CN119497626A 用于cas免疫耐受诱导以支持crispr-cas体内基因编辑的方法和组合物 （联邦高等教育系统匹兹堡大学）

2024.12.30PCT/US2023/0692822023.06.28WO2024/006849EN2024.01.04用于CAS免疫耐受诱导以支持CRISPR-CAS体中诱导对CRISPR_Cas效应多肽的致耐受性免疫a)一种或更多种微粒；b)一种或更多种调节性T含CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段的融该试剂促进可溶解的微针阵列中致耐受性DC分化；和c)CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片2b1)一种或更多种调节性T细胞(Treg)刺激剂，其被封装在所述一种或更多种微粒内；和c1)CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段，或包含CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原c2)CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段，或包含CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原b1)所述一种或更多种调节性T细胞(Treg)刺激剂，其被c1)所述CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段，或包含CRISPR_Cas效应多肽的融合3.根据权利要求2所述的致耐受性组合物，其中所述一种或更多种Treg刺激剂包含4.根据权利要求2或权利要求3所述的致耐受性组合物，其中所述一种或5.根据权利要求2_4中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述一种或更多种Treg刺6.根据权利要求2_5中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述致耐受性组合物包含7.根据权利要求2_6中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述一种或更多种微粒包8.根据权利要求7所述的致耐受性组合物，其中所述至少一种聚合物包含聚乙二醇9.根据权利要求2_6中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述一种或更多种微粒包11.根据权利要求1_10中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述CRISPR_Cas效应多12.根据权利要求1_11中任一项所述的致耐受性组合物，其中所述CRISPR_Cas效应融313.根据权利要求12所述的致耐受性组合物，其中所述一种或更多种异源效应多肽中14.在哺乳动物受试者中诱导对CRISPR_Cas效应多肽的耐受性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求2_13中任一项的致耐受性组合物，从而诱导对所述c2)CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段，或包含CRISPR_Cas效应多肽或免疫原性17.根据权利要求16所述的致耐受性组合物，其中所述可溶解的微针阵列包含：i)基18.根据权利要求17所述的致耐受性组合物，其中所述生物相容性材料包含羧甲基纤19.根据权利要求18所述的致耐受性组合物，其中所述生物相容性材料包含羧甲基纤20.根据权利要求16_18中任一项所述的致耐受从而诱导对所述CRISPR_Cas效应多肽23.根据权利要求14_15或21_22中任一项所述的方法，其中将所述致耐受性组合物重24.根据权利要求23所述的方法，其中以初免_加在施用所述有效量的致耐受性组合物之后，向所述受试者施用包含CRI肽的基因编辑组合物，其中所述致耐受性组合物诱导对所述基因编辑组合物中存在的26.根据权利要求25所述的方法，其中在施用所27.根据权利要求14_15或21_26中任一项所述的方法，其中将所述致耐受性组合物施430.