CN119506434A 基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法 （河北科技大学）

基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多本发明公开了一种基于eDNA监测河流大型样点位的设计及地理位置、水样的采集和预处22.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其3.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其4.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其3_3_2_5.根据权利要求3所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其特征在于：步骤四中eDNA的提取即将步骤二_80℃保存的滤膜取出解冻，使用6.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化使用7.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其8.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其39.根据权利要求1所述的一种基于eDNA监测河流大型底栖无脊椎动物多样性方法，其45水样分别用于检测生物和理化指标的测定，采样的位置生成滤膜后送回实验室置于_80℃33_2_[0015]优选地，步骤四中eDNA的提取即将步骤二_80℃保存的滤膜取出解冻，使用[0017]优选地，步骤四中高通量测序使用NEXTFLEX8RapidDNA_SeqKit进行扩增后[0018]优选地，步骤五中生物信息学分析包括数据优化和OTU聚类，数据优化即使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接；OTU聚类即使用UPARSE软[0022]利用eDNA技术检测河流干流及一级支流在不同季节下的大型底栖无脊椎动物生6[0031]图9为本发明实施例不同季节大型底栖无脊椎动物群落结构与环境因子的Mantel5.55km273_3_2_8[0054]将_80℃保存的滤膜取出解冻，使用FastDNA8SpinKitforSoil试剂盒(MP冲液到LysingMatrixE管中；2)使用MP研磨仪以6m/s速度震荡40s；3)以14000rpm离心10min；4)将上清液转移至1.5mL离心管，加入250μLPPS并充分混匀；5)在室温下以TMFilter[0057]利用通用引物对滦河流域的大型底栖无脊椎动物进行PCR扩增，通用引物序列参9[0062]使用NEXTFLEX8RapidDNA_SeqKit进行扩增后的DNA的文库构建，步骤如下：[0063]利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序(由上海美吉生物医药科技有限生成DNA簇；5)线性化扩增子成为单链DNA；6)引入改造的DNA聚合酶和标记有四种荧光的开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的碱基，去除含N碱基的碱基；2)利用成对末端的重叠区域允许的最大错配率为20筛选不符合序列；4)根据序列两端的条形码和引物[0070]3)对非重复序列进行97％相似度的OTU聚类，同时排除潜在的嵌合体序列，得到[0072]为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDPclassifier贝叶斯算法对97%[0075]1)香农指数(ShannonIndex)，也称为香农多样性指数(ShannonDiversity[0081]2)辛普森指数(SimpsonIndex)也是用来衡量群落多样性的指标，但它更侧重于描述物种的优势度。辛普森指数衡量的是在一个随机抽样中两个个体属于同一种类的概[0087]3)本文利用chao1用来估计样本中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来本间的分布差异可通过统计学中的距离度量进行量化。通过计算两两样本间的统计距离，[0116]3)非度量多维尺度分析(Non_metricmultidimensionalscaling，NMDS)是一种[0122]3)物种组成和群落分析：使用Circos_0.67_7软件(http://circos.ca/)绘制[0124]5)β多样性分析：使用Qiime软件(版本号1.9.1，/install/313bp。大型底栖无脊椎动物(OTUs)的稀疏曲线如图3所示，随着抽取的数据量越多，[0131]对滦河流域采集的大型底栖无脊椎动物样本进行分类单元统计，聚类方式采用集到117个大型底栖无脊椎动物分类单元。基于传统调查方法在2020年期间共采集到底栖[0136]对大型底栖无脊椎动物在不同门水平下的分类单元统计，见表5。11个门共包含(Annelida)占比4.04线虫动物门(Nematoda)占比3.33扁形动物门(Platyhelminthes)占比1.11其余5种大型底栖无脊椎动物门的物种量占比均小占比最高，为45.53其次为秋季，占比16.02春季占比14.56冬季占比最低，为门(Mollusca)，在冬季占比13.95春季占比10.25秋季占比3.72夏季占比小于本次滦河流域大型底栖无脊椎动物调查到的优势目，与的研究结果相吻合。膜翅目的序列总数占比最高，分别为20.82％、16.31在其他季节占比均不足1％。鳞翅目(Lepidoptera)在冬季的序列总数占比最高，为9.61在夏季的序列总数占比最低，为(Demospongiae)仅在冬季相对丰度蚊科(Chironomidae)和软体动物门双壳纲厚唇螺科(Pachychilidae)为本次滦河流域大型(Pachychilidae)在夏季有明显的丰度优势，在冬季相对丰度最低；多孔动物门Phloeodictyidae科、环节动物门多毛纲小头虫科(Capitellidae)和节肢动物门昆虫纲脉翅目草蛉科(Chrysopidae)在冬季的相对型底栖无脊椎动物群落覆盖率高达1，这表明本次测序结果能够较为准确地反映样本中大[0153]通过组间差异检验探究不同季节大型底栖无脊椎动物α多样性指数的差异性，本次选用的度量标准有Shannon、Simpson、Pielou和Chao1。组间差异显著性检验使用[0154]在时间上，不同季节之间的Chao1指数具有极显著差异(p<0.001)，Shannon、显著高于秋季(p<0.05)。Chao1组间差异图展示了夏季的物种丰富度极显著高于春季和秋[0156]大型底栖无脊椎动物的生物多样性和群落结构受到季节夏季和秋季。夏季和冬季之间的高差异性解释度反映了这两个季节环境条件变化的极端矩阵和环境因子矩阵均使用Bray_Curits距离算法，环境因子相关系数类型选择Spearman图代表环境因子之间相关性；线条粗细：底栖动物群落与环境因子之间相关性大小，取_和ORP是影响大型底栖无脊椎动物群落结构的关键环3___3_2___3_2__[0169]由图10可知，不同底栖无脊椎动物科对环境因子的偏好和耐受性存在显著差_3COD是衡量河流水体污染浓度大小的重要指标，表明这些底栖无脊椎动物对水体的污染较为敏感，受到污染物的影响较为强烈。优势物种与环境因子的关系：厚唇螺科(Pachychilidae)与WT具有极显著正相关性，反映了其对温暖水域的偏好；__下能更好地利用水体中的营养物质。特定物种与环境因子的关系：滑刃科__3_[0171]大型底栖无脊椎动物群落在不同季节中展示出了相同的距离衰减变化(Distance1标记共获得1419个OTUs，隶属于11门30纲83目319科729属990种。节肢动物门[0175]2)在滦河流域大型底栖无脊椎动物的物种序列相对丰度分析中，节肢动物门栖无脊椎动物调查到的优势目，昆虫纲(Insecta)和腹足纲(Gastropoda)作为本次调查到[0177]4)在大型底栖无脊椎动物群落的β多样性分析中，不同季节的大型底栖无脊椎动_