CN119497750A 产生小胶质细胞的方法和组合物 （哈佛学院院长及董事）

2024.12.20PCT/US2023/0660232023.04.20WO2023/205743EN2023.10.26本文提供了通过过表达转录因子(如SPI1、多能干细胞分化为小胶质细胞样细胞的方法和22.根据权利要求1所述的PSC，其中，所述一个所述FLI1蛋白的第二开放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第三开放阅3.根据权利要求1所述的PSC，其中，所述放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第三开放阅4.根据权利要求1所述的PSC，其中，所述一个以上经加工放阅读框和编码所述FLI1蛋白的第三开放阅8.根据权利要求7所述的PSC，其中，所述一个以9.根据权利要求7所述的PSC，其中，所述一个以放阅读框和编码所述CEBPB蛋白的第三开放阅第二多顺反子多核苷酸，其5'至3'任选地包含：编码所述MEF2C蛋白的第一开放阅读322.根据权利要求21所述的方法，其中，所述扩增群的码所述FLI1蛋白的第二开放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第三开开放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第26.根据上述权利要求之任一项所述的方法，其还包括在扩增群的PSC中表达MEF2C蛋28.根据上述权利要求之任一项所述的方法，其还包括在扩增群的PSC中表达MEF2C蛋30.根据上述权利要求之任一项所述的方法，其还包括在扩增群的PSC中表达MEF2C蛋4第二多顺反子多核苷酸，其5'至3'任选地包含：编码所述MEF2C蛋白的第一开放阅读37.根据上述权利要求之任一项所述的方法，其中，所述PSC群包含1x102～1x107个样细胞是TRA_1_60_和/或POU_60_和/或POU5F1_小可操作地连接到编码SPI1蛋白、CEBPA蛋白和FLI1蛋白的一个以上开放阅读框的诱导型启_60_和/或POU5F1_小可操作地连接到编码SPI1蛋白、CEBPA蛋白和FLI1蛋白的一个以上开放阅读框的诱导型启CEBPB蛋白和/或IRF8蛋白的一个以上开放阅读框的5第一诱导型启动子可操作地连接到编码SPI1的开放阅读框、编码CEBPA的开放阅读框和编45.根据权利要求42～44之任一项所述的方法，其中，第一和46.根据权利要求42～45之任一项所述的方法，其中，第一和/包含从Engelbreth_Holm_Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取48.根据权利要求47所述的方法，其中，溶解的基底膜制备物包还包含选自重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)和重组人转化生长因子β(rhTGFβ)54.根据权利要求42～53之任一项所述的方法，6[0002]本申请根据2022年4月22日提交的美国临时申请第63/333,573号第35卷第119(e)[0006]本发明是在政府支持下HG008525由美国国立卫生研究院(NIH)授予的。政府对这短的时间内将hiPSC分化为小胶质细胞。将干细胞分化为人细胞类型的能力是定义基本机小胶质细胞样细胞。TF诱导的小胶质细胞的表征表明与原代小胶质细胞的分子和功能相的第二开放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第三开放7述第一多顺反子多核苷酸按所述第一多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放述第一多顺反子多核苷酸按所述第一多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放述第二多顺反子多核苷酸按所述第二多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放述第二多顺反子多核苷酸按所述第二多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放8的第二开放阅读框和编码所述CEBPA蛋白的第三开放述第一多顺反子多核苷酸按所述第一多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放述第一多顺反子多核苷酸按所述第一多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开放[0042]在一些实施方案中，一个以上经加工的多核苷酸还包含所述第二多顺反子多核苷酸按所述第二多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开[0043]在一些实施方案中，一个以上经加工的多核苷酸还包含所述第二多顺反子多核苷酸按所述第二多顺反子多核苷酸的5'至3'方向排序包含以下开9_还包含可操作地连接到编码MEF2C蛋白、CEBPB蛋白和/或IRF8蛋白的一个以上开放阅读框_60_和/或POU5F1_小胶质细胞样细胞。