根据权利要求14_15或21_28中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人哺乳动5[0001]本申请要求于2022年6月29日提交的美国临时申请号63/356,932的权益，其通过[0002]本发明在美国国立卫生研究院(NIH)资助的批准号AR074285和美国国防高级研究计划局(DARPA)资助的批准号HR0011_17_2_0043的政府支持下完成。政府对本发明享有一律间隔短回文重复序列(CRISPR)_Cas效应蛋白(例如Cas9)和指导RNA与细胞中的靶核酸接多肽对于哺乳动物宿主(例如人)而言是外来的，并且可Cas效应多肽特异性抗体和/或T细胞可以中和CRISPR_Cas效应多肽和/或杀死包括CRISPR_[0008]图1A_图1C.示意图。图1A单独递送或与佐剂一起递送的抗原可以促进固有性炎6通过腹腔内注射(红色圆圈)或皮下注射(空心方块)用1×107个LPSCas9一Tg脾细胞对Cas9抗原(Cas9)的细胞一起孵育，这些细胞先前用LPS处理激活(+)或未用LPS处理激活Cas9)对C57BL/6小鼠进行预处理。小鼠接受用TiterMaxGold佐剂配制的100μgCas9蛋白用双因素ANOVA结合Tukey多重比较检验进行统计比较。图4B：脾脏中调节性T细胞的百分[0012]图5：致耐受性微针阵列减少Cas9特异性CD4T细胞反应。C57BL/6小鼠未经处理(最左侧)或在第0天、第3天和第6天接受单独的Cas9或含有Cas9(50μg)或BSA(50μg)的MNA内细胞因子染色得到的分泌IFNγ的CD4T细胞的频率(双因素ANOVA结合Tukey多重比较检(佐剂)MNA或通过皮下注射表达Cas9的脾细胞，使小鼠对化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)抗原致敏(免疫)。七天后，在右耳处通过Cas9MNA对小鼠进行攻击(再次暴露于Cas9抗原特异性炎症反应无关的耳厚度的任何增加进行控制。与T一细胞介导的对Cas9的7T细胞介导的对Cas9的DTH反应相关的耳肿胀被报告为耳厚度的变化(Δ)(即Cas9MNA处理的右耳空白MNA处理的左耳)。用Cas9+MC903MNA进行预处理(预防性耐受)减少后续致DLN的细胞总数：(1)CD4+FoxP3+调节性T细胞(Treg)，(2)CD4+T一bet+1型辅助性T细胞分析(图9A)以测量特异性细胞裂解(即Cas9特异比率(免疫小鼠的CFSE形CFSE-比率)]}X100%(图9B)。通过独立t一检验比较致敏组和[0019]图12.用SpCas9+MC903MNA预处理减少致敏和随后的迟发型超敏反应(DTH)反[0020]进行实验以产生减少的对CRISPR一Cas效应多肽(例如Cas9和其他编辑器)的免疫8和/或在编辑器到达将要发生编辑的细胞之前被中和；(ii)使既往已经历编辑程序的患者可见于Krebsetal(Eds.),Lewin’sGenesXII,publishedbyJones&BartlettPublishers,2017；和Meyersetal.(Eds.),TheEncyclopediaofCellBiologyand[0023]尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的9796693..800799和CP014139.1的核苷酸1100046..1104152公开了Cas9核酸，并且登录号AMA70685.1和AKP81606.1公开了Cas9蛋白。在一些实例中，Cas9是Cas9的失活形式(dCas9)，例如核酸酶缺陷型(例如，登录号AKA60242.1和酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶。Caspase是在程序性细胞死亡中发挥重要作用的蛋白酶家段内施用，并且不需要在相同的确切时间点施用将试剂封装在微粒内或使用本文中公开的微针来共同施用多种治疗剂和/或诊计上显著的差异。在一些实例中，差异是相对于对照增加或减少至少约5例如至少约传物质。因此，CRISPR/Cas系统可以用于核酸靶向(例如DNA或RNA)，例如以检测靶DNA或CRISPR_Cas效应多肽是在该系统中裂解核酸的酶。CRISPR_Cas效应多肽包括但不限于用细胞的内源性机制通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)来修复诱导的断裂。