TBJAS011-2026 玉米遗传转化 纳米磁珠介导转染法编制说明

玉米遗传转化纳米磁珠介导转染法编制说明的内容工作简况，包括任务来源，起草单位，协作单位，主要起草人。任务来源：北京市科技计划项目、北京市乡村振兴项目和北京市农林科学院创新能力建设专项支持。本标准起草单位：北京市农林科学院生物技术研究所，三亚大北农创种基因科技有限公司，山东登海道吉种业有限公司，北京联泰德生物技术有限公司，金苑(北京)农业技术研究院有限公司，北京农学会。本标准主要起草人：张中保，吴忠义，郑登俞，赵宏，王作平、艾蓉、张天豹，冯金辉徐玉波孙福贵周伟，【、】，【空格】和【，】是否需要统一成【，】王运杰，张市城，申君鑫，叶凯，侯丽宏。【、】，【空格】和【，】是否需要统一成【，】制定标准的必要性和意义。玉米是在全球范围内广泛种植的作物，以满足人们日益增长的粮食、饲料和燃料需求。尽管在过去两百年中，人们通过传统育种显著提高了玉米产量和品质，但仍然面临来自各种生物和非生物胁迫的严峻挑战。为了应对这些挑战，人们开发了转基因玉米，以引入所需的性状，如抗虫、抗除草剂、耐旱、耐寒和提高营养品质等。高效的遗传转化是转基因玉米开发的关键。自1988年第一个基于原生质体电穿孔的玉米转化成功以来，科学家们已经开发了多种获得转基因玉米植株的方法，如基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法、脂质体介导法、碳化硅介导法、显微注射法等。但是这些方法主要依赖于组织培养体系，成本高、劳动强度大、耗时长，特别是依赖于基因型。只有少数玉米品种具有相对较高的基因转化效率，如HiII、B104和A188。大多数优良玉米自交系都存在技术障碍，从而限制了它们的商业应用，特别是在开发先进的育种技术方面，如直接在优良作物种质中进行精确的基因组编辑。因此，在所有玉米品种中建立一个能够直接、精确地进行分子改良的高效基因传递系统是非常重要的，对支撑我国转基因玉米研发、创新与产业化推进具有重要意义。主要工作过程。近几十年来，由于基因型的限制和玉米遗传转化的低效率，使得玉米的遗传转化速度远远慢于拟南芥和水稻。最近，一种利用Fe3O4磁性纳米颗粒（Magneticnanoparticles，MNPs）介导花粉转染基因的方法被开发出来，其主要优点是不依赖于繁琐复杂的组织培养过程，高效地产生了含有带GUS标记基因的转基因棉花、南瓜和辣椒以及转基因抗草铵膦-抗虫基因棉花。基于棉花花粉磁转染的成功案例，探索一种不依赖于基因型、操作简便、稳定高效、可批量进行的玉米花粉磁转染方法，形成可复制的标准化技术体系，通过应用示范，为加速玉米分子育种提供更多选择。纳米磁珠介导转染法是以Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MNPs）为载体，利用花粉作为外源基因递送媒介，在磁场辅助下实现玉米遗传转化的新方法，全程无需组织培养。其原理分为四个步骤：载体构建：带正电的聚乙烯亚胺修饰的MNPs与带负电的质粒DNA通过静电结合组装成MNP‑DNA复合物，保护DNA免受核酸酶降解。磁导转入花粉：利用磁场驱动复合物穿过花粉萌发孔进入花粉内部。玉米体系需经缓冲液预处理打开萌发孔，并辅以8℃低温维持花粉活力。授粉与转化：磁转花粉通过人工授粉参与双受精，外源DNA随精子进入胚或胚乳，形成转基因种子。筛选与遗传：T₁代经报告基因、PCR筛选阳性植株，外源基因可稳定遗传至后代。该技术突破了传统转化的基因型限制，可直接应用于优良自交系，但转化效率受花粉活力、萌发孔开放程度及环境条件影响，且存在嵌合体可能。玉米体系因萌发孔封闭且需低温处理，技术难度高于花粉萌发孔天然开放的棉花体系。我们进行了如下工作：1.摸清玉米花粉的特性，对转染体系进行特异性优化。2.采用GUS、EGFP、RFP等报告基因对多个玉米自交系花粉进行转化，同时对目标基因的导入和表达效率进行示踪和鉴定。3.采用草铵膦筛选标记基因bar对多个玉米自交系花粉进行转化，通过对转化后代进行草铵膦筛选及分子鉴定，研究其稳定整合效率。