基于高通量测序剖析东农冬麦1号越冬期microRNA的表达调控机制

基于高通量测序剖析东农冬麦1号越冬期microRNA的表达调控机制一、引言1.1研究背景与目的冬小麦作为我国重要的粮食作物之一，在农业生产中占据着举足轻重的地位。其产量和品质直接关系到我国的粮食安全和农业经济的稳定发展。然而，我国北方地区冬季气候严寒，低温成为限制冬小麦种植和产量提升的关键因素。在低温环境下，冬小麦不仅生长发育受到抑制，严重时甚至会遭受冻害导致死亡，这给农业生产带来了巨大的损失。因此，培育具有优良抗寒性能的冬小麦品种，深入探究其抗寒机制，对于提高北方地区冬小麦的产量和品质，保障粮食安全具有重要意义。东农冬麦1号是东北农业大学历经多年培育而成的冬小麦品种，具有突出的抗寒性能和较高的产量。在黑龙江省等高寒地区，该品种能够在冬季低温条件下安全越冬，为解决北方地区冬小麦种植难题提供了有力的支持。目前，虽然对东农冬麦1号的抗寒性已有一定研究，但其具体的抗寒分子机制仍有待深入挖掘。MicroRNA（miRNA）是一类内源性非编码小RNA，长度约为20-24个核苷酸。在植物中，miRNA通过与靶mRNA互补配对，在转录后水平对基因表达进行精准调控，从而广泛参与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等诸多过程。研究表明，miRNA在植物应对低温胁迫过程中发挥着至关重要的作用，它们能够通过调控相关基因的表达，参与植物的抗寒信号传导通路，调节植物体内的生理生化反应，进而增强植物的抗寒能力。本研究以东农冬麦1号为研究对象，旨在通过高通量测序技术全面解析其越冬期间miRNA的表达谱，并运用生物信息学方法对测序数据进行深入分析，挖掘与抗寒相关的miRNA及其靶基因，揭示miRNA在东农冬麦1号抗寒过程中的调控机制。这不仅有助于从分子层面深入理解东农冬麦1号的抗寒机理，为冬小麦抗寒育种提供坚实的理论依据，而且对于指导北方地区冬小麦的安全生产，提高冬小麦的产量和品质具有重要的实践意义。1.2冬小麦抗寒机理研究进展冬小麦的抗寒机理是一个复杂且多层面的生物学过程，涉及形态结构、生理生化以及分子调控等多个方面。深入探究这些机理，对于理解冬小麦如何应对低温胁迫，提高其抗寒能力具有重要意义。在形态结构方面，冬小麦在长期进化过程中形成了一系列适应低温环境的特征。分蘖节作为冬小麦的重要结构，对其抗寒性起着关键作用。分蘖节位于植株地下部，是未伸长的节间、节和腋芽等紧缩在一起的节群，富含糖分等营养物质。在低温条件下，分蘖节能够积累大量的可溶性糖，降低细胞内的水势，从而减少细胞结冰的可能性，保护植株免受冻害。此外，冬小麦的根系发育状况也与抗寒性密切相关。研究表明，抗寒性强的冬小麦品种通常具有更为发达的根系，能够更好地吸收土壤中的水分和养分，增强植株的抗逆能力。生理生化层面，低温诱导蛋白在冬小麦抗寒过程中发挥着重要作用。这些蛋白包括冷调节蛋白（COR）、脱水素（DHN）等。冷调节蛋白能够在低温胁迫下迅速表达，通过调节细胞的生理功能，如稳定细胞膜结构、调节细胞渗透压等，提高冬小麦的抗寒能力。脱水素则具有高度的亲水性，能够与细胞内的水分子结合，防止细胞因脱水而受损。渗透调节物质也是冬小麦应对低温胁迫的重要物质。当冬小麦遭受低温时，细胞内会积累脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等渗透调节物质。这些物质能够降低细胞的渗透势，促进细胞吸水，维持细胞的膨压，从而保证细胞的正常生理功能。例如，脯氨酸不仅可以作为渗透调节物质，还能够清除细胞内的活性氧，减轻氧化损伤。抗氧化酶系统在冬小麦抗寒过程中也起着不可或缺的作用。在低温胁迫下，冬小麦体内会产生大量的活性氧（ROS），如超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）等。这些活性氧会对细胞造成氧化损伤，影响细胞的正常功能。为了应对这种氧化胁迫，冬小麦体内的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等会被激活。SOD能够将超氧阴离子歧化为过氧化氢和氧气，POD和CAT则可以将过氧化氢分解为水和氧气，从而有效地清除细胞内的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。从分子层面来看，众多抗寒相关基因参与了冬小麦的抗寒调控过程。