在另一个实例中，CRISPR_Cas效应多肽使RNA断裂，例如Cas13d核酸酶(参见例如WO耐受性树突状细胞(DC)可以表达高水平的抑制分子，例如Ig样转录本(ILT)分子(ILT3/胞因子(IL_12p70)和大量抗炎细胞因子(例如IL_10)。致耐受性树突状细胞(DC)通过多种酸或通过蛋白的三级折叠并列的非连续氨基酸[0040]叉头框P3(Foxp3)：调节和协调Treg分化和发挥功能所涉及的分子过程的转录因抑制过度反应的免疫反应而在维持免疫系统稳态方面发挥重要作用(Josefowiczet制Treg抑制功能(Looetal.,Immunity受。致耐受性免疫反应可以包括诱导和/或刺激调节性T细胞(Treg)和/或致耐受性树突状迁移到引流淋巴结，并且通过树突状细胞上的MHCII类_抗原复合物与T细胞上的T细胞受术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合能够刺穿角质层以促进治疗剂的透皮递送的一种或更多种抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(参见，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,TheUniversityoftheSciencesinPhiladelphia,Editor,物中。用于制备可施用组合物的实际方法包括Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,TheUniversityoftheSciencesinPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21stEdition(2005基酸序列区段构成的氨基酸序列。[0052]用于比较的序列比对方法是已知的。各种程序和比对算法描述于：SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.2:482,andLipman,1988,ProcNatlAcadSciUSA85,2444_2448。Altschuletal.,1994,[0053]NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschuletal.,1990,JMolBiol215,403_410)可从多个来源(包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网)用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上的NC常在10_20个氨基酸的短窗口内具有至少80％序列同一性，并且可以具有至少85％或至少在一些实例中，通过亚克隆优化的小鼠全基因组慢病毒CRISPRsgRNA文库(例如过引用以其全文并入本文)。在一些实例中，sgRNA表达盒进一步包含U6启动子和/或指导的表达或分泌进行检测。CD8+T细胞的激活还可以通过响应抗原的细胞溶解活性的增加进括Tr1细胞，其是CD4+FoxP3_IL10+TGFβ1+细胞，参见GregoriandRoncarolo,[0062]在一些实施方案中，一种或更多种Treg刺激剂包含CCL22、视黄酸或血管活性肠肽。在进一步的实施方案中，一种或更多种Treg刺激剂包括IL_2、TGF_β、雷帕霉素一种聚合物包含聚乙二醇(PEG)、聚(氨[0066]在一些实施方案中，CRISPR_Cas效应多肽是II型CRISPR_Cas效应多肽、V型[0073]在进一步的实施方案中，所公开的方法包括在施用有效量的致耐受性组合物之CRISPR_Cas效应多肽是第2类CRISPR效应多肽，在本文中也称为2类CRISPR_Cas效应多肽。效应多肽是VI型CRISPR_Cas效应多肽，例如，Cas13a多肽、Cas13b多肽、Cas13c多肽或GenomeResearchdoi:10.1101/gr.275607.121。适合使用的CRISPR_Cas效应多肽包括CRISPRa多肽。参见，例如，Jensenetal.(2021)GenomeResearchdoi:10.1101/的CRISPR_Cas效应多肽包括切口酶。适合使用的CRISPR_Cas效应多肽包括催化无活性的[0075]在一些情况下，适合包括在本公开的组合物中的CRISPR_Cas效应多肽是Cas9多肽。