4.进行试验数据讨论和方法归纳总结。5.进行规程编制和论证。制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系。GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法。目前，国内尚未形成标准化的，适用于玉米的纳米磁珠介导转染方法。目前较多应用的玉米遗传转化方法是依赖组织培养的农杆菌转化法，本方法是对现有玉米遗传转化方法的有效补充，能够较好的解决组织培养体系成本高、劳动强度大、耗时长，特别是依赖于基因型的问题，是适用于田间的大规模、快速、高效、不依赖于基因型、操作简便的玉米遗传转化方法。主要条款的说明，主要技术指标、参数、实验验证的论述。修订标准时，应增加新、旧标准水平的对比；1.纳米磁珠转化材料准备。在北京市农林科学院（E116°29′、N39°95′）、北京房山琉璃河南洛村（E116°05′、N39°59′）和海南三亚崖州郎佬村（E109°17′、N18°40′），将玉米自交系178、B73、HZ178、京2416、京92和郑58，根据转化需求（可授粉穗数≈70-80%播种穴数），间隔一周分三期播种，期间做好基础水肥草病虫管理。进入开花期后，及时对雌雄穗进行套袋。取粉前一天，选择盛花期的雄花敲掉残粉再重新套袋，防止串粉。授粉前1-2天，选择吐丝8-10cm的雌穗，修剪花丝至穗轴顶端5cm，便于授粉。MagnetoFACTOR-96板和聚乙烯亚胺修饰的Fe₃O₄纳米磁珠PolyMAG-1000，原产于德国Chemicell公司。磁珠和磁板4-8℃存放。100目尼龙样品筛，直径15cm左右，用于筛除花药等杂质。300目尼龙布，用于过滤溶液，最大限度的截留花粉（尼龙布孔径小于花粉直径）。准备3-5个冰袋，分别在4-8℃和-20℃预冷。采用试剂盒小量提取高纯度的质粒DNA（1.8<OD₂₆₀/₂₈₀<2.0），务必用ddH₂O洗脱，并调整浓度至200ng/μL，-20℃冻存和携带，使用前取出，4-8℃解冻。10×微量元素及GA3母液0.5L：10×微量元素及GA3母液0.5L：称取硼酸（H3BO3）0.309g、氯化钾（KCl）0.373g、一水硫酸锰（MnSO4·H2O）0.845g、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.232g、赤霉素（GA3）0.173g，加灭菌蒸馏水溶解并定容至0.5L，45mL/管分装，-20℃冻存。转化液1L：转化液1L：加入蔗糖（C₁₂H₂₂O₁₁）171.15g、无水氯化钙（CaCl2）0.111g替代，加500mL灭菌蒸馏水溶解，再加入10×微量元素及GA3母液100mL，并用灭菌蒸馏水定容至1L，45mL/管分装，-20℃冻存。使用前30分钟取出，4-8℃解冻。2.纳米磁珠介导转染法转化玉米的操作流程。玉米花粉转化的全部过程均需要轻柔操作！如图1所示。(1)将磁珠和DNA结合。取200μLPCR管，管盖上写好转化编号，加入200ng/μL的DNA160μL（共32μg）和1μg/μL的纳米磁珠8μL（共8μg），轻柔吸打混匀，室温静置，结合30分钟。(2)在上午9-10点，收集玉米自交系盛花期的新鲜花粉，取粉纸袋装入塑料自封袋内，冰盒带回（冰盒最下层用-20℃冰袋打底，其上放两层4-8℃预冷冰袋，花粉用纸袋收集并用自封袋装好，夹在4-8℃预冷冰袋之间）。过100目筛（筛除花药）。(3)称取过筛花粉约2g（约8×10⁶粒花粉，每粒玉米花粉平均重量247×10⁻⁹克）转移至15mL圆底离心管（管壁标好转化编号），再加入8mL4-8℃预冷的转化液，盖好轻柔颠倒混匀，4-8℃静置开孔10分钟。(4)加入结合好的磁珠-DNA混合物（168μL）到4-8℃开孔的花粉离心管中，盖好轻柔颠倒混匀，管身平放于磁板上4-8℃磁转20分钟，隔10分钟轻柔颠倒混匀一次，均匀接受磁力。