血型鉴定正反定型操作规范

血型鉴定正反定型操作规范1适用范围本规范规定了临床实验室及采供血机构ABO血型正反定型、RhD血型鉴定的操作要求、质量控制及结果处理原则，适用于各级医疗卫生机构、采供血机构开展常规血型鉴定，疑难血型鉴定参照本规范结合辅助技术进行。ABO血型鉴定必须实施正反定型联合检测，仅特殊情况可仅做正定型。2术语与定义2.1ABO正定型：采用已知血型特异性的标准血清，检测待检红细胞表面是否存在对应A、B血型抗原的试验方法。2.2ABO反定型：采用已知血型的标准红细胞，检测待检血清（浆）中是否存在对应抗A、抗B血型抗体的试验方法。2.3正反定型符合：正定型检测的红细胞抗原结果与反定型检测的血清抗体结果一致，符合ABO血型的抗原抗体分布规律。2.4RhD定型：采用特异性抗D血清检测待检红细胞表面RhD抗原的试验方法，常规血型鉴定需同时检测RhD血型。3试剂、耗材与仪器要求3.1试剂要求3.1.1标准血清（抗A、抗B、抗A1、抗D）所有试剂必须符合国家标准GB18469-2012《全血及成分血质量要求》及体外诊断试剂注册要求，有效期内使用，性能要求如下：（1）单克隆抗A、抗B血清：对A1型红细胞凝集效价≥128，对B型红细胞凝集效价≥128；对A2型红细胞凝集效价≥64，对B亚型红细胞凝集效价≥64；无冷凝集活性，无非特异性凝集，特异性符合要求，仅凝集对应抗原阳性红细胞。（2）抗A1血清：凝集效价≥64，仅凝集A1型红细胞，不凝集A2及以下亚型红细胞，特异性合格。（3）抗D血清：常用单克隆IgM型盐水抗D，凝集效价≥16，可凝集所有常见D阳性红细胞，包括部分弱D，无自发凝集。标准血清保存要求：2℃~8℃密封避光保存，严禁冷冻，冷冻会导致抗体蛋白变性失活；开封后的试剂需标注开封日期，在有效期内使用，发现浑浊、沉淀、溶血、变色时立即废弃。3.1.2反定型用标准红细胞商品化试剂红细胞需符合注册要求，自制试剂红细胞需满足以下要求：（1）试剂红细胞来源：分别取自3名及以上经血清学确认血型的健康无偿献血者，A1型、B型、O型分别混合，排除溶血、凝血及携带高频不规则抗原的红细胞。（2）红细胞处理：采集后的红细胞分离后，用生理盐水洗涤3次以上，去除所有血浆成分，避免血浆中可溶性血型抗原中和待检血清中的抗体，影响结果判读。（3）工作浓度配制：试验前配制成3%（v/v）生理盐水红细胞悬液，配制方法为：取离心后的压积红细胞1份，加入32份生理盐水充分混匀，即可得到浓度约3%的红细胞悬液；若采用滴加法，1滴压积红细胞加入31滴生理盐水，浓度约为3%。标准红细胞保存要求：2℃~8℃保存，保存期不超过30天，使用前充分混匀，发现溶血、细菌污染立即废弃。3.2耗材要求（1）试管：采用12mm×75mm或13mm×100mm中性玻璃试管或一次性无粉塑料试管，试管内径均匀，清洁无油污、无划痕，一次性试管需无内毒素、无表面活性剂残留。（2）加样器具：玻璃移液管、可调式移液器及一次性吸头，加样精度误差≤5%，不同标本、不同试剂必须更换吸头，避免交叉污染。（3）其他：载玻片、一次性反应纸板、显微镜、计数板等，所有耗材需清洁干燥，无异物残留。3.3仪器要求（1）离心机：采用水平式离心机，可调节离心力和离心时间，离心力范围可达500g~2000g，每年至少校准1次离心力，确保离心参数准确。（2）冰箱：2℃~8℃医用冷藏冰箱，温度波动≤±2℃，每天记录温度，确保试剂保存温度符合要求。（3）自动化血型检测仪：按照仪器说明书定期校准维护，性能验证合格后方可使用。4操作前准备4.1标本处理（1）标本要求：常规采用EDTA-K2抗凝静脉血，抗凝浓度为1.5~2.2mg/ml血液，也可使用不凝固血清标本；严禁使用重度溶血标本，重度溶血可导致红细胞基质释放，中和血清抗体，造成反定型假阴性，同时血红蛋白干扰结果观察，重度溶血需重新采集标本；轻度溶血标本不影响结果时可使用。（2）标本保存：室温（20℃~25℃）保存不超过24小时，2℃~8℃保存不超过7天，长期保存需置于-20℃以下，检测前需37℃充分复温，混匀后使用。（3）标本核对：检测前必须核对标本信息与申请单信息，确认姓名、性别、住院号/献血码、标本编号一致，核对无误后方可检测，错标、错放标本必须退回重新采集。