在一些情况下，Cas9多肽包含与图11A中所示的化脓性链球菌(Streptococcus[0076]在一些情况下，Cas9多肽是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)Cas9中所示的saCas9氨基酸序列(SEQIDNO:2))具有至少85％、至少90％、至少95％、至少被例如丙氨酸取代。例如，HFCas9多肽可以包含与图1A中所示的氨基酸序列具有至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸1135是Val，氨基酸1335是(2018)Science361:1259。Cas9核酸和蛋白序列可公开获得。例如，登录号CP012045.1的核苷酸796693..800799和CP014139.1的核苷酸1100046..1104152公开了中，Cas9是Cas9的失活形式(dCas9)，例如核酸酶缺陷型(例如，GenBankg登录号[0083]在一些情况下，CRISPR_Cas效应多肽是CRISPR_Cas效应融合多肽，其包含：a)CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段；和b)一种或更多种异源多肽(也称为融合配偶[0084]本领域已知与亲本CRISPR_Cas效应多肽相比具有降低的免疫原性的CRISPR_Cas多肽包括野生型CRISPR_Cas效应多肽中与一个或更多个MHCI类和/或MHCII类结合位点与野生型CRISPR_Cas效应多肽相比具[0086]对于受试者的治疗，根据一种或更多种CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段、Remington’sPharmaceuticalSM.A.,JournalofParenteralScienceandTechnology,TechnicalReportNo.10,多种CRISPR_Cas效应多肽或其免疫原性片段或包含CRISPR_Cas效应多肽的一种或更多种融合多肽的延长释放的制剂，在其制剂中通常使用赋形剂和添加剂和/或助剂，例如崩解和方法可与其他系统(例如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)等)一起使用。Cas效应多肽或其免疫原性片段的融合多肽。示例性Treg刺激剂包括C_C趋化因子基序树突状细胞(tDC))亚群使外周初始CD4+T聚合物约7.5μg至约2mg雷帕霉素。合适的剂量还包括但不限于每mg聚合物约10μg雷帕霉药物的组合可以被封装在由亲水性较高的PLGA和疏水性聚合物(例如PLA)的共混物制备的在水中的溶解度、用于制备微粒的聚合物链的分子量(MW范围可以从～1000Da至超过100,期望时间段内变化不超过约20更通常不超过约10％。比较理想的是在系统的整个使用从1pg/ml至200μg/ml(例如1μg/ml至5μg/ml)的局部浓度。特别的非限制性实施方案为约10ng/mlIL一2、约5ng/mlTGF一β1和约10ng/ml雷帕霉素(参见Jhunjhunwalaetal.,期望的释放速率和靶药物浓度可以根据所选的特定试持续少于约一个月。微针阵列[0119]促进致耐受性DC分化的其他合适试剂包括但不限于视黄酸、地塞米松、IL_10和选的另外的试剂。案中，利用制造技术将各种活性组分并入针尖端，参见美国专利申请公开号US_2016_剩余部分包括成本较低的非活性且通常被认为是安全的基质材料。基于(1)减少并入微针阵列的非针部分中不可递送的活性组分的浪费，并且(2)穿透皮肤的针尖端中药物浓度更[0125]所公开的致耐受性组合物还可以如PCT申请号PCT/US2016/057363(其通过引用并递送和控制微针阵列的成本，每个微针可以具有含片段或融合多肽。[0129]可生物降解的固体(solid)微针的结构基质最常见包括基于聚(乳酸_共_乙醇酸)135摄氏度或更高)以及真空和/或有机溶剂，基于PLGA的装置可能限制药物递送和蛋白递送应用。相反地，基于CMC的基质可以在室温下通过简单的旋铸和干燥工艺形成，这使得应多肽或其免疫原性片段的融合多肽。[0131]CMC水凝胶可以由低粘度CMC钠盐在无菌dH2O中在有或没有活性组分(如下所述)微气泡。可以通过将水凝胶的一部分(10g)在85摄氏度下干燥约72小时来测试水凝胶的干或包含CRISPRCas效应多肽或其免疫原性片段的融合多肽)和可选的另一种试剂(例如维的脱水CMC微针阵列通常在室温或稍低的温度下(例如约4摄氏度)稳定，并且保留加入的具可以清洗并重复用于后续铸造微针阵列。