其中，CBF（C-repeatbindingfactor）转录因子是研究较为深入的一类抗寒相关基因。当冬小麦感知到低温信号后，CBF基因会迅速表达，进而调控一系列下游冷响应基因（COR）的表达，增强冬小麦的抗寒性。此外，一些转录因子，如MYB、bZIP等，也通过与抗寒相关基因的启动子区域结合，调节基因的表达，参与冬小麦的抗寒调控。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的抗寒相关基因被发现和研究，为深入揭示冬小麦的抗寒分子机制提供了丰富的信息。1.3植物抗逆microRNA的研究进展植物microRNA（miRNA）的生物合成是一个复杂且精细调控的过程，涉及多个关键步骤和多种酶的参与。miRNA基因首先在细胞核中由RNA聚合酶II转录生成初级miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA通常具有复杂的二级结构，长度可达数千碱基。随后，pri-miRNA在Dicer-like1（DCL1）、HYL1、SE等蛋白组成的复合物作用下，被加工成约70-80个核苷酸的茎环结构前体miRNA（pre-miRNA）。DCL1作为关键的核酸内切酶，能够精确识别pri-miRNA的茎环结构，并在特定位置进行切割，产生pre-miRNA。HYL1和SE则起到辅助作用，稳定DCL1与pri-miRNA的相互作用，促进切割反应的进行。pre-miRNA进一步被DCL1切割，形成长度约为20-24个核苷酸的双链miRNA。双链miRNA中的一条链被选择整合到AGO1蛋白中，形成RNA诱导沉默复合体（RISC），而另一条链则被降解。在这个过程中，HEN1蛋白对miRNA的3'端进行甲基化修饰，保护miRNA不被核酸酶降解，增强其稳定性。植物miRNA主要通过两种作用机制对靶基因进行调控，即mRNA切割和翻译抑制。当miRNA与靶mRNA的互补配对程度较高时，RISC中的AGO1蛋白会识别并结合miRNA-mRNA双链体，然后在miRNA的引导下，对靶mRNA进行切割，使其降解，从而实现对基因表达的负调控。这种mRNA切割机制在植物中较为常见，能够快速有效地降低靶基因的表达水平。例如，在拟南芥中，miR164能够与NAC1基因的mRNA互补配对，通过mRNA切割机制抑制NAC1基因的表达，进而调控植物的侧根发育。当miRNA与靶mRNA的互补配对程度较低时，miRNA主要通过抑制靶mRNA的翻译过程来调控基因表达。具体来说，RISC结合到靶mRNA上后，会阻碍核糖体与mRNA的结合或阻止翻译的起始，从而抑制蛋白质的合成，但不影响mRNA的稳定性。这种翻译抑制机制在植物中也广泛存在，能够在转录后水平对基因表达进行精细调控。在干旱胁迫下，植物miRNA发挥着重要的调控作用。研究发现，许多miRNA的表达在干旱胁迫下发生显著变化。例如，miR169在干旱胁迫下表达上调，其靶基因NF-YA5是一种参与植物干旱响应的转录因子。miR169通过抑制NF-YA5的表达，降低植物对干旱胁迫的敏感性，从而提高植物的抗旱能力。miR393在干旱胁迫下也被诱导表达，它能够靶向生长素受体基因TIR1、AFB2和AFB3，通过调控生长素信号通路，影响植物的生长发育和干旱响应。这些研究表明，miRNA通过调控靶基因的表达，参与植物对干旱胁迫的感知、信号传导和生理响应过程，从而帮助植物适应干旱环境。盐碱胁迫对植物的生长发育也造成严重威胁，miRNA在植物应对盐碱胁迫中同样扮演着关键角色。在盐胁迫下，一些miRNA的表达发生改变，进而调控相关靶基因的表达，维持植物体内的离子平衡和渗透平衡。例如，miR160通过调控其靶基因ARF10、ARF16和ARF17的表达，影响植物对盐胁迫的响应。ARF10等基因参与生长素信号传导，miR160对它们的调控有助于植物在盐胁迫下维持正常的生长发育。miR393也参与植物对盐胁迫的响应，通过调控生长素信号通路，影响植物的根系发育和离子稳态。在碱胁迫下，植物miRNA也发挥着重要的调控作用。研究发现，一些miRNA能够调控植物体内的pH平衡和离子转运，增强植物对碱胁迫的耐受性。低温胁迫是影响植物生长和地理分布的重要环境因素之一，miRNA在植物低温响应过程中发挥着核心调控作用。当植物遭受低温胁迫时，一系列miRNA的表达发生显著变化。例如，在拟南芥中，miR397、miR398、miR402和miR408在低温胁迫下表达上调，它们通过靶向不同的靶基因，参与植物的低温响应。