(5)最下方铺直径18cm的圆滤纸，上面铺10-15张吸水纸上，最上面铺25cm*25cm的300目尼龙布，将磁转染花粉悬液轻柔混匀，倒在尼龙布的半边，再将另半张尼龙布盖住花粉，对折吸水纸，轻轻按压，吸干水分，吸湿一层移走一层，直至吸干水分。将尼龙布在直径18cm的圆滤纸上展开，在花粉上均匀撒上3g玉米淀粉，用干净牙刷将花粉和玉米淀粉刷匀，并分散成细末。(6)将磁转化花粉颗粒转入胶封纸袋中，尽快对正在开花的10个雌穗（提前套袋，授粉前1-2天修剪花丝至穗轴顶端5cm）进行授粉。图1.纳米磁珠介导转染法转化玉米的操作流程为了提高稳定整合转基因株系的筛选效率，将编码草铵膦乙酰基转移酶的除草剂筛选标记基因bar（质粒p1132-bar）转入玉米自交系郑58中。转染的种子在田间成排种植并发芽。在三叶期，用200mg/L草铵膦（浙江永农生物科技有限公司，中国）溶液喷湿幼苗。一周后，计数存活植株和总发芽苗数，计算抗性率。然后，取存活幼苗约4cm²大小的叶片进行基于抗体的快速试纸条检测（货号AS-013-LS，ENVIROLOGIX公司，USA），根据操作规程，同时具有检出条带（下方）和测试条带（上方）的幼苗即为转基因阳性。在拔节期，收集T1或T2代阳性玉米植株的叶片5g，用常规CTAB法提取基因组DNA，进行Southern杂交分析。分别用HindIII和PstI（货号JH101和JP101，全式金生物技术有限公司，北京，中国）过夜彻底消化约100μg玉米基因组DNA。然后，将消化后的DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，并转移到带正电的尼龙膜上（货号1141724001，罗氏，美国）。以bar基因PCR产物（引物对bar-F/R，表1）为模板DNA制备探针。按照地高辛（DIG）引物DNA标记和检测试剂盒I（货号11745832910，罗氏，美国）的操作规程，制备DIG标记探针并进行DNA杂交检测。并将检测结果与除草剂抗性结合分析。表1.本研究所用引物引物序列(5'→3')退火温度产物大小检测项目EGFP-FTCATCGGCAGTTGTACAGCT59.6℃545bpEGFP基因的PCR和RT-PCREGFP-RTCGTGACCACCCTGACCTACGGUS-FGTGTGAACAACGAACTGAACTG59.3℃595bpGUS基因的PCR和RT-PCRGUS-RTAATGCGAGGTACGGTAGGAGGZmActin1-FAAATGACGCAGATTATGTTTGA59.2℃258bpRT-PCR内参ZmActin1-RGCTCGATGGAGGGAGTACCbar-FTCTGCACCATCGTCAAACCACTACATC61.5℃431bpbar基因Southern杂交探针合成PCRbar-RCCAGAAACCCACGTCTAGTGCAGTTTC3.玉米花粉萌发-花粉活力测试。将约5mg新鲜玉米花粉（相当于2×10⁴粒花粉）和在转化液中于4℃、8℃、12℃、16℃和室温（RT，22-28℃）下预处理30分钟的20μL花粉悬浮液，加入到玻璃底细胞培养皿（直径15mm）中的180μL（新鲜花粉加200μL）花粉萌发培养基（15%PEG4000、150g/L蔗糖、300mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O、100mg/LH₃BO₃、200mg/LMgSO₄·7H₂O、100mg/LKNO₃和0.1mMGA₃）（韩雅莉，2014）内，轻柔搅匀。在25℃静置暗培养3小时，在立位光学显微镜下检查玉米花粉的萌发率（BA210，Motic，中国；用蔡司AxioCamICc5照相）。萌发率=萌发花粉数/总花粉数。我们在不同温度下用转化液预处理玉米自交系京92花粉30min（模拟转化过程，转化液预处理30min后的玉米花粉转至萌发培养基中，25℃静置暗培养3h，光学显微镜下观察花粉萌发情况），以新鲜未经处理的京92花粉为对照（萌发率64%，719/1121）。