4.2试剂准备取出保存的试剂，置于室温平衡10~15分钟，避免冷试剂诱导冷凝集素反应造成假阳性；检查试剂标签、有效期、性状，确认无浑浊、污染、变质后，按要求配制工作浓度备用。5操作流程（试管法，推荐为常规方法）5.1ABO正定型操作（1）标记试管：根据检测需求标记抗A管、抗B管、抗A1管（必要时）、抗D管（RhD检测），标记清晰，避免混淆。（2）加标准血清：向对应标记试管中分别加入相应的标准血清1滴（约50μl），加样时避免试剂瓶口接触试管内壁，防止污染试剂。（3）加待检红细胞悬液：向每管中加入3%待检红细胞生理盐水悬液1滴（约50μl），抗原抗体比例为1:1，若怀疑抗原减弱，可将血清量增加至2滴，比例调整为2:1，提高检出率。（4）混匀：手持试管架轻轻晃动，使管内试剂充分混匀，避免液体溅出。（5）离心：设置离心参数为1000g离心1分钟；若离心机无离心力显示，可按旋转半径调整转速：旋转半径10cm的离心机设置为3400r/min离心1分钟，旋转半径15cm的离心机设置为2500r/min离心1分钟，确保离心力符合要求。5.2ABO反定型操作（1）标记试管：分别标记A1c管（A1型标准红细胞）、Bc管（B型标准红细胞）、Oc管（O型标准红细胞，用于检测血清中冷抗体、不规则抗体）。（2）加待检血清：向每管中加入待检血清2滴（约100μl），反定型增加血清量，保证抗体浓度足够，避免弱抗体漏检。（3）加标准红细胞：向对应标记管中分别加入3%对应标准红细胞悬液1滴（约50μl）。（4）混匀、离心：同正定型操作，1000g离心1分钟。5.3RhD定型操作RhD定型同正定型操作，标记抗D管，加入抗D血清1滴，加待检3%红细胞悬液1滴，混匀离心后观察结果。若初始结果为阴性，需进行RhD阴性确认试验。5.4其他方法操作要点（1）玻片法：仅适用于快速现场筛查，不能作为最终报告依据。操作：标记玻片后，分别滴加抗A、抗B血清各1滴，加1滴10%待检红细胞悬液，混匀后室温摇动玻片2分钟，肉眼观察结果；室温低于15℃时需加盖保持温度，避免假阴性。（2）微孔板法：适用于大批量标本自动化检测，每孔加对应血清50μl，加红细胞悬液50μl，封板后振荡混匀，1000g离心1分钟，酶标仪或肉眼判读结果，严格按照仪器说明书操作。6结果判读6.1凝集强度分级标准离心取出试管后，首先观察上清液颜色，若出现透明红色溶血，提示抗原抗体结合激活补体导致红细胞溶解，判定为阳性结果；随后轻弹试管底部，使红细胞沉淀扣松散，观察凝集情况，按以下标准分级：4+：单个大块凝集，上清液完全透明，无游离红细胞；3+：数个较大凝集块，上清液基本透明，少量游离红细胞；2+：中等大小凝集块，肉眼清晰可见，上清液清亮，游离红细胞比例约50%；1+：细小凝集块，肉眼可见，上清液浑浊，大部分为游离红细胞；±：肉眼未见凝集，镜下可见微小凝集颗粒；w：仅镜下可见凝集，肉眼不可分辨；：红细胞均匀分散，无凝集颗粒，镜下未见凝集。6.2ABO血型结果判定正反定型结果一致方可判定血型，结果如下：抗A凝集、抗B不凝集，反定型A1c不凝集、Bc凝集，判定为A型；抗A不凝集、抗B凝集，反定型A1c凝集、Bc不凝集，判定为B型；抗A、抗B均凝集，反定型A1c、Bc均凝集，判定为AB型；抗A、抗B均不凝集，反定型A1c、Bc均不凝集，判定为O型；注：Oc管（O型标准红细胞）凝集提示待检血清中存在冷抗体、不规则抗体或自身抗体，需进一步处理排除干扰。6.3RhD血型结果判定抗D管凝集，质控符合要求，判定为RhD阳性；抗D管不凝集，判定为初始阴性，需进行确认试验：采用抗人球蛋白试验、酶试验或吸收放散试验检测，确认后仍为阴性判定为RhD阴性；检出弱D、部分D，献血者标本按RhD阴性报告，避免给RhD阴性受血者引起同种免疫反应，受血者标本按RhD阳性报告。7质量控制7.1室内质控每次检测前必须随标本做室内质控，更换试剂批号、仪器维修、搬迁后必须重新做质控，质控合格后方可检测：（1）正定型质控：采用已知A型红细胞（验证抗A活性）、B型红细胞（验证抗B活性）、O型红细胞（验证阴性特异性）、RhD阳性红细胞、RhD阴性红细胞同时检测，结果符合预期即为合格。