[0134]在一些实施方案中，CMC一固体可以用不含活性组分的层和含有活性组分的层形状的CMC固体(PCT申请号PCT/US2016/057363的图11A和图11B)和上层上嵌入的活性负载[0139]在一些情况下，微针阵列的支撑结构是面积通常为约50mm2至150mm2(例如约Cas效应多肽或其免疫原性片段的融合多肽。该方法通常涉及向有需要的受试者施用有效[0144]适合用本公开的方法治疗的受试者包括需要基因疗法的受试者或将被施用基因本方法处理的哺乳动物物种包括犬科动物(canines)和猫科动物(felines)；马科动物本文所述的测定或本领域技术人员已知的其他测定所确定的)使受试者中的Treg数量增加导能力。可以使用本领域已知的各种测定来评估本文所述的致耐受性DC是否诱导免疫耐情况下，致耐受性组合物减少CD4+反应性T细胞的数量(即与CRISPR_Cas效应多肽反应的耐受性组合物增加CD4+Treg的数量和/或活性，这进而减少CD4+反应性T细胞和/或CD8+T反死因子_α(TNF_α)和白介素_2(IL_2))的产生来识别激活的T细胞。在一些情况下，通过定Treg细胞的数量来评价免疫反应，例如通过荧光激活细胞分选来检测CD4、CD25和/或Cas多肽、V型CRISPR_Cas多肽、VI型CRISPR_Cas多肽、CRISPRi多肽、CRISPRa多肽、情况下，适合包括在基因编辑组合物中的CRISPR_Cas效应多肽包括催化无活性的CRISPR_[0154]主治医师或其他有资格的医务人员可以基于各种临床因素确定所公开的致耐受[0156]本公开的致耐受性组合物的施用频率可以根据多种因素(例如症状的严重程度施用方法如上所列。肽的基因编辑组合物。试剂盒可以包括致耐受性组合物诱导对基因编辑组合物中存在的方案中，容器可以具有接入口(例如容器可以是静[0165]使用CRISPR_Cas9系统进行基因编辑对于治疗各种人疾病具有巨大潜力。用于缺失或插入基因的Cas9核酸酶源自人常见暴露的细菌(例如化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌(S.aureus))。因此，大部分人群已经对这些Cas9蛋白具有预先存在的体液免疫和细胞免疫，这对于安全且有效的体内基因编辑而言是潜在的障碍(参见Charlesworthetal.,NatureMedicine,2019)。具体地，Cas9特异性记忆T细胞可以攻击并杀死患者的被递送性维生素D3类似物(MC903)一起递送。通过可溶解的微针阵列(MNA)实现递送至皮肤微环[0167]建立两种稳健的免疫方案和离体再刺激方案来测量C57BL/6小鼠中的SpCas9特异用500ng/mL脂多糖(LPS)激活过夜。将这些脾细胞注射至初始(naive)C57BL/6小鼠体内两体外再刺激。在胁腹处接受免疫的动物中观察到对Cas9具有统计学显著性的回忆反应(图[0169]为了引发SpCas9特异性CD4T细胞，用TiterMaxTMGold佐剂配制的SpCas9蛋白对增，最终提供对抗原特异性攻击的系统耐受。如图4B所示，在施用Cas9与含有雷帕霉素、且在此一周后使用细胞因子珠阵列对脾细胞进行测试，以定量培养物中产生的IFN共同递送可以扩增Treg并且消除Cas9效应T[0172]致耐受性微针的结果：耐受诱导的第二种方法涉及应用含有Cas9或对照蛋白BSA的致耐受性微针阵列(MNA)。小鼠接受三次MNA应用。一周后，在不同部[0174]可以在用CRISPR_Cas9系统进行体内基因编辑之前施用TRIMP+Cas9一次或更多别是脾细胞)，使小鼠对化脓性链球菌Cas9(SpCas9)抗原致敏(免疫)。七天后，通过Cas9将空白(空)MNA应用于对侧耳，以对与Cas9抗原特[0176]在用Cas9+PolyICMNA致敏(免疫)之前，通过三次连续应用Cas9+MC903MNA(第0对Cas9抗原致敏(免疫)。七天后，通过Cas9MNA在右耳对小鼠进行攻击(再暴露于Cas9抗导)相关的耳肿胀报告为耳厚度的变化(△)(即Cas9MNA处理的右耳–空白MNA处理的左MC903MNA(预防性耐受)进行预处理预防/减少了后胞反应，并且在致敏之前用Cas9+MC903MNA进行预处理显著减少Th1群体并增加Treg/Th1型中，首先通过应用Cas9+Poly(I:C)MNA或皮下注射表达Cas9的脾细胞使小鼠对化脓性链Cas9的脾细胞)的混合物以测量特异性细胞