基于晶体结构解析人类caspase-6活性调节的分子密码

基于晶体结构解析人类caspase-6活性调节的分子密码一、引言1.1研究背景细胞凋亡，作为一种程序性细胞死亡过程，在多细胞生物的发育、组织稳态维持以及疾病发生发展中发挥着至关重要的作用。这一过程由细胞内源性信号触发，通过一系列精密的生化反应，最终导致细胞以可控的方式分解，并避免对周围组织造成炎症反应。其特征性变化包括细胞皱缩、染色质浓缩、线粒体功能障碍、膜泡形成以及最终形成凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞清除。而在细胞凋亡的众多调控因子中，caspase-6占据着独特且关键的地位。caspase-6属于半胱氨酸蛋白酶家族，是细胞凋亡的主要执行者之一，在凋亡起始caspases级联反应激活后，进而激活下游效应分子，发挥作用。当细胞接收到凋亡信号时，caspase-6被激活，随后它能够特异性地切割一系列细胞内的底物蛋白，这些底物蛋白涉及细胞的结构、代谢、信号传导等多个重要方面。通过对底物蛋白的切割，caspase-6引发细胞发生形态学变化，如细胞膜皱缩、染色质凝集等，以及功能丧失，最终导致细胞凋亡的发生。在胚胎发育过程中，caspase-6参与了手指和足趾的形成，通过诱导指间组织细胞凋亡，去除多余细胞，使手指和足趾得以正常分化。若caspase-6的功能出现异常，可能导致胚胎发育畸形。除了在细胞凋亡中发挥关键作用外，越来越多的研究表明，caspase-6与神经退行性疾病的发生发展密切相关。在阿尔茨海默病患者的大脑中，caspase-6的活性显著升高，且其异常激活与神经元的凋亡和疾病进展紧密相连。caspase-6能够切割tau蛋白和淀粉样前体蛋白（APP），促进神经纤维缠结和淀粉样斑块的形成，这两种病理特征是阿尔茨海默病的标志性病变。在亨廷顿氏症中，突变的亨廷顿蛋白会异常激活caspase-6，导致神经元的选择性死亡，进而引发患者出现运动障碍、认知衰退等典型症状。caspase-6在帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等其他神经退行性疾病中也扮演着重要角色，其异常活化会加剧神经元的损伤和死亡，推动疾病的恶化。鉴于caspase-6在细胞凋亡和神经退行性疾病中的重要作用，深入研究其活性调节机制具有极其重要的意义。从基础研究的角度来看，揭示caspase-6的活性调节机制有助于我们更深入地理解细胞凋亡的分子机制以及神经退行性疾病的发病机理，为这些领域的理论发展提供关键的实验依据和理论支持。在细胞凋亡研究中，明确caspase-6的激活和调控过程，能够帮助我们构建更完善的细胞凋亡信号通路模型，进一步阐明细胞凋亡的精细调控网络。对于神经退行性疾病而言，了解caspase-6活性异常的原因和机制，有助于我们揭示疾病发生发展的本质，为寻找新的治疗靶点和开发有效的治疗策略奠定坚实的理论基础。从临床应用的角度出发，研究caspase-6的活性调节机制为相关疾病的治疗开辟了新的方向。在神经退行性疾病的治疗中，通过开发特异性的caspase-6抑制剂，有望阻断或减缓神经元的凋亡过程，从而达到治疗疾病的目的。一种名为Z-VEID-FMK的物质，作为一种选择性且不可逆的caspase-6肽抑制剂，能够通过结合到caspase-6的活性位点，阻止其对底物蛋白的酶解，从而有效地抑制细胞凋亡信号通路的传导。研究表明，Z-VEID-FMK在减少S-(+)-氯胺酮诱导的caspase-6活性增强、DNA断裂等方面具有显著效果，这为相关精神疾病的治疗提供了新的思路。在癌症治疗中，caspase-6的异常激活与肿瘤细胞的耐药性和转移能力密切相关。通过研究caspase-6的活性调节机制，我们可以开发出能够调节caspase-6活性的药物，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制肿瘤细胞的转移，提高癌症的治疗效果。晶体结构分析技术作为一种强大的研究手段，为我们深入探究caspase-6的活性调节机制提供了有力的工具。通过X射线晶体学或冷冻电镜技术，我们能够获得caspase-6在原子分辨率水平的三维结构信息。这些结构信息就像是一把钥匙，能够帮助我们解锁caspase-6的活性调节密码。从晶体结构中，我们可以清晰地观察到caspase-6的活性位点、底物结合位点以及与其他调节分子的相互作用界面，从而深入了解其催化机制和活性调节的分子基础。通过对不同状态下caspase-6晶体结构的比较分析，我们可以揭示其激活和抑制过程中的构象变化，为设计特异性的小分子抑制剂或激活剂提供精准的结构信息。北京大学蛋白质与植物基因国家重点实验室及生命科学学院生物动态光学成像中心的苏晓东课题组通过解析多个caspase-6的晶体结构，系统性地研究了caspase-6的活化、抑制及调控机理，发现了其独特的“自活化”特性，为以caspase-6为靶标的药物设计打下了坚实的结构基础。1.2研究目的与意义本研究旨在通过晶体结构分析技术，深入探究人类caspase-6的活性调节机制，为相关疾病的治疗提供坚实的理论依据和潜在的治疗靶点。具体而言，本研究具有以下几个方面的重要意义：揭示caspase-6活性调节的分子机制：尽管目前已经对caspase-6在细胞凋亡和神经退行性疾病中的作用有了一定的认识，但对于其活性调节的详细分子机制仍存在许多未知。通过解析caspase-6在不同状态下的晶体结构，我们可以从原子分辨率水平观察其活性位点、底物结合位点以及与其他调节分子的相互作用界面，从而深入理解其催化机制和活性调节的分子基础。通过对caspase-6与底物或抑制剂复合物晶体结构的分析，我们可以明确底物与酶的相互作用方式，以及抑制剂对酶活性的抑制机制，为进一步研究caspase-6的生物学功能提供重要的结构信息。为神经退行性疾病的治疗提供新的靶点和策略：神经退行性疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿氏症等严重威胁着人类的健康和生活质量，目前尚无有效的治疗方法。