如图2所示，在转化液中预处理30min的花粉，其萌发率随着温度的升高而降低。在4℃，8℃，12℃，16℃和室温（RT，22-28℃）下的相对萌发率分别为48%（153/318），54%（579/1077），21%（130/623），25%（136/552）和12%（113/935）。在8℃预处理30分钟的花粉保持了未在缓冲液中预处理的花粉84%的活力。图2.不同温度下转化液预处理30分钟后的京92花粉活力（A）未经预处理的新鲜京92花粉萌发情况；（B）4℃下转染的玉米花粉萌发情况；（C）8℃下转染的玉米花粉萌发情况；（D）12℃下转染的玉米花粉萌发情况；（E）16℃下转染的玉米花粉萌发情况；（F）室温（RT，22-28℃）下转染的玉米花粉萌发情况；（G）不同温度下转染京92花粉的活力统计，小写字母表示不同等级之间的统计显著差异（P<0.05）类似地，将京92、HZ178、郑58、178四种玉米自交系的花粉在8℃和室温（RT，22-28℃）下用转化液预处理30min，以新鲜未经处理的对应自交系花粉为对照（-），结果如表2所示：8℃下用转化液预处理30min的花粉萌发率显著高于室温（RT）预处理的花粉，可维持新鲜自交系花粉53-84%的活力。表2.预处理温度对玉米花粉萌发的影响玉米自交系转化液预处理开孔温度总花粉数（个）萌发花粉数（个）萌发率(%)京92--112171964.14±9.97a+8℃107757953.76±4.96b+RT93511312.09±3.15cHZ178--65748273.36±8.62a+8℃70128039.94±2.81b+RT7609512.50±2.38c郑58--53335065.67±11.78a+8℃69338154.98±5.37a+RT601467.65±2.50b178--78547360.25±3.89a+8℃54817431.75±1.17b-：未经预处理的新鲜玉米花粉；+：在转染缓冲液中预处理30分钟的玉米花粉；RT：室温，22-28℃；开孔率上标的小写字母表示不同等级之间的统计显著差异（P<0.05）。将玉米自交系HZ178和京92的花粉在8℃和室温（RT，22-28℃）下进行转染，转染结束后，将转染花粉干燥，对HZ178和京92的套袋雌穗进行授粉。授粉后30天后，待玉米种子成熟，对穗轴进行脱壳，拍照，对结实粒数进行统计。结果如图3所示：HZ178和京92授8℃转染花粉的玉米雌穗结实率为40-68粒/穗，均好于授室温转染花粉的玉米雌穗（9-10粒/穗）。说明低温磁转染更有利于维持花粉活力，提高结实率，获得更多可供筛选鉴定的玉米种子。故本研究随后的花粉转化试验均在8℃低温条件下进行。图3.在8℃和室温条件下，磁转染花粉授粉后玉米结实情况（A、B）在8℃或室温（RT）下转染的HZ178和京92玉米穗轴。左侧玉米穗轴为用在8℃下转染的花粉授粉结实，右侧玉米穗轴为用在室温（RT）下转染的花粉授粉结实。（C）两种温度下转染的HZ178和京92玉米结实率。4.玉米花粉的扫描电镜观察。为了观察玉米花粉的孔径结构，从田间生长的玉米雄穗上收集新鲜的花粉，以及在8℃或室温（RT，22-28℃）下用转化液预处理10分钟以诱导开孔的玉米花粉，铺在硅片表面，立即用干净的吸水纸吸干多余的液体。喷金后，用扫描电子显微镜SEM（S3400N，日立株式会社，日本）在5.0kV下观察花粉的开孔情况。玉米花粉通常只有一个带盖的花粉孔（图4A，谷物花粉中常见，），这阻碍了外界物质的进入，我们研究了花粉孔在8℃时是否发生了改变。在8℃下用转化液预处理10分钟，可诱导玉米花粉孔的打开（图4B，花粉孔直径约为5μm）。然后，在室温（RT）或8℃条件下，用转化液处理玉米自交系京92、HZ178、郑58和178的花粉10分钟，并观察处理后花粉的开孔情况。在8℃和室温下，开孔预处理10min后，花粉开孔率分别保持在40-55%和53-62%，无统计学差异（表3）。