还包含可操作地连接到编码MEF2C蛋白、CEBPB蛋白和/或IRF8蛋白的一个以上开放阅读框_1_60_和/或POU5F1_小胶质细胞样细胞。[0057]在一些实施方案中，(b)的无饲养层、无血清的培养基包含从Engelbreth_Holm_维细胞生长因子(rhbFGF)和重组人转化生长因子β(rhT[0061]在一些实施方案中，(c)的扩增群的PSC以约20,000个细胞/cm2～约60,000个细胶质细胞(ITGAM、CX3CR1、TMEM119、P2RY12、TREM2)和添加了干细胞的(POU5F1)基因在现3+XTF筛选。(图2C)来自多顺反子盒(SPI1、FLI1、CEBPA)和干细胞(POU5F1)的标准化RNA_seq测量的6种诱导的TF随时间的表达。(图3B)通过大量RNA_seq测量干细胞(POU5F1)表达的流式细胞术定量(n＝3)。(图3F)流式细胞术分析了pHrodo标记的金黄色葡萄球菌研究疾病机制和测试药物。最近全球建立HCA的努力不仅增加了有关人发育和疾病的更多[0074]本文提供的数据证明了使用迭代遗传库筛选和高通量scRNA_seq进行细胞命运加是中枢神经系统(CNS)中的先天免疫细胞，在大脑中具有所有哺乳动物器官中粒单核细胞细胞以平铺状模式占据CNS的所有区域。因为整个成年哺乳动物的大脑都被小胶质细胞占细胞的520％。它们在灰质中比在白质中更丰富，且CNS的系统发育较新区域(大脑皮质细胞通常对TRA_1_60和/或POU5F1呈阴性(即，它们不表达可检测水平的TRA_1_60和/或和/或TREM2+小胶质细胞样细胞和/或TRA_1_60_和/或__细胞可能是CD11b+。在一些实施方案中，一个小胶质细胞样细胞群的约50约80％的细~约70％的细胞可能是CD11b+。例如，一个小胶质细胞样细胞群中约70约95％、约75约95％或约80约95％的胞群中约5约20％、约10约20％或约15约20％的细胞可能是CX3CR1+。胞(ESC)、由体细胞核移植(ntESC)制造的胚胎干细胞和来自未受精卵的胚胎干细胞(孤雌表达导致在诱导表达转录因子后第4天细胞群中66％是CD11b+，93％是P2RY12+，16％是核酸包括那些经过化学修饰或以其他方式修饰，但可以与天然存在的核酸分子碱基配对[0098]经加工的多核苷酸可以包含DNA(例如基因组DNA、cDNA或基因组DNA和cDNA的组中从单链RNA(例如信使RNA(mRN[0100]本公开的经加工的多核苷酸可以使用标准分子生物学方法产生(例如参见GreenandSambrook,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2012,ColdSpringHarborPress)。在一些实施方案中，核酸是使用GIBSONCloning产生的(例如参见的间隙。然后DNA连接酶密封缺口并将DNA片段共价连接在一起。相邻片段的重叠序列比[0101]在一些实施方案中，经加工的多核苷酸包含可操作地连接到开放阅读框的启动用于根据本公开的诱导型促进剂包括本文中描述的或本领域普通技术人员已知的任何诱体、人雌激素受体、飞蛾蜕皮激素受体和类固醇/类维生素A/甲状腺25受体超家族的启动人工染色体。基于转座子的系统，例如piggyBacTM系统(例如，Chen等人，Nature登录号P17947)的开放阅读框的经加工的多核苷酸编码[0107]MLQACKMEGFPLVPPPSEDLVP[0108]EFESFAENNFTELQSVQPPQL[0109]YPSLSPAQPSSDEEEGERQSP[0110]RSGDMKDSIWWVDKDKGTFQFSSKHKEALAHRWGIQKGNRKKMTYQKMAR[0111]在一些实施方案中，编码包含编码CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPA)(例如，UniprotKBAccessionNo.P49715)的开放阅读框的经加工的多核苷酸编码包含以下序列[0113]在一些实施方案中，编码包含编码Friend白血病整合1转录因子(FLI1)(例如，UniprotKB登录号Q01543)的开放阅读框的经加工的多核苷酸编如，UniprotKB登录号Q06413)的开放阅读框的经加工的多核苷酸编码包含以下序列的蛋[0117]在一些实施方案中，编码包含编码CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPB)(例如，UniprotKB登录号P17676)的开放阅读框的经加工的多核苷酸编[0119]在一些实施方案中，编码包含编码干扰素调节因子8(IRF8)的开放阅读框的经加[0121]递送至PSC的经加工的多核苷酸的拷贝数可能会有所不同。