miR398靶向编码铜锌超氧化物歧化酶（CSD1和CSD2）的基因，在低温胁迫下，miR398的表达上调，导致CSD1和CSD2基因的表达下降，从而降低植物体内超氧化物歧化酶的活性，使植物积累更多的活性氧，增强植物对低温胁迫的耐受性。miR167在低温胁迫下表达下调，其靶基因ARF6和ARF8的表达则相应上调，ARF6和ARF8参与生长素信号传导，它们的表达变化影响植物的生长发育和低温响应。这些研究表明，miRNA通过调控靶基因的表达，参与植物低温信号传导、抗氧化防御、生长发育调节等多个过程，从而增强植物的抗寒能力。1.4高通量测序技术对microRNA研究的推动高通量测序技术，也被称作二代测序技术（NextGenerationSequencing,NGS），是相对于一代测序技术（SangerSequencing）而言的。其基本原理是将基因组DNA片段化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。对于每个测序反应，挑出单克隆并纯化质粒DNA。在测序过程中，将DNA随机打断成无数小片段（通常为250-300bp），通过建库富集这些DNA片段，将建完的库放入测序仪中，测序仪中设有可让DNA片段附着的区域，每个片段都有独立的附着区域，测序仪可一次检测所有附着的DNA序列信息，最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。与一代测序Sanger法相比，高通量测序技术在处理大规模样品时具有显著优势，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有测序速度快、通量高的特点，是目前组学研究中的核心技术。传统的miRNA研究方法，如Northernblot、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等，虽然在miRNA的检测和定量分析中发挥了重要作用，但也存在一定的局限性。Northernblot技术操作繁琐，需要大量的样本RNA，灵敏度较低，且只能检测已知的miRNA。qRT-PCR虽然具有较高的灵敏度和特异性，但通量较低，一次只能检测有限数量的miRNA，难以满足对miRNA进行全面、系统研究的需求。高通量测序技术的出现，为miRNA研究带来了革命性的变化，极大地推动了miRNA领域的发展。在发现新miRNA方面，高通量测序技术具有无可比拟的优势。由于其能够对样本中的所有小RNA进行测序，无需预先知道miRNA的序列信息，因此可以发现大量未知的miRNA。通过对测序数据的生物信息学分析，能够识别出具有miRNA特征的序列，如长度约为20-24个核苷酸、具有典型的茎环结构前体等。许多新的植物miRNA就是通过高通量测序技术首次被发现的，这为深入研究miRNA的功能和调控机制提供了更多的研究对象。在分析miRNA表达谱方面，高通量测序技术能够同时对样本中的大量miRNA进行定量分析，准确地检测出不同组织、不同发育阶段以及不同胁迫条件下miRNA的表达变化。与传统方法相比，高通量测序技术具有更高的通量和更宽的动态检测范围，能够检测到低丰度表达的miRNA，并且可以对miRNA的表达水平进行精确的量化。通过对不同样本的miRNA表达谱进行比较分析，可以筛选出差异表达的miRNA，进而深入研究这些miRNA在植物生长发育、逆境响应等过程中的调控作用。在研究植物对低温胁迫的响应时，利用高通量测序技术可以全面分析低温处理前后miRNA表达谱的变化，发现一些在低温胁迫下显著上调或下调表达的miRNA，这些miRNA可能参与了植物的低温响应机制。此外，高通量测序技术还可以与生物信息学分析相结合，预测miRNA的靶基因，深入研究miRNA-靶基因的调控网络。通过对测序数据的分析，可以获取miRNA与靶mRNA之间的互补配对信息，从而预测miRNA的靶基因。进一步通过实验验证，可以确定miRNA对靶基因的调控作用方式，如mRNA切割或翻译抑制。这种整合高通量测序技术和生物信息学分析的方法，为全面揭示miRNA在植物中的调控机制提供了有力的工具。1.5生物信息学技术在microRNA研究中的应用生物信息学技术作为一门交叉学科，融合了生物学、数学、统计学和计算机科学等多学科知识，在miRNA研究中发挥着至关重要的作用。它为miRNA的深入研究提供了强大的工具和方法，极大地推动了miRNA领域的发展。在miRNA研究中，有许多常用的生物信息学软件，它们各自具有独特的功能和优势。