说明低温对玉米花粉开孔的影响不大，为在低温条件下对玉米花粉进行磁转染提供了可能。图4.转化液开孔预处理前后的玉米花粉孔状态（A）转化液开孔预处理前的玉米花粉孔状态，箭头所指为带盖的花粉孔；（B）转化液开孔预处理后的玉米花粉孔状态，箭头所指为打开的花粉孔。表3.预处理温度对玉米花粉萌发的影响玉米自交系预处理温度可见花粉孔数开孔数百分率%京92RT127669554.47±11.438℃9512383840.35±10.88HZ178RT7706474861.61±13.388℃10540577454.78±14.67郑58RT4726249652.81±13.398℃6542322449.28±14.531788℃8891407745.86±13.78RT:22-28℃，室温；8℃与RT下开孔率无统计学差异。5.转红色荧光蛋白基因玉米花粉的荧光观察。使用由玉米泛素（Ubi）启动子驱动的红色荧光蛋白基因（RFP）作为报告基因，研究外源基因在玉米花粉中的瞬时表达。在用转化液预处理10分钟并在磁场中转染20分钟后，将仅转染MNP、单独转染RFP质粒DNA、同时转染MNP和RFP质粒DNA的玉米花粉，转移到表达培养基（20%PEG4000、150g/L蔗糖、300mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O、100mg/LH₃BO₃、200mg/LMgSO₄·7H₂O、100mg/LKNO₃）（韩雅莉，2014），25℃静置暗培养20小时以表达RFP。以在8℃条件下，将MNP和RFP质粒DNA直接转染玉米花粉30分钟，不经转化液预处理的花粉作为对照。在共焦激光扫描显微镜（A1+，尼康，日本）下，用584nm波长的光激发，观察花粉粒的RFP信号。类似的，在共聚焦激光扫描显微镜（A1+，尼康，日本）下，使用488nm波长的光激发，观察了授粉后1天的花丝和授粉后2天的未成熟籽粒、EGFP转染的T1幼苗（三叶期）的根和叶中的EGFP信号。在仅转染纳米磁珠（MNP）（图5A）或仅转染RFP质粒（图5B）的花粉粒中均未检测到红色荧光。在22%（129/590）同时转染MNP和RFP质粒的花粉中可检测强烈的红色荧光信号（图5C）。而在8℃的磁场中直接转染MNP和RFP质粒30分钟，未用转化液预处理10分钟开孔的玉米花粉中（图5D），仅3%（6/208）可检测到红色荧光（表4）。以上结果表明，与直接转染相比，用转化液预处理10分钟诱导开孔的花粉，更有利于外源基因的导入和瞬时表达。图5.玉米花粉开孔对RFP表达的影响（A-C）转化液预处理10min，在8℃下磁转染20min后，将玉米花粉转入表达培养基中，在25℃下孵育20h以表达红色荧光蛋白；（A）仅转染纳米磁珠（MNP）的花粉；（B）仅转染RFP质粒DNA的花粉（RFP）；（C）同时转染MNP和RFP质粒的花粉（MNP+RFP）。（D）直接转染MNP和RFP质粒30min，未用转化液预处理10分钟开孔的花粉（MNP+RFP(U)）。表4.未开孔和开孔玉米花粉中RFP荧光检出情况开孔时间转染时间总花粉数可检出RFP荧光的花粉数检出率%0分钟30分钟20862.88±2.6310分钟20分钟50912921.86±5.39**：统计显著差异（P<0.05）。6.磁转染花粉中的EGFP报告基因传递到玉米植株中的表达。用花粉磁转染将携带35Spro:EGFP表达盒的MNP-DNA导入玉米自交系京92中，然后将MNP-DNA转染的花粉授在京92的雌穗的花丝上。在既定时间取样，在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。在授粉后1天的花丝（图6A）和授粉后2天（图6B）的早期籽粒中均能检测到绿色荧光，表明磁转染的EGFP能在花丝中生长的花粉管和受精后的幼胚中表达。待转化种子成熟后，发芽获得T1代幼苗，幼苗生长至三叶期，取幼叶和幼根在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。