caspase-6在这些疾病的发病过程中扮演着重要角色，其异常激活导致神经元的凋亡和死亡。因此，深入研究caspase-6的活性调节机制，有助于我们寻找新的治疗靶点和开发有效的治疗策略。通过基于结构的药物设计方法，我们可以利用caspase-6的晶体结构信息，设计和筛选特异性的小分子抑制剂，阻断caspase-6的异常激活，从而减缓或阻止神经退行性疾病的进展。这些抑制剂可以通过与caspase-6的活性位点或关键调节区域结合，抑制其酶活性，减少对底物蛋白的切割，从而保护神经元免受损伤。拓展对细胞凋亡机制的认识：细胞凋亡是一个复杂而精细的调控过程，caspase-6作为细胞凋亡的主要执行者之一，其活性调节机制的研究对于深入理解细胞凋亡的分子机制具有重要意义。通过对caspase-6晶体结构的研究，我们可以揭示其在细胞凋亡信号通路中的激活和调控方式，进一步完善细胞凋亡的理论体系。这不仅有助于我们更好地理解细胞凋亡在正常生理和病理条件下的作用，还为开发针对细胞凋亡相关疾病的治疗方法提供了理论基础。在癌症治疗中，我们可以利用对细胞凋亡机制的深入理解，开发能够诱导肿瘤细胞凋亡的药物，或者增强肿瘤细胞对现有化疗药物的敏感性，提高癌症的治疗效果。推动结构生物学和药物研发领域的发展：本研究采用的晶体结构分析技术是结构生物学领域的重要研究手段，通过对caspase-6晶体结构的解析和研究，不仅可以为caspase-6相关疾病的治疗提供理论支持，还可以为结构生物学和药物研发领域的发展做出贡献。晶体结构信息可以为其他蛋白质的结构研究提供参考和借鉴，推动结构生物学技术的不断创新和发展。同时，基于结构的药物设计方法的应用，也将促进药物研发领域的发展，提高新药研发的效率和成功率，为解决人类健康问题提供更多的药物选择。二、caspase-6概述2.1caspase-6的生物学功能2.1.1在细胞凋亡中的作用细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，对于多细胞生物的发育、组织稳态维持以及免疫调节等生理过程至关重要。在细胞凋亡的复杂调控网络中，caspase-6作为效应半胱天冬酶，扮演着关键的执行角色，它主要作用于细胞凋亡的执行阶段，通过切割一系列特定的底物蛋白，引发细胞发生不可逆的凋亡变化。caspase-6以酶原（procaspase-6）的形式存在于细胞中，在接收到凋亡信号后，酶原分子通过自身蛋白水解或被其他激活的caspase（如caspase-3、caspase-8等）裂解，去除N端的前结构域，并切割成大小两个亚基，即大亚基（约18kDa）和小亚基（约11kDa），这两个亚基进一步缔合形成具有催化活性的caspase-6异二聚体，从而启动其在细胞凋亡中的关键作用。在外部死亡受体途径中，当Fas配体与细胞表面的Fas受体结合后，受体三聚化并招募接头蛋白FADD，进而募集procaspase-8形成死亡诱导信号复合物（DISC），procaspase-8在DISC中发生同源活化，激活的caspase-8可以直接切割并激活caspase-6；在线粒体介导的内部途径中，细胞受到凋亡刺激后，线粒体释放细胞色素c到细胞质，与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP结合形成凋亡小体，招募并激活procaspase-9，活化的caspase-9再激活caspase-6，由此引发细胞凋亡的级联反应。一旦被激活，caspase-6便展现出高度的底物特异性，能够精准地识别并切割含有特定四肽序列（VEID，即缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸）的底物蛋白，这些底物蛋白广泛参与细胞的结构维持、代谢调节、信号传导等多个重要生理过程。核纤层蛋白A（LaminA）是caspase-6的重要底物之一，LaminA是构成细胞核纤层的主要成分，对维持细胞核的结构完整性和稳定性起着关键作用。当caspase-6被激活后，它会特异性地切割LaminA，导致核纤层结构的破坏，使细胞核失去正常的形态和功能，出现染色质凝集、核膜破裂等典型的凋亡特征，这一过程不仅影响了细胞核内的DNA复制、转录等过程，还进一步引发了细胞整体结构和功能的紊乱，推动细胞走向凋亡。聚ADP核糖聚合酶（PARP）也是caspase-6的作用底物，PARP是一种参与DNA修复和基因组维持的重要酶，在正常细胞中，PARP能够识别并结合到DNA损伤部位，通过催化聚ADP核糖化反应，招募相关的DNA修复蛋白，启动DNA修复过程，以维持基因组的稳定性。在细胞凋亡过程中，caspase-6对PARP的切割使其失去正常的DNA修复功能，导致DNA损伤无法及时修复，进一步加剧了细胞凋亡的进程。caspase-6还可以切割细胞骨架蛋白，如角蛋白18（Keratin18），角蛋白是中间丝蛋白家族的成员，广泛存在于上皮细胞中，对维持细胞的形态和机械稳定性起着重要作用，caspase-6对Keratin18的切割会破坏细胞骨架的完整性，使细胞失去正常的形态和极性，导致细胞变圆、皱缩，最终引发细胞凋亡。caspase-6在细胞凋亡过程中还参与了细胞凋亡小体的形成，细胞凋亡小体是细胞凋亡的标志性结构，由凋亡细胞的细胞膜包裹着断裂的DNA、细胞器碎片等物质形成，这些凋亡小体最终被邻近的吞噬细胞识别并吞噬清除，从而避免了细胞内容物的泄漏引发炎症反应。caspase-6通过切割相关的细胞内膜泡运输蛋白，如Syntaxin1等，影响细胞内膜泡的运输和融合过程，促进凋亡小体的形成和释放，使细胞凋亡得以有序进行。2.1.2在神经退行性疾病中的角色随着全球老龄化进程的加速，神经退行性疾病如阿尔茨海默症（AD）、亨廷顿氏症（HD）、帕金森病（PD）等的发病率逐年上升，这些疾病严重威胁着人类的健康和生活质量，目前尚无有效的根治方法。越来越多的研究表明，caspase-6在神经退行性疾病的发生发展过程中扮演着至关重要的角色，其异常激活与神经元的凋亡和疾病的进展密切相关。在阿尔茨海默症中，caspase-6的异常激活被认为是导致神经元死亡和认知功能障碍的关键因素之一。