（2）反定型质控：采用已知A型血清（凝集A1红细胞，不凝集B红细胞）、B型血清（凝集B红细胞，不凝集A1红细胞）检测，结果符合预期即为合格。（3）失控处理：质控结果不符合预期时，立即停止检测，查找原因，包括试剂失效、离心参数错误、污染等，纠正后重新检测，合格后方可继续。7.2室间质评每年至少参加2次由国家级或省级临床检验中心组织的血型鉴定室间质评，室间质评成绩合格方可开展检测，不合格的必须整改，整改合格后方可恢复检测。7.3操作过程质量控制严格控制加样顺序，先加血清后加红细胞，避免漏加血清；严格控制红细胞悬液浓度，3%浓度误差不超过±1%，浓度过高会导致抗体相对不足，出现假阴性，浓度过低会导致凝集观察不清；严格控制离心参数，离心力过高会导致红细胞挤压凝集出现假阳性，离心力过低会导致凝集块分散出现假阴性；环境温度控制在20℃~25℃，温度低于15℃需采取保温措施，避免冷凝集素干扰。8正反定型不符的原因与处理原则ABO正反定型不符是临床常见异常结果，必须查明原因后方可发出报告，常见原因及处理如下：8.1生理性抗体水平异常（1）新生儿：出生6个月以内的婴儿，自身血型抗体尚未完全产生，血清中抗体多来自母体，抗体水平低，反定型常不出现凝集或凝集微弱，可仅报告正定型结果，6个月后复查。（2）老年人、恶性肿瘤、免疫缺陷病、长期使用免疫抑制剂患者：血清中抗体水平明显降低，反定型凝集减弱，导致结果不符。处理：增加待检血清量至4滴，延长孵育时间10分钟后离心，或将标本置于4℃孵育30分钟后离心观察，可提高弱抗体检出率。8.2自身抗体干扰（最常见原因为冷凝集素）冷凝集素多数为IgM型自身抗体，低温下可凝集自身红细胞及所有标准红细胞，导致Oc管也凝集，正反定型均出现假凝集。处理：①将待检红细胞用37℃预温的生理盐水洗涤3次，去除红细胞表面吸附的自身抗体后重新做正定型；②反定型将反应体系置于37℃孵育10分钟后离心，37℃条件下观察结果，抑制冷凝集素活性；③高效价冷凝集素可采用患者自身红细胞4℃吸收血清，去除自身冷凝集素后再做反定型，或用二硫苏糖醇（DTT）处理血清破坏IgM抗体后检测。8.3不规则抗体干扰待检血清中存在ABO系统以外的不规则抗体，如抗M、抗N、抗P1、抗Lea等，可凝集对应抗原阳性的标准红细胞，导致反定型结果异常。处理：①进行不规则抗体筛选及鉴定，明确抗体特异性；②选用无对应抗原的标准红细胞重新做反定型，即可得到正确结果。8.4ABO亚型ABO亚型红细胞抗原强度弱，正定型凝集不明显，部分亚型血清中可存在抗A1，导致反定型结果不符，如A2亚型、Ax亚型、Ael亚型等。处理：加做抗A1凝集试验，采用吸收放散试验检测红细胞表面弱抗原，必要时进行基因分型明确血型。例如A2型：正定型抗A弱阳性或不凝集，抗A1不凝集，反定型A1c凝集，Bc不凝集，吸收放散试验可检出A抗原，即可判定为A2型。8.5缗钱状凝集（假凝集）常见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、高球蛋白血症患者，或输入右旋糖酐、羟乙基淀粉等大分子药物，红细胞形成缗钱状排列，外观类似凝集。处理：在反应管中加入1滴生理盐水，混匀后重新观察，缗钱状凝集会完全散开，真性凝集不会散开；也可采用盐水替换法，离心后弃去上清，加入生理盐水重悬红细胞后观察，即可排除干扰。8.6抗原强度减弱白血病、骨髓增生异常综合征、恶性肿瘤放化疗后，红细胞ABO抗原表达减弱，正定型凝集不明显，导致结果不符。处理：采用吸收放散试验检测红细胞抗原，结合反定型结果，必要时做基因分型明确血型，结合家系调查辅助判断。8.7混合凝集常见于异基因造血干细胞移植后、近期输注不同血型红细胞的患者，体内存在两种不同血型的红细胞群体，出现部分凝集部分不凝集的混合外观。处理：详细询问病史，明确移植史、输血史，可采用分子生物学方法检测患者自身血型，试验中注意区分供者型与受者型。8.8试剂与操作误差试剂污染、试剂效价降低、加错试剂、标记错误、离心参数错误等，均可导致结果不符。处理：更换合格试剂，重新核对所有步骤，重新操作检测。9注意事项（1）ABO血型鉴定必须