在16%（13/79）的T1代幼苗叶片（图6C）和幼根（图6D）中能同时检测到绿色荧光，说明通过磁转染的EGFP能传递至T1代幼苗中，并表达出有功能的产物。图6.京92磁转染EGFP报告基因的荧光示踪（A）授粉后1天的花丝。（B）授粉后2天的早期籽粒。（C）T1代三叶期幼叶。（D）T1代三叶期幼根。EGFP:转染EGFP基因的玉米组织或幼苗。CK:未转染的对照组或幼苗。GFP:绿色荧光场。Bright:明场。Merge:绿色荧光场和明场叠加。对京92磁转染EGFP的T1代三叶期幼苗的EGFP基因、转录本和蛋白质进行了分析。通过PCR在46%（36/79）的T1幼苗中检测到编码EGFP的基因（图7A）。逆转录PCR（RT-PCR）和Westernblot用于验证该基因是否被转录和翻译。RT-PCR结果显示，EGFP基因在32%（25/79）幼苗中正常转录（图7B，ZmActin1为内参基因），而在16%（13/79）幼苗中检测到EGFP蛋白（图7C，ZmActin1为内参蛋白）。因此，在京92磁转染EGFP的T1代三叶期幼苗中，不仅检测到EGFP基因，而且检测到了转录本和目标蛋白。图7.京92磁转染EGFP的T1代幼苗分子检测（A）PCR。（B）RT-PCR。（C）Westernblot。EGFP:转染EGFP基因的玉米或幼苗。顶部的数字表示不同的T1代幼苗。CK:对照。B:空白。RE:重组EGFP蛋白。M:DL2000DNAmarker。P:质粒。类似地，为了测试不同玉米自交系的花粉磁转染效率，将EGFP报告基因导入另外4个玉米自交系178、B73、HZ178、和郑58中。在三叶期，对自交系T1幼苗进行了目标产物的检测。汇总结果如表5所示，按PCR阳性率计算的EGFP基因传递效率相当高，介于29%到68%之间。通过EGFP报告基因的RNA检出率计算的转染效率为18-32%，这可能是由于宿主核酸酶降解外源DNA和不完全引入表达盒所致。基于免疫染色的EGFP蛋白检出率算得的转染效率达到8-16%。这些结果表明，通过花粉磁转染，EGFP报告基因可以有效地传递到不同的玉米自交系中，并成功表达了EGFP蛋白。表5.EGFP报告基因在不同玉米自交系中的转染与表达玉米自交系检测株数T1幼苗中EGFP报告基因的检出率基因RNA蛋白1783017/30(57%)8/30(27%)2/30(7%)B734128/41(68%)12/41(29%)5/41(12%)HZ1788951/89(57%)16/89(18%)7/89(8%)京927936/79(46%)25/79(32%)13/79(16%)郑584212/42(29%)9/42(21%)4/42(10%)平均值51.2%24.9%11.0%7.磁转染花粉中的GUS报告基因可传递到玉米植株中表达。为了验证纳米磁珠介导转染法导入的E35Spro:GUS表达盒，在玉米乳熟胚中能否正常表达，我们在8℃下开孔并磁转染后，将携带E35Spro:GUS表达盒的质粒pBI121转染的玉米花粉授粉到10个套袋穗上进行结实。在授粉后18天，选择了3个结实良好的玉米棒子，将其苞叶撕开以靠近种子。然后将种子的外部切碎，将内部挖出，分离玉米胚并用吸水纸仔细清理。从每个棒子上分离出约10个胚胎。收集3个棒子的胚（约30个胚胎）直接放入3mLGUS强染色液（目录号S102，奥博莱科技有限公司，北京，中国）中，于室温（22-28℃）下染色36-48h。试验设四个独立重复，四个重复的数据合并计算。结果如图6A-E所示。仅用MNP转染的乳熟胚中未检测到GUS活性（图68）。8%（10/131）的仅用GUS质粒转染的乳熟胚被染成蓝色（图8B）。用MNP和GUS质粒转染开孔预处理的花粉所得的乳熟胚中，GUS阳性率达到55%（78/143）（图8C）。相反，当花粉未经开孔处理并在磁场中直接转染MNP和GUS质粒30分钟时，仅在27%（30/112）乳熟胚中检测到GUS染色（图8D）。