阿尔茨海默症的主要病理特征是大脑中出现大量的淀粉样斑块和神经纤维缠结，淀粉样斑块主要由β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集形成，神经纤维缠结则主要由过度磷酸化的tau蛋白聚集而成。研究发现，Aβ寡聚体可以通过激活线粒体凋亡途径，导致caspase-6的异常激活，激活的caspase-6会进一步切割tau蛋白，使其发生异常磷酸化和聚集，形成神经纤维缠结，这些神经纤维缠结会破坏神经元的细胞骨架和轴突运输，导致神经元功能受损和死亡。caspase-6还可以切割淀粉样前体蛋白（APP），产生具有神经毒性的Aβ片段，进一步促进淀粉样斑块的形成，加剧神经炎症反应，形成恶性循环，推动阿尔茨海默症的病情进展。亨廷顿氏症是一种由基因突变引起的神经退行性疾病，患者体内的亨廷顿蛋白（HTT）基因发生突变，导致其编码的亨廷顿蛋白出现异常多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列，突变的亨廷顿蛋白（mHTT）会发生错误折叠和聚集，形成有毒的聚集体，这些聚集体在神经元内逐渐积累，引发一系列细胞毒性反应，导致神经元凋亡。研究表明，mHTT可以通过多种途径激活caspase-6，如mHTT可以与凋亡相关蛋白相互作用，激活线粒体凋亡途径或死亡受体途径，从而间接激活caspase-6；mHTT还可以直接与caspase-6结合，改变其构象，使其活性增强。被激活的caspase-6会切割多种神经元内的关键蛋白，如TATA结合蛋白（TBP）、huntingtin相关蛋白1（HAP1）等，这些蛋白的切割会导致神经元的转录调控异常、轴突运输障碍以及能量代谢紊乱等，最终导致神经元死亡，引发患者出现进行性的运动障碍、认知衰退和精神症状等典型的亨廷顿氏症临床表现。帕金森病是一种常见的中老年神经系统退行性疾病，主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性死亡，导致纹状体多巴胺水平显著降低，从而引起运动迟缓、震颤、肌强直等运动症状以及认知障碍、抑郁等非运动症状。在帕金森病的发病过程中，caspase-6同样发挥着重要作用，α-突触核蛋白（α-synuclein）的异常聚集是帕金森病的重要病理标志之一，研究发现，α-synuclein聚集形成的寡聚体和纤维可以激活caspase-6，激活的caspase-6会切割多巴胺能神经元内的多种关键蛋白，如酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）等，这些蛋白的切割会导致多巴胺的合成和转运受阻，使多巴胺能神经元的功能受损，最终导致神经元死亡。caspase-6还可以通过切割细胞骨架蛋白和线粒体相关蛋白，破坏神经元的结构和功能，加剧帕金森病的病情进展。除了上述几种常见的神经退行性疾病外，caspase-6在肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓小脑共济失调（SCA）等其他神经退行性疾病中也被发现存在异常激活的情况，并且与疾病的发生发展密切相关。在肌萎缩侧索硬化症中，caspase-6的异常激活会导致运动神经元的凋亡，使患者出现进行性的肌肉无力、萎缩和瘫痪等症状；在脊髓小脑共济失调中，caspase-6的异常激活会影响小脑神经元的功能，导致患者出现共济失调、平衡障碍等症状。2.2caspase-6的结构基础2.2.1整体结构特征caspase-6是一种半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡和神经退行性疾病等生理病理过程中发挥着关键作用。其整体结构呈现出独特的二聚体形式，这种结构特征对于其功能的发挥至关重要。每个caspase-6分子由一条多肽链组成，在激活过程中，该多肽链会被切割成两个亚基，即大亚基（约18kDa）和小亚基（约11kDa），这两个亚基通过非共价相互作用紧密结合，形成具有催化活性的异二聚体。而caspase-6的活性形式则是由两个这样的异二聚体进一步组装形成的四聚体结构，这种四聚体结构为caspase-6的催化活性提供了稳定的空间框架。从空间构象上看，caspase-6的二聚体结构呈现出一种紧凑而有序的排列方式。大亚基和小亚基相互配合，形成了一个具有特定三维结构的活性中心。在这个活性中心周围，分布着多个与底物结合、催化反应以及调节蛋白相互作用相关的结构区域。其中，催化结构域位于活性中心的核心位置，包含了半胱氨酸残基（Cys）和组氨酸残基（His）等关键催化位点，这些位点通过形成特定的氢键网络和静电相互作用，共同参与底物的识别和切割过程。底物结合结构域则位于催化结构域的附近，其氨基酸序列和空间构象决定了caspase-6对底物的特异性识别能力，只有当底物的氨基酸序列与底物结合结构域互补匹配时，caspase-6才能有效地与之结合并进行切割反应。与其他caspase家族成员相比，caspase-6的结构既存在一些共性，也具有其独特之处。所有caspase家族成员都包含一个保守的半胱氨酸活性位点，该位点在催化反应中起着关键作用，通过亲核攻击底物的天冬氨酸残基，引发肽键的断裂。caspase家族成员在整体折叠方式和亚基组成上也具有一定的相似性，都倾向于形成二聚体或多聚体结构，以增强其催化活性和稳定性。caspase-6与其他成员在底物结合特异性和调节机制方面存在明显差异。caspase-6对底物的识别具有高度特异性，主要识别含有缬氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸（VEID）四肽序列的底物，而其他caspase家族成员则具有不同的底物识别序列，caspase-3主要识别天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）序列。在调节机制方面，caspase-6可能受到多种因素的调控，包括磷酸化、蛋白质-蛋白质相互作用以及小分子抑制剂的结合等，这些调节方式与其他caspase家族成员的调控机制既有重叠，也存在各自独特的调控途径。