在一些实施方案中，序列中较小者之间相同匹配百分比的指标，这些序列具有由特定数学模型或计算机程序特定多核苷酸或多肽的变体与本文描述的和本领域技术人员已知的序列与该特定野生型、al.NucleicAcidsRes.1997；25:3389_3402)；以及基于Smith_Waterman算法的算法他最优全局比对方法(包括Needleman_Wunsch算法)更快地生成核苷酸和蛋白序列的全局从而提供截短序列。多核苷酸包含编码MEF2C的开放阅读框、编码CEBPB的开放阅读框和编码IRF8的开放阅读能干细胞(PSC)群以产生扩增群的PSC；并在扩增群的PSC中表达从SPI1、CEBPA、FLI1、经加工的多核苷酸包含编码IRF8的开放[0137]在一些实施方案中，经加工的多核苷酸的开放阅读框可操作地连接到异源启动102[0141]本公开的一些方法提供了包括(a)向PSC递送一个以上经加工的多核苷酸的方法，_60_和/或POU5F1_小胶质细[0149]本公开的经加工的多核苷酸可以使用任何一种或多种转染方法递送到PSC，包括充当DNA复制的起点并作为初级包装信号(McLaughlin，SKetal.Virol.1988；62(6):链和负链都同样很好地包装成病毒粒子且能够感染(Zhong,Letal.MolTher.2008；16(2):290_5；Zhou,Xetal.MolTher.200半(McCarty,DMetal.MolTher.2008；16(10):1648_56；McCarty,DMetal.Gene 酶识别位于转座子载体两端的转座子特异性倒置末端重复序列(ITR)，并有效地将内容物从原始位点移动并整合到TTAA染色体位点。piggyBacTM转座子系统有助于将多核苷酸高效 胶基质)中提取的溶解的基底膜制备物(包被在～75μl/cm2～150μl/cm2的基于批的稀释悬[0162]本公开在一些实施方案中提供包含本文产生的小胶质细胞样细胞的治疗组合[0165]脊髓损伤(SCI)患者可能受益于这些细胞的使用。小胶质细胞样细胞从iPSC分化引用的所有出版物均出于本公开中引用的目的或供人体内细胞类型和细胞状态的全面视图。这样的图谱对于了解人发育和疾病至关重要。(TFome)，并鉴定出290种诱导人诱导型多能干细胞(hiPSC)分化为各种细胞类型的转录因在4天内产生转录类似于小胶质细胞的细胞。这些TF诱导的小胶质细胞样细胞(TFiMGL)具类型的225个样本的公开可用的scRNA_seq数据集使研究人员能够更有效地选择TF来生成新的iPSC[0172]为了鉴定将hiPSC分化为小胶质细胞的TF，总体策略是首先转染并将一组TF随机据基因表达鉴定出在分化为小胶质细胞的细胞中富集的TF。将40个候选TF克隆到pBAN2载个TF载体转染到来自健康供体(PGP1)的600,000个hiPSC中，TF与转座酶DNA的质量比为4:4天(图1A)。流式细胞术分析显示，0.3～0.5％的细胞表达小胶质细胞表面蛋白，包括[0173]为了确定40个TF中的哪一个诱导了小胶质细胞基因表达，对scRNA_seq的所有分化细胞进行了分选(图1A)。分化4天后，30％的细胞失道与RUNX140和SPI141相互作用，其中这两种TF对于组织驻留巨噬细胞发育都是必不可少需要严格控制它们的表达水平。单独的SPI1仅诱导约3％的CD11b阳性细胞(数据未显示)，细胞活化和迁移很重要的趋化因子受体(43,44)。由于三种质粒的混合转染和PiggyBac整表达盒。基因在盒中的位置会影响它们的相对表达水平，第一个基因最高(Liu，Z.et总体低百分比表明需要额外的TF来驱动小胶质细胞[0176]为了建立来自第一个合并筛选的匹配并识别更多可以促进对来自第一次迭代的前三个TF(3+X)进行了第二次合并筛选(图2A)。第二个TF库总共包含42个候选TF。为确保每个细胞同时接收来自第二个库的SPI1_T2A_FLI1_P2A_CEBPA和其他[0178]为了验证额外的TF可以促进小胶质细胞基因表达，它们用SFC(SFC+1)单独表更多的细胞死亡。MEF2C和IRF8将P2RY12表达从6％增加到45％左右(图2H)。最重要的是，MEF2C和KLF6将CX3CR1+细胞从零增加到20％和2％(图2了测试是否可以通过向每个细胞输送更多的TF来进一步促进小胶质细胞分化，我们将六_TF混合物产生的细胞库都增加了小胶质细胞蛋白的表达(图2J)。最好的混合物是MG6.4_SCF_MCI，在第4天含有66％CD11b+、93％P2RY12+和16％CX3CR1+细胞，而对于代TF筛选在细胞命运加工中的效用。