20且覆盖至少5例突变患者的高复发区域4临床价值优先选择对肿瘤突变贡献高的基因，控制探针池大小并提升MRD可追踪突变RI实现不同长度外显子间的均一化评估，兼顾人群突变频率与对TMB的贡献04·双层架构与基因组合从单癌到泛癌的产品设计29单癌产品STEP1•聚焦单一癌种基因组合•适用场景相对集中多癌产品STEP2•按肿瘤来源系统组合•覆盖同系统多个癌种泛癌产品STEP3•跨系统全景覆盖•匹配真实使用场景经济学效益STEP4•减少多单癌重复研发•实现设计与临床双效益多癌或泛癌产品更匹配临床真实使用场景，减少研发资源浪费，实现设计与临床双重经济学效益05CHAPTERFIVE探针设计与性能验证PROBEDESIGNANDPERFORMANCEVALIDATIONGC含量、熔解温度、交叉杂交与长度叠瓦式与野生型加突变型设计测序数据质控：捕获效率与均一性共识意见4与共识意见53005·探针设计与性能验证共识意见4：探针设计的关键要素31四大影响因素50%～60%GC含量最优区间60～120常规探针长度（nt）＞75%～80%50mer交叉杂交相似性阈值设计遵循目标区间中心对称滑窗，核心热点区采用叠瓦式探针GC含量鸟嘌呤与胞嘧啶（G、C）占比，过高过低均致杂交不佳熔解温度Tm与GC、长度、杂交条件相关，结合湿实验条件控制在合适范围交叉杂交低复杂度区同源序列引发非特异捕获，需剔除相似区过多的探针探针长度越长越稳定但合成难、成本高、受降解影响，兼顾样本类型与读取模式05·探针设计与性能验证探针设计的关键策略321叠瓦式探针在核心肿瘤热点区采用多重叠瓦设计，提高覆盖度与均一性，保障灵敏度2野生型加突变型复杂InDel位点两侧各设计1条野生型探针、内部1条突变型探针，提升模板转化率3滑窗寻优遵循目标区间中心对称原则滑窗，在可移动范围内寻找最佳探针组合4浓度与密度调整按探针池GC含量调整不同探针浓度或覆盖密度，提升目标区间捕获能力共识意见4（推荐级别2A类）：在保证灵敏度与特异度前提下，筛选出能富集目标区域的最优探针组合05·探针设计与性能验证探针池性能评估的三个层级33测序数据质控推荐用细胞系标准品或高质量临床样本做全流程检测，评估捕获效率、均一性、GC含量／偏好、基因组比对率单探针／单位点用深度系数评估单条探针或位点的检测能力，与检测限和阳性判断值相关产品维度验证基因变异与基因组指标的检测限LoD与准确度，参考性能确认要求共识意见5（推荐级别1类）：临床使用前需用标准品与临床样本评估探针池检测性能05·探针设计与性能验证测序数据质控的参考标准341捕获效率中靶率比对到目标区域碱基占总测序碱基比例；目标区＞10Mb捕获特异性不低于45%，≤10Mb不低于12%2覆盖均一性Fold-80确保80%目标碱基达平均深度所需额外测序倍数，理想值1，一般认为小于2较好3深度覆盖度0.2倍≥20%目标区域的平均有效深度占比不低于95%4GC含量偏好40%～60%标准物质GC占比参考区间；25%～75%GC区间均超0.5倍平均深度即无严重偏好5基因组比对率≥95%比对到参考基因组的读段数占全部测序读段数比例，一般要求达95%以上探针池测序数据质控尚无严格统一标准，通常要求不低于共识表3提供的参考质控标准05·探针设计与性能验证深度系数：单个位点的合格线35参数取值含义样本平均测序深度500×检测产品要求的平均测序深度突变阳性判断值4条读段判定阳性所需的最少测序读段数检测限LoD2%最低可检出的等位基因比例理论位点深度386×检出概率≥95%时按二项分布要求的最小深度位点深度系数0.77理论深度与样本平均深度之比＝386×／500×深度系数＝单位点测序深度与样本平均深度之比，需不低于按LoD与阳性判断值算出的理论最低值05·探针设计与性能验证生信视角看覆盖均一性36图片基因组浏览器中的比对与覆盖轨迹（公开知识共享截图）•覆盖均一性指测序读段在目标区域深度分布的均匀程度•Fold-80与0.2倍平均深度碱基覆盖度是常用评估指标•均一性高可减少达到预期深度所需数据量，降低成本与周期•GC偏好表现为低／高GC区域深度偏离整体均值•除质控指标外，Q30、测序深度、去重复比对率反映检测性能图示为基因组浏览器界面，用于示意目标区域的覆盖与深度分布分析05·探针设计与性能验证GC含量与GC偏好：两个不同概念37GC含量GCCONTENT•测序序列中G与C碱基所占比例•目标区间、合成质量、温度校准影响结果•标准物质参考区间为40%～60%GC偏好GCBIAS•多环节累积导致GC影响覆盖深度•按GC细分为多个bin计算平均深度•25%～75%区间均超0.5倍均值即无严重偏好GC含量异常会影响捕获效率与数据均一性，二者需在质控中分别评估06CHAPTERSIX生信报告与探针变更BIOINFORMATICS,REPORTINGANDPROBECHANGE产品维度的检测限与准确度评估探针变更的三种情形变更后的性能评估与流程更新共识适用范围与总结3806·生信报告与探针变更产品维度准确度评估四步39定义LoDSTEP1•基因变异LoD：95%样本正确检出变异的最低等位基因比例•基因组指标LoD：正确检出阳性所需最低肿瘤纯度方法学比较STEP2•用经验证对标方法检测临床样本•计算阳性符合率、阴性符合率、阳性预测值符合率要求STEP3•LoD以上变异三项指标达95%以上•不同变异类型与指标分别评估样本量估算STEP4•95%置信度与95%可靠性•用容忍区间评估最少样本数对标方法优先选临床金标准并使用获批试剂盒，无获批方法者用经性能确认的自建方法06·生信报告与探针变更性能评估的关键阈值一览4095%检出概率深度系数计算所保证的突变检出概率≥95%符合率阳性符合率、阴性符合率、阳性预测值的要求20例供应商变更样本更换合成供应商时评估纳入的临床样本数100%标志物一致率供应商变更后基因组标志物检测的一致率要求评估须覆盖全部变异类型与基因组指标，确保探针性能符合CGP检测产品的检测要求检测限LoD指95%样本能正确检出变异位点的最低等位基因百分比，基因组指标LoD指正确检出阳性所需的最低肿瘤纯度样本量在95%置信度（α＝0.05）与95%可靠性（r＝0.95）基础上，用容忍区间评估性能确认的最少样本数06·生信报告与探针变更共识意见5：临床前的性能评估41探针池在临床使用前需使用标准品及临床样本评估检测性能，确保探针性能符合CGP检测产品的检测要求。1测序数据质控包括捕获效率、均一性、GC含量等指标的全流程表现2单位点表现单条探针或单个位点的深度系数表现3产品维度对检测限LoD与准确度进行评估06·生信报告与探针变更探针变更的三种情形42变更合成供应商STEP1•因成本优化或供应链风险切换•优先选探针类型与质控标准可比者•维持探针序列一致