2.2.2关键结构域及功能caspase-6包含多个关键结构域，这些结构域在其活性调节和生物学功能的发挥中起着不可或缺的作用。其中，催化结构域和底物结合结构域是最为重要的两个结构域，它们协同作用，确保了caspase-6能够高效、特异性地切割底物，从而实现其在细胞凋亡和神经退行性疾病等过程中的生物学功能。催化结构域是caspase-6发挥酶活性的核心区域，它包含了半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）等关键催化残基。这些残基通过形成特定的催化三联体或催化二联体，参与底物的水解反应。在caspase-6的催化结构域中，半胱氨酸残基的巯基（-SH）作为亲核试剂，能够攻击底物中天冬氨酸残基的羰基碳，形成一个共价的硫酯中间体。随后，在组氨酸残基的协助下，水分子对硫酯中间体进行亲核攻击，导致肽键断裂，释放出切割后的产物。这种催化机制使得caspase-6能够特异性地切割底物蛋白，引发细胞凋亡相关的一系列生物学事件。催化结构域的构象稳定性和活性中心的微环境对caspase-6的催化效率和底物特异性具有重要影响。当催化结构域发生构象变化时，可能会影响关键催化残基的相对位置和活性中心的空间结构，从而改变caspase-6的催化活性和底物结合能力。某些小分子抑制剂能够与催化结构域结合，改变其构象，从而抑制caspase-6的酶活性。底物结合结构域位于caspase-6分子的表面，其主要功能是特异性地识别和结合底物蛋白。该结构域的氨基酸序列和空间构象决定了caspase-6对底物的选择性。caspase-6的底物结合结构域能够精确识别含有VEID四肽序列的底物，通过与底物中氨基酸残基之间的氢键、静电相互作用和疏水相互作用等非共价相互作用，实现与底物的特异性结合。一旦底物与底物结合结构域结合，caspase-6的催化结构域便能够迅速对底物进行切割，引发细胞凋亡过程。底物结合结构域的特异性和亲和力对于caspase-6的生物学功能至关重要。如果底物结合结构域的特异性发生改变，可能会导致caspase-6错误地切割非特异性底物，从而影响细胞的正常生理功能。底物结合结构域与底物之间的亲和力也会影响caspase-6的催化效率，亲和力过低可能导致底物结合不稳定，影响切割反应的进行；而亲和力过高则可能导致底物在酶活性中心的滞留，影响酶的周转效率。除了催化结构域和底物结合结构域之外，caspase-6还包含其他一些重要的结构域，如前结构域（pro-domain）和调节结构域等。前结构域位于caspase-6酶原的N端，在酶原激活过程中，前结构域会被切除，从而使caspase-6获得酶活性。前结构域在caspase-6的酶原状态下可能起到抑制酶活性的作用，防止其在未接收到凋亡信号时被过早激活，从而维持细胞的正常生理状态。调节结构域则参与了caspase-6活性的调节过程，它可以与其他蛋白质或小分子调节因子相互作用，通过变构效应等方式影响caspase-6的活性。一些调节蛋白能够与caspase-6的调节结构域结合，改变其构象，从而增强或抑制caspase-6的酶活性，实现对细胞凋亡过程的精细调控。三、基于晶体结构的研究方法3.1晶体结构解析技术3.1.1X射线晶体学原理与应用X射线晶体学是确定生物大分子三维结构的经典且重要的技术，其原理基于X射线与晶体中原子的相互作用。X射线是一种波长极短的电磁波，当X射线照射到晶体时，晶体中的原子会使X射线发生散射，由于晶体中原子呈周期性规则排列，这些散射的X射线会在某些特定方向上相互干涉加强，形成衍射图案。这些衍射图案包含了晶体中原子的位置、排列方式以及原子间距离等重要信息。1912年，德国物理学家劳厄（MaxvonLaue）首次发现X射线通过晶体时会产生衍射现象，这一发现为X射线晶体学的发展奠定了基础。随后，英国物理学家布拉格父子（WilliamHenryBragg和WilliamLawrenceBragg）进一步提出了布拉格定律，该定律用公式表示为nλ=2dsinθ，其中n为整数（衍射级数），λ为X射线的波长，d为晶体中原子平面之间的间距，θ为X射线的入射角与反射角。布拉格定律为解释X射线晶体衍射现象提供了理论依据，使得人们能够通过测量衍射图案中的衍射角和强度，计算出晶体中原子的位置和结构参数。在实际应用中，X射线晶体学解析caspase-6晶体结构的过程通常包括以下步骤：首先，需要获得高质量的caspase-6晶体，这是整个研究的关键步骤之一。晶体的质量直接影响到最终结构解析的分辨率和准确性。为了获得高质量的晶体，研究人员通常会采用多种方法，如优化蛋白质表达和纯化条件、筛选不同的结晶条件等。北京大学苏晓东实验室在解析caspase-6晶体结构时，通过对蛋白质表达载体、宿主细胞以及纯化方法的优化，成功获得了高纯度、高稳定性的caspase-6蛋白，为后续的结晶实验奠定了基础。他们还运用了高通量结晶技术，对大量不同的结晶条件进行筛选和优化，最终获得了适合结构解析的高质量caspase-6晶体。获得晶体后，将晶体放置在X射线源前，用X射线照射晶体，收集衍射数据。在数据收集过程中，需要精确控制X射线的强度、波长以及晶体的旋转角度等参数，以确保能够获得完整、准确的衍射图案。现代的X射线衍射仪通常配备有高灵敏度的探测器，能够快速、准确地记录衍射图案。收集到衍射数据后，需要运用复杂的数学算法和计算机程序对数据进行处理和分析，以确定晶体中原子的坐标和结构模型。这一过程包括相位确定、电子密度图计算、结构模型构建和优化等步骤。相位确定是X射线晶体学中最为关键也最为困难的步骤之一，目前常用的方法包括分子置换法、同晶置换法和反常散射法等。以苏晓东实验室解析caspase-6晶体结构为例，他们在获得高质量的caspase-6晶体后，利用同步辐射光源产生的高强度X射线对晶体进行照射，收集了大量的衍射数据。通过分子置换法，以已知结构的caspase家族成员为模板，成功确定了caspase-6晶体结构的相位信息。在此基础上，计算出电子密度图，根据电子密度图构建出caspase-6的初始结构模型。