小胶质细胞对与退化神经元和吞噬细胞相关的信号做出反应的能力是其功能不可或缺的质细胞和iPSC衍生的小胶质细胞的大量RNA_seq数据(Abud,E.M.etal.Neuron94,278_293.e9(2017)；Gosselin,D.etal.Science356,(2017)；Galatro,T.F.et的MSigDB中的两个小胶质细胞基因集合，在第4天进行MG6.4对比iPSC基因集富集分析小胶质细胞的基因(图4B)。使用881个富含小胶质细胞的基因集合(Gosselin，D.et式三份处理24小时，并收获用于RNA_seq。PCA分析显示IFNγ和TDP_43处理组的转录组变[0185]使用一组细胞标志物来确定细胞类型是原代人体组织和干细胞分化研究中的常运加工工作，目前仅部分满足几个先决条件：(1)存在来自所有人体组织类型的单细胞数包含来自59种器官/组织类型的225个样本，总共1,004,650个单细胞(数据未显示)。从PanglaoDB下载的所有原始数据在Seurat中对细胞、基因、UMI数量和线粒体基因比率进行项研究中获得细胞水平的注释可能是未来研究改进该图谱的工作。为了减少不同研究导致示)。整合后UMAP图的定性评估确实表明来自不同研究的相关组织中细胞的共聚集，例如来，使用CSS或Symphony60将来自两个合并TF筛选的scRNA_seq数据映射到集成的图谱上 有可能的原代组织类型相似(数据未显示)。的基因表达特征最多。尽管第一次合并筛选期间在scRNA_seq之前去除了带有干细胞标志示)，这是意料之中的，因为大多数细胞已经与第一次迭代的前三个匹配(SPI1、FLI1、和KpnI消化原始pBAN，然后连接包含相同切下片段的gBlock(IDTDNA)和额外的20bp随机[0192]hiPSC在涂有Matrigel(Corning，354277)或Cultrex(Bio_TechneC3434_005_02)的多孔板上在mTeSRPlus培养基(StemcellTechnologies，100_0276)中培导TF表达，将细胞接种到含有0.5μg/mL多西环素(Sigma_Aldrich，D3072)和10μMY_27632ROCK抑制剂的mTeSRPlus培养基中，并在24小时后更换到仅含有多西环素的培养基分选。本研究中使用的流式细胞术抗体是：FITC_TRA_1_60(BDBiosciences，560380)、BV421_CX3CR1(Biolegend，341620)、PE_P2RY12(Biolegend，392104)、APC_CD11bLQ5热启动高保真2×预混液、10μLPCR1产物、[0204]对于scRNA_seq，原始FASTQ文件与GRCh38比对，并使用CellRanger进行定量。程中从cDNA中扩增的，因此我们使用每个细胞中检测到的总RNAUMI的数量对TF条码计数用Direct_zolRNAMiniPrep试剂盒(ZymoResearch，R2050)纯化总RNA。使用QubitRNA脂糖凝胶(ThermoFisherScientific，G402002)上存在18S和28S条带来确认RNA完整性。使用NEBNextPoly(A)mRNA磁性分离模块(NewEnglandBiolabs，E7490)使用100ng~1000ng总RNA作为mRNA富集的起始量，然后按照制造商的说明使用NEBNextUltraII定向RNA库制备试剂盒(NewEnglandBiolabs，E7760S)构建库。哈佛医学院的Biopolymers[0208]或内部生成的样本和从GEO下载的数据集，原始FASTQ文件与GRCh38比对并使用(ElectronMicroscopySciences，15710)在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(ThermoFishermLpHrodo绿金黄色葡萄球菌(S.aureus)BioParticles(ThermoFisherScientific，余的染色细胞转移到μ板96孔Black板中进行荧光显微镜检查，以确认颗粒的细胞内定位。[0216]根据制造商的说明，使用SensoLyte硫黄素Tβ_淀粉样蛋白(1～42)聚集试剂盒[0217]包含不同人体组织的10×GenomicsChromiumscRNA_seq数据的原始计数的文件从PanglaoDB(https://panglaodb.se/index.html)下载。从类器官报告卡(https://线粒体基因百分比使用不同的过滤器进行手动细胞过滤。通过检查使用了哪些组织/细胞[0219]使用CSS或Harmony/Symphony进行数据集成和映射是按照GitHub上作者的指示进行的(/quadbiolab/simspec；/[0220]此处披露的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用