统计结果如图8E所示。结果表明，花粉开孔处理可显著提高MNP介导的GUS报告基因在玉米中的转染效率。图8.玉米花粉开孔对GUS在乳熟胚中表达的影响说明：（A-C）转化液预处理10min，在8℃下磁转染20min后，将转染玉米花粉对套袋雌穗进行授粉，授粉后18天取乳熟胚进行GUS染色。（A）仅转染纳米磁珠（MNP）的乳熟胚；（B）仅转染GUS质粒的乳熟胚（RFP）；（C）同时转染MNP和GUS质粒的乳熟胚（MNP+GUS）。（D）直接转染MNP和GUS质粒30min，未用转化液预处理10分钟开孔的乳熟胚（MNP+GUS(U)）。（E）未开孔和开孔玉米乳熟胚中GUS染色情况统计，不同的小写字母表示不同级别的统计显著差异（P<0.05）。花粉磁转染将携带35Spro:GUS表达盒的MNP-DNA导入玉米自交系京92中，然后将MNP-DNA转染的花粉授在京92的雌穗的花丝上。在既定时间取样，进行GUS染色。在授粉后1天的花丝（图9A）、授粉后2天的早期籽粒（图9B）和授粉后20天的乳熟胚（图9C）中均能检测到GUS蓝色，表明磁转染的GUS能在花丝中生长的花粉管和受精后的幼胚中表达。待转化种子成熟后，发芽获得T1代幼苗，幼苗生长至三叶期，取幼叶进行GUS染色。在16%（13/79）的T1代幼苗叶片（图9D）中能检测到GUS蓝色，说明通过磁转染的GUS能传递至T1代幼苗中，并表达出有功能的产物。图9.京92磁转染GUS报告基因的染色示踪（A）授粉后1天的花丝。（B）授粉后2天的早期籽粒。（C）授粉后20天的乳熟胚。（D）T1代三叶期幼叶。GUS：转染GUS报告基因的玉米组织或幼苗。CK：未转染的对照组织或幼苗。对京92磁转染GUS的T1代三叶期幼苗的GUS基因、转录本和蛋白质进行了分析。通过PCR在32%（26/81）的T1幼苗中检测到编码GUS的基因（图10A）。逆转录PCR（RT-PCR）和Westernblot用于验证该基因是否被转录和翻译。RT-PCR结果显示，GUS基因在19%（15/81）幼苗中正常转录（图10B，ZmActin1为内参基因），而在5%（4/81）幼苗中检测到GUS蛋白（图10C，ZmActin1为内参蛋白）。因此，在京92磁转染GUS的T1代三叶期幼苗中，不仅检测到GUS基因，而且检测到了转录本和目标蛋白。图10.京92磁转染GUS的T1代幼苗分子检测（A）PCR。（B）RT-PCR。（C）Westernblot。顶部的数字表示不同的T1代幼苗。CK：对照。B：空白。M：DL2000DNAmarker。P：质粒。类似地，为了测试不同玉米自交系的花粉磁转染效率，将GUS报告基因导入另外3个玉米自交系HZ178、京2416、和郑58中。在三叶期，对自交系T1幼苗进行了目标产物的检测。汇总结果如表6所示，按PCR阳性率计算的GUS基因传递效率较高，介于32%到74%之间。通过GUS报告基因的RNA检出率计算的转染效率为19-29%，这可能是由于宿主核酸酶降解外源DNA和不完全引入表达盒所致。基于免疫染色的GUS蛋白检出率算得的转染效率达到5-11%。这些结果表明，通过花粉磁转染，GUS报告基因可以有效地传递到不同的玉米自交系中，并成功表达了GUS蛋白。表6.GUS报告基因在不同玉米自交系中的转染与表达玉米自交系检测株数T1幼苗中GUS报告基因的检出率基因RNA蛋白HZ1783616/36(44%)10/36(28%)4/36(11%)京241611786/117(74%)34/117(29%)8/117(7%)京928126/81(32%)15/81(19%)4/81(5%)郑583114/31(45%)8/31(26%)3/31(10%)平均值53.6%25.3%7.2%8.除草剂选择标记基因bar的转染、选择和遗传。为了筛选稳定整合的基因是否具有功能，将除草剂抗性基因bar转入玉米自交系郑58。在T1代幼苗三叶期喷施200mg/L草铵膦，获得抗除草剂植株。用除草剂处理植株一周后，1.41%（5/355）的T1代幼苗存