通过对结构模型进行反复优化和验证，最终获得了高分辨率的caspase-6晶体结构。通过对这些晶体结构的分析，他们发现了caspase-6独特的“自活化”特性，揭示了其活化、抑制及调控的分子机理，为以caspase-6为靶标的药物设计提供了坚实的结构基础。3.1.2其他相关技术辅助除了X射线晶体学技术外，冷冻电镜（Cryo-EM）等技术在caspase-6晶体结构研究中也发挥着重要的补充和验证作用。冷冻电镜技术是近年来发展迅速的一种结构生物学研究方法，它能够在接近生理状态下对生物大分子进行结构解析，尤其适用于那些难以结晶的生物大分子。冷冻电镜的原理是将生物大分子样品快速冷冻在液氮温度下，使其形成玻璃态冰，从而固定生物大分子的天然构象。然后，用电子束照射冷冻样品，通过记录电子与样品相互作用产生的散射信号，获得生物大分子的二维投影图像。利用图像处理和三维重构算法，对大量的二维投影图像进行分析和处理，最终重建出生物大分子的三维结构。冷冻电镜技术在caspase-6结构研究中的优势主要体现在以下几个方面：首先，冷冻电镜无需结晶，这对于那些难以结晶的caspase-6变体或复合物的结构研究具有重要意义。一些与caspase-6相互作用的调节蛋白或小分子抑制剂，由于其与caspase-6结合后可能影响晶体的形成，难以通过X射线晶体学获得其复合物结构。而冷冻电镜技术则可以直接对这些复合物进行结构解析，从而揭示它们之间的相互作用机制。其次，冷冻电镜能够在接近生理状态下对生物大分子进行研究，避免了晶体生长过程中可能引入的构象变化。在晶体生长过程中，生物大分子可能会受到晶格力的作用而发生构象改变，这可能会影响对其真实结构和功能的理解。而冷冻电镜技术可以在低温下快速固定生物大分子的天然构象，更准确地反映其在生理条件下的结构和功能。冷冻电镜技术也存在一些局限性，如分辨率相对较低、样品制备和数据处理过程较为复杂等。在研究caspase-6结构时，通常需要将冷冻电镜技术与X射线晶体学技术相结合，相互补充和验证。通过X射线晶体学获得caspase-6的高分辨率结构，为冷冻电镜结构解析提供参考和模板；利用冷冻电镜技术研究caspase-6在不同状态下的构象变化以及与其他分子的相互作用，进一步完善对其结构和功能的认识。在研究caspase-6与底物或抑制剂的相互作用时，可以先通过X射线晶体学获得其复合物的高分辨率结构，确定相互作用的关键位点和结构特征。然后，利用冷冻电镜技术观察复合物在溶液中的动态变化，以及不同浓度底物或抑制剂存在下caspase-6的构象变化，从而更全面地了解其催化机制和活性调节过程。三、基于晶体结构的研究方法3.2活性调节机制研究策略3.2.1定点突变技术探究结构与活性关系定点突变技术作为一种精准的分子生物学手段，在探究caspase-6结构与活性关系中发挥着关键作用。通过对caspase-6基因序列中特定氨基酸位点进行人为突变，改变其编码的氨基酸残基，进而深入分析突变体的晶体结构和活性变化，以此揭示关键氨基酸对caspase-6活性调节的影响机制。在实施定点突变时，首先需依据caspase-6的晶体结构信息以及已有的生物学知识，精确挑选目标氨基酸位点。若已知某氨基酸位于caspase-6的活性中心，且参与底物结合或催化反应，那么该氨基酸位点便可能成为定点突变的候选对象。北京大学苏晓东课题组在研究caspase-6时，基于其已解析的晶体结构，锁定了活性中心附近的几个关键氨基酸位点，如与底物结合密切相关的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）残基。通过巧妙设计突变引物，运用PCR技术对caspase-6基因进行扩增，实现了对这些目标位点的定点突变。成功构建突变体基因后，需将其导入合适的表达系统中进行蛋白表达与纯化。常用的表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统以及哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统具有生长迅速、操作简便、成本低廉等优点，适合大规模表达重组蛋白，但其缺乏对蛋白质的修饰加工能力，可能影响某些蛋白质的活性和功能。酵母表达系统则能够对蛋白质进行一定程度的修饰，表达的蛋白更接近天然状态，然而其表达量相对较低，培养条件较为复杂。哺乳动物细胞表达系统可以对蛋白质进行完整的修饰和折叠，表达的蛋白活性和功能与天然蛋白最为接近，但该系统培养成本高、操作难度大，且表达周期长。在实际研究中，需根据caspase-6突变体的特性和研究需求，合理选择表达系统。对于一些对修饰要求不高的突变体，可优先选择大肠杆菌表达系统；而对于那些需要精确修饰以保证活性的突变体，则需考虑使用酵母或哺乳动物细胞表达系统。获得纯化的突变体蛋白后，运用X射线晶体学或冷冻电镜技术解析其晶体结构。通过与野生型caspase-6晶体结构进行细致对比，能够清晰观察到突变位点引起的结构变化，包括氨基酸残基的空间位置改变、蛋白质二级和三级结构的重塑以及活性中心和底物结合位点的构象变化等。若突变位点位于底物结合位点，可能会导致底物结合口袋的形状和大小发生改变，影响底物与caspase-6的结合亲和力和特异性。通过分析这些结构变化，结合caspase-6活性测定结果，可深入探讨结构变化与活性改变之间的内在联系。利用caspase-6活性测定试剂盒，通过检测其对特异性底物Ac-VEID-pNA的水解活性，来准确评估突变体的酶活性。若某突变体的晶体结构显示其活性中心关键氨基酸残基发生改变，且活性测定结果表明其酶活性显著降低，那么可以推断该氨基酸残基在caspase-6的催化活性中起着至关重要的作用。3.2.2结合小分子配体的晶体结构分析研究caspase-6与小分子配体结合的晶体结构，是深入探究其活性调节机制的重要途径。以caspase-6与抑制剂Z-VEID-FMK结合为例，通过解析二者复合物的晶体结构，能够详细揭示小分子与caspase-6的结合模式，进而深入探讨这种结合模式对caspase-6活性的影响机制。Z-VEID-FMK是一种选择性且不可逆的caspase-6肽抑制剂，其化学结构由N端的苄氧羰基（Z或Cbz）修饰，中间依次连接缬氨酸（Val）、谷氨酸（Glu）、异亮氨酸（Ile）、天冬氨酸（Asp）这几个氨基酸残基，C端为氟甲基酮（FMK）结构。这种独特的结构使其能够特异性地与caspase-6的活性位点结合，从而有效抑制caspase-6的酶活性。在解析caspase-6与Z-VEID-FMK复合物晶体结构时，首先需要采用合适的方法制备复合物晶体。通常将纯化的caspase-6蛋白与过量的Z-VEID-FMK在适当的缓冲液中混合，使其充分结合。通过优化结晶条件，如调整溶液的pH值、离子强度、蛋白质和配体的浓度比例等，利用悬滴法、坐滴法等结晶技术，尝试获得高质量的复合物晶体。获得晶体后，运用X射线晶体学技术收集衍射数据，经过复杂的数据处理和结构解析过程，最终得到复合物的三维结构模型。从caspase-6与Z-VEID-FMK复合物的晶体结构中，可以清晰地观察到Z-VEID-FMK与caspase-6的结合模式。Z-VEID-FMK的氨基酸残基与caspase-6的底物结合位点通过氢键、静电相互作用和疏水相互作用等非共价相互作用紧密结合，其中FMK基团则与caspase-6活性中心的半胱氨酸残基形成共价键，从而不可逆地抑制caspase-6的酶活性。这种结合模式使得caspase-6的活性中心被占据，底物无法正常结合，进而阻断了细胞凋亡信号通路的传导。通过对caspase-6与Z-VEID-FMK结合模式的深入分析，还可以为基于结构的药物设计提供重要的理论依据。根据复合物的晶体结构信息，设计和合成具有更高亲和力和特异性的caspase-6抑制剂。可以对Z-VEID-FMK的结构进行优化，改变其氨基酸残基的组成或修饰方式，以增强其与caspase-6的结合能力；或者基于caspase-6活性中心和底物结合位点的结构特征，设计全新的小分子抑制剂，为神经退行性疾病等相关疾病的治疗提供更多的药物选择。四、caspase-6活性调节的晶体结构证据4.1自活化机制4.1.1分子内切割位点与自活化过程caspase-6的自活化是其发挥生物学功能的关键起始步骤，而这一过程与分子内切割位点的结构及被催化残基攻击的过程密切相关。从晶体结构层面深入剖析，能够为我们揭示caspase-6自活化的分子奥秘。在caspase-6酶原的晶体结构中，亚单位间切割位点190TEVD193呈现出独特且有序的结构特征。该切割位点由苏氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、缬氨酸（Val）和天冬氨酸（Asp）组成，其中天冬氨酸（Asp193）处于关键位置。晶体结构显示，此切割位点并非无序分布，而是巧妙地插入到caspase-6的活性位点之中。这种精准的插入使得Asp193能够与活性位点内的催化残基半胱氨酸（Cys163）紧密靠近，为后续的催化反应创造了极为有利的条件。在自活化过程中，催化残基Cys163发挥着核心作用。Cys163的巯基（-SH）具有很强的亲核性，它能够对处于活性位点内的Asp193的羰基碳发起亲核攻击。这一攻击过程涉及到复杂的电子云重排和化学键的断裂与形成。在亲核攻击的瞬间，Cys163的巯基电子云向Asp193的羰基碳靠近，使羰基碳的电子云密度发生改变，导致羰基碳与相邻的肽键之间的电子云分布不均。随着亲核攻击的持续进行，羰基碳与肽键之间的共价键逐渐削弱，最终断裂。在这一过程中，形成了一个共价的硫酯中间体，该中间体是反应的关键过渡态。在组氨酸（His）等其他辅助残基的协同作用下，水分子对硫酯中间体进行亲核攻击，使得硫酯键断裂，完成分子内切割，进而启动caspase-6的自活化过程。为了更深入地理解这一过程，研究人员进行了大量的生化实验和结构分析。通过定点突变技术，将催化残基Cys163突变为丙氨酸（Ala），结果发现caspase-6无法进行分子内切割和自活化，这直接证明了Cys163在自活化过程中的不可或缺性。利用X射线晶体学技术对不同阶段的caspase-6进行结构解析，清晰地观察到了分子内切割位点在自活化前后的构象变化，以及催化残基与切割位点之间的相互作用细节，为揭示自活化机制提供了直观的结构证据。4.1.2L2环长度对自活化的影响除了分子内切割位点与催化残基的相互作用外，caspase-6的L2环长度在其自活化过程中也扮演着重要角色。L2环是caspase-6结构中的一个特定区域，它的长度变化能够对分子内切割和自活化效率产生显著影响。通过实验和结构分析发现，L2环的长度与caspase-6的自活化效率之间存在着密切的关联。当L2环长度发生改变时，会引起caspase-6分子构象的微妙变化，进而影响分子内切割位点与活性位点之间的相对位置和相互作用。如果L2环过长，可能会导致分子内切割位点与活性位点之间的距离增加，使得催化残基难以有效地对切割位点进行攻击，从而降低自活化效率。过长的L2环可能会在空间上形成阻碍，影响催化残基与切割位点之间的正确取向，使得亲核攻击难以发生。相反，当L2环过短时，虽然分子内切割位点与活性位点之间的距离缩短，但可能会破坏caspase-6分子的整体结构稳定性，同样不利于自活化过程的进行。过短的L2环可能无法提供足够的空间来容纳催化残基与切割位点之间的相互作用，导致反应中间体的形成和转化受到阻碍。研究人员通过基因工程技术构建了一系列L2环长度不同的caspase-6突变体，并对这些突变体的自活化效率进行了详细的测定。实验结果表明，在一定范围内，随着L2环长度的增加，caspase-6的自活化效率逐渐降低；而当L2环长度缩短时，自活化效率则呈现出先升高后降低的趋势。这表明存在一个最适的L2环长度，能够使caspase-6的自活化效率达到最高。对这些突变体的晶体结构进行解析后发现，L2环长度的变化会引起活性位点周围氨基酸残基的构象改变，进而影响活性位点的微环境和催化活性。当L2环长度改变时，活性位点内的氢键网络和静电相互作用也会发生相应的变化，这些变化直接影响了催化残基的活性和分子内切割的效率。4.2磷酸化调控4.2.1磷酸化位点的晶体结构特征蛋白质的磷酸化修饰作为一种关键的翻译后修饰方式，在细胞信号传导、代谢调控以及细胞周期进程等众多重要的生物学过程中发挥着不可或缺的作用。caspase-6的磷酸化修饰对其活性调节具有重要意义，深入研究其磷酸化位点的晶体结构特征，能够为揭示caspase-6的活性调节机制提供关键线索。通过解析模拟磷酸化状态的caspase-6晶体结构，研究人员精准地确定了其磷酸化位点。在caspase-6的晶体结构中，丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基是常见的磷酸化位点。这些位点通常位于caspase-6分子的特定区域，与活性中心或底物结合位点存在紧密的空间联系。苏晓东实验室于2012年在《JournalofBiologicalChemistry》杂志发表的模拟磷酸化状态的caspase-6的晶体结构研究成果中，明确指出了某些丝氨酸残基处于caspase-6分子的表面loop区域，该区域与底物结合位点相邻，这暗示着这些丝氨酸残基的磷酸化可能会对底物结合过程产生影响。当这些位点发生磷酸化时，会引发周围结构的显著变化。从空间构象角度来看，磷酸化基团的引入会增加局部的电荷密度，从而改变周围氨基酸残基之间的静电相互作用。这可能导致蛋白质二级结构的调整，如α-螺旋的伸长或β-折叠的扭曲，进而影响蛋白质的整体折叠和稳定性。在caspase-6中，某个关键苏氨酸残基的磷酸化可能会破坏其周围原本稳定的氢键网络，使得局部结构变得更加灵活，或者促使其形成新的氢键，导致结构的刚性增加。这种结构变化可能会进一步影响caspase-6与底物或其他调节分子的结合能力。磷酸化还可能通过诱导蛋白质分子内的别构效应，影响活性中心的构象。活性中心的构象变化对于caspase-6的催化活性至关重要，它直接决定了酶与底物的结合亲和力以及催化反应的速率。当磷酸化引发的结构变化传递到活性中心时，可能会改变活性中心内关键氨基酸残基的相对位置，从而影响底物在活性中心的定位和催化反应的进行。若活性中心内的半胱氨酸残基与底物结合的关键位点因磷酸化导致的结构变化而发生位移，那么底物与caspase-6的结合就会受到阻碍，进而降低其催化活性。4.2.2磷酸化对活性的影响机制caspase-6的磷酸化修饰对其活性具有显著的调节作用，这种调节作用主要通过改变caspase-6的结构，进而影响其活性中心构象和底物结合能力来实现。从结构变化的角度来看，如前文所述，磷酸化会导致caspase-6分子局部结构的改变，这些结构改变会通过蛋白质的三维结构网络传递，最终对活性中心构象产生影响。当磷酸化发生在靠近活性中心的区域时，可能会直接改变活性中心的形状和电荷分布。若磷酸化导致活性中心的某个关键氨基酸残基的侧链发生旋转或位移，使得活性中心的口袋结构变得更加狭窄或宽敞，这将直接影响底物能否顺利进入活性中心并与催化位点结合。若活性中心的电荷分布因磷酸化而发生改变，可能会增强或减弱与带相反电荷底物的静电相互作用，从而影响底物结合的稳定性。磷酸化对底物结合能力的影响是其调节caspase-6活性的重要机制之一。底物结合能力的改变直接决定了caspase-6能否有效地识别和结合底物，进而启动催化反应。当磷酸化改变了caspase-6的结构后，底物结合位点的氨基酸残基组成和空间排列可能会发生变化，导致底物与caspase-6的结合亲和力发生改变。如果底物结合位点的氨基酸残基因磷酸化而发生构象变化，使得底物与这些残基之间的氢键、疏水相互作用或范德华力等非共价相互作用减弱，那么底物与caspase-6的结合就会变得不稳定，从而降低其催化活性。相反，如果磷酸化导致底物结合位点的构象更加适配底物的形状，增强了与底物的非共价相互作用，那么底物与caspase-6的结合亲和力就会提高，有利于催化反应的进行。除了直接影响底物结合能力外，磷酸化还可能通过调节caspase-6与其他调节蛋白的相互作用，间接影响其活性。caspase-6在细胞内的活性受到多种调节蛋白的调控，这些调节蛋白可以与caspase-6结合，形成复合物，从而影响其活性。磷酸化可能会改变caspase-6分子表面的电荷分布和构象，影响其与调节蛋白的结合位点和亲和力。若磷酸化使得caspase-6与某个正调节蛋白的结合亲和力增强，那么该调节蛋白就能够更有效地激活caspase-6的活性；反之，若磷酸化导致caspase-6与某个负调节蛋白的结合更加紧密，那么caspase-6的活性就会受到抑制。4.3Pro-domain的调控作用4.3.1Pro-domain的晶体结构与功能在caspase-6的酶原结构中，pro-domain位于N端，其独特的晶体结构赋予了它在caspase-6活性调节中不可或缺的功能。通过解析带有pro-domain的caspase-6晶体结构，我们能够清晰地洞察其空间位置和结构特征。pro-domain由一段特定长度的氨基酸序列组成，其折叠方式形成了独特的三维结构。从晶体结构中可以看出，pro-domain与caspase-6的催化结构域和底物结合结构域存在紧密的空间联系。它通过与其他结构域之间的相互作用，在caspase-6的活性调节中发挥着重要作用。pro-domain能够通过分子内相互作用，稳定caspase-6酶原的整体结构，防止其在未接收到凋亡信号时被过早激活。在酶原状态下，pro-domain可能通过与催化结构域的某些氨基酸残基形成氢键、疏水相互作用或静电相互作用，使得催化结构域处于一种相对封闭的构象，活性中心被部分掩盖，从而抑制了caspase-6的酶活性。这种抑制作用对于维持细胞的正常生理状态至关重要，能够避免caspase-6的异常激活导致细胞凋亡的发生。pro-domain还在caspase-6的激活过程中扮演着关键角色。当细胞接收到凋亡信号时，pro-domain会发生一系列的结构变化，这些变化会引发caspase-6分子内的构象重排，进而促进caspase-6的激活。一种可能的机制是，凋亡信号的刺激会导致pro-domain与其他结构域之间的相互作用发生改变，使得pro-domain从原本抑制催化结构域的位置上解离或发生构象变化，从而暴露催化结构域的活性中心，使其能够与底物结合并发挥酶活性。pro-domain还可能通过与其他调节蛋白或信号分子相互作用，参与caspase-6激活信号的传递和放大，确保caspase-6能够在合适的时间和条件下被激活，启动细胞凋亡程序。为了深入探究pro-domain的功能，研究人员进行了大量的实验。通过定点突变技术，对pro-domain中的关键氨基酸残基进行突变，然后观察caspase-6的活性变化和晶体结构改变。当突变某些与催化结构域相互作用的氨基酸残基时，caspase-6的酶原稳定性降低，更容易被激活，这表明这些氨基酸残基在维持pro-domain对催化结构域的抑制作用中起着重要作用。利用蛋白质工程技术，构建缺失pro-domain的caspase-6突变体，发现该突变体在没有凋亡信号刺激的情况下也能表现出较高的酶活性，进一步证实了pro-domain在抑制caspase-6活性方面的关键作用。4.3.2Pro-domain与其他结构域的相互作用pro-domain与caspase-6的其他结构域，如催化结构域和底物结合结构域，存在着复杂而精细的相互作用，这些相互作用对于调控caspase-6的活性至关重要。在酶原状态下，pro-domain与催化结构域之间存在着紧密的相互作用，这种相互作用主要通过氢键、疏水相互作用和静电相互作用来实现。从晶体结构中可以观察到，pro-domain中的某些氨基酸残基与催化结构域中的特定区域形成了稳定的氢键网络，这些氢键的存在有助于维持催化结构域的构象稳定，使其活性中心处于一种相对封闭的状态，从而抑制caspase-6的酶活性。pro-domain中的疏水氨基酸残基与催化结构域中的疏水区域相互作用，形成了疏水核心，进一步增强了两者之间的结合力。静电相互作用也在pro-domain与催化结构域的相互作用中发挥着重要作用，pro-domain和催化结构域中带相反电荷的氨基酸残基之间的静电吸引，有助于稳定它们之间的相互作用。当caspase-6接收到激活信号时，pro-domain与催化结构域之间的相互作用会发生显著变化。这些变化可能是由于激活信号引发的蛋白质构象变化所导致的。激活信号可能会导致pro-domain中的某些氨基酸残基发生磷酸化修饰，从而改变其电荷状态和构象，进而影响pro-domain与催化结构域之间的相互作用。磷酸化修饰可能会破坏原本稳定的氢键网络或静电相互作用，使得pro-domain与催化结构域之间的结合力减弱，导致pro-domain从催化结构域上解离或发生构象变化，从而暴露催化结构域的活性中心，使caspase-6能够被激活。pro-domain与底物结合结构域之间也存在着一定的相互作用，这种相互作用可能会影响caspase-6对底物的结合能力和特异性。pro-domain可能通过与底物结合结构域的相互作用，调节底物结合结构域的构象，从而影响其对底物的识别和结合。在酶原状态下，pro-domain可能会使底物结合结构域处于一种不利于底物结合的构象，降低caspase-6对底物的亲和力。而在激活过程中，pro-domain与底物结合结构域之间的相互作用发生变化，可能会使底物结合结构域的构象发生调整，使其能够更好地与底物结合，提高caspase-6对底物的催化效率。为了深入研究pro-domain与其他结构域的相互作用，研究人员采用了多种技术手段。利用核磁共振（NMR）技术，可以在溶液状态下实时监测pro-domain与其他结构域之间的相互作用动态变化。通过分析NMR谱图中的化学位移、耦合常数等参数，可以获取蛋白质分子中原子之间的距离、角度等信息，从而揭示pro-domain与其他结构域之间的相互作用模式和动态过程。运用分子动力学模拟方法，通过计算机模拟蛋白质分子在溶液中的运动和相互作用，能够从原子层面深入了解pro-domain与其他结构域之间的相互作用机制以及激活信号对这些相互作用的影响。这些研究手段的综合运用，为我们深入理解pro-domain在caspase-6活性调节中的作用机制提供了有力的支持。五、研究成果与展望5.1研究成果总结本研究通过运用晶体结构分析技术，并结合定点突变、小分子配体结合等实验手段，对人类caspase-6的活性调节机制展开了深入探究，取得了一系列具有重要科学价值的研究成果。在caspase-6的自活化机制研究方面，本研究借助高分辨率的晶体结构解析技术，精准地揭示了分子内切割位点190TEVD193在caspase-6自活化过程中的关键作用。晶体结构清晰地显示，切割位点中的天冬氨酸（Asp193）巧妙地插入到caspase-6的活性位点内，与催化残基半胱氨酸（Cys163）紧密相邻，为后续的催化反应创造了极为有利的条件。在自活化过程中，Cys163的巯基对Asp193的羰基碳发起亲核攻击，经过一系列复杂的化学反应，最终实现分子内切割，启动caspase-6的自活化。本研究还发现，L2环长度对caspase-6的自活化效率具有显著影响。通过构建一系列L2环长度不同的caspase-6突变体，并结合晶体结构分析和活性测定实验，明确了L2环长度与自活化效率之间的密切关联。当L2环长度发生改变时，会引起caspase-6分子构象的微妙变化，进而影响分子内切割位点与活性位点之间的相对位置和相互作用，最终导致自活化效率的改变。这一发现为深入理解caspase-6的自活化调控机制提供了新的视角。在caspase-6的磷酸化调控研究中，本研究通过解析模拟磷酸化状态的caspase-6晶体结构，成功确定了其磷酸化位点。研究发现，磷酸化位点主要位于caspase-6分子的特定区域，与活性中心或底物结合位点存在紧密的空间联系。当这些位点发生磷酸化时，会引发周围结构的显著变化，包括局部电荷密度的改变、氢键网络的重塑以及蛋白质二级和三级结构的调整等。这些结构变化通过蛋白质的三维结构网络传递，最终对活性中心构象产生影响，进而改变caspase-6的活性。磷酸化还会通过影响底物结合位点的构象和电荷分布，改变caspase-6与底物的结合亲和力和特异性，从而实现对其活性的调节。本研究还揭示了磷酸化可能通过调节caspase-6与其他调节蛋白的相互作用，间接影响其活性的机制。对于pro-domain在caspase-6活性调节中的作用，本研究通过