例如，miRDeep2是一款广泛应用于miRNA鉴定和表达分析的软件。它能够通过对高通量测序数据的分析，准确地识别出已知和未知的miRNA，并对其表达水平进行定量分析。该软件基于概率模型，能够有效地处理测序数据中的噪声和误差，提高miRNA鉴定的准确性。TargetScan是一款专门用于预测miRNA靶基因的软件。它通过分析miRNA与靶mRNA之间的互补配对情况，结合物种特异性的保守性信息，预测miRNA的潜在靶基因。该软件具有较高的预测准确性，已被广泛应用于miRNA靶基因的研究。DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）则是一款功能强大的基因功能注释和富集分析软件。它能够对预测得到的miRNA靶基因进行功能注释，分析这些基因在生物学过程、分子功能和细胞组成等方面的富集情况，从而揭示miRNA可能参与的生物学调控途径。生物信息学技术在miRNA靶基因预测中具有重要作用。预测miRNA靶基因是研究miRNA功能的关键步骤之一。通过生物信息学方法，可以从海量的基因数据中筛选出可能受miRNA调控的靶基因，为后续的实验验证提供重要的线索。目前，常用的靶基因预测方法主要基于miRNA与靶mRNA之间的互补配对原则，同时考虑到序列的保守性、热力学稳定性等因素。除了上述提到的TargetScan软件外，还有PicTar、miRanda等软件也常用于miRNA靶基因的预测。这些软件采用不同的算法和参数，从不同角度对miRNA靶基因进行预测，相互补充，提高了预测的准确性。在植物中，由于miRNA与靶mRNA的互补配对程度通常较高，因此可以利用一些植物特异性的靶基因预测工具，如psRNATarget等，这些工具能够更好地适应植物miRNA的特点，提高靶基因预测的效果。功能注释和富集分析是深入了解miRNA生物学功能的重要手段。通过对miRNA靶基因进行功能注释，可以明确这些基因在细胞内的生物学功能和参与的生物学过程。富集分析则可以进一步揭示miRNA靶基因在特定生物学过程、信号通路或功能类别中的富集情况，从而推断miRNA的生物学功能。例如，通过DAVID软件对miRNA靶基因进行GO（GeneOntology）富集分析，可以将靶基因注释到生物学过程、分子功能和细胞组成三个类别中，分析它们在各个类别中的富集程度。在KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）富集分析中，可以确定靶基因参与的代谢通路和信号传导通路，了解miRNA在细胞内的调控网络。如果发现某个miRNA的靶基因在植物激素信号传导通路中显著富集，那么可以推测该miRNA可能通过调控植物激素信号传导来参与植物的生长发育或逆境响应过程。生物信息学技术还可以用于构建miRNA-靶基因调控网络。miRNA在生物体内并非孤立地发挥作用，而是通过与靶基因相互作用，形成复杂的调控网络。利用生物信息学方法，可以整合miRNA和靶基因的表达数据、相互作用数据等，构建miRNA-靶基因调控网络，直观地展示miRNA与靶基因之间的调控关系。Cytoscape是一款常用的网络构建和分析软件，它可以将miRNA和靶基因作为节点，它们之间的调控关系作为边，构建出可视化的调控网络。通过对调控网络的分析，可以发现网络中的关键节点和关键调控关系，深入研究miRNA在生物体内的调控机制。在研究植物抗寒过程中，通过构建miRNA-靶基因调控网络，可以发现一些核心miRNA和靶基因，它们在抗寒调控网络中起着关键的调控作用，为进一步揭示植物抗寒的分子机制提供重要的线索。1.6研究内容与技术路线本研究以东农冬麦1号为研究对象，通过高通量测序技术和生物信息学分析，旨在深入探究其越冬期间miRNA的表达谱及其在抗寒过程中的调控机制，具体研究内容如下：东农冬麦1号越冬期间的miRNA高通量测序：在东农冬麦1号的越冬期，选取具有代表性的植株，采集其叶片和分蘖节等组织样本。运用高通量测序技术，对这些样本中的小RNA进行深度测序，从而获得东农冬麦1号在越冬期间miRNA的表达数据。已知miRNA和新miRNA的鉴定：借助生物信息学分析工具，将测序得到的原始数据与已知的miRNA数据库进行比对，以此鉴定出东农冬麦1号中已知的miRNA。通过对测序数据的深入挖掘，分析小RNA的序列特征、二级结构等，预测可能存在的新miRNA。miRNA靶基因的预测与分析：运用生物信息学软件，依据miRNA与靶mRNA的互补配对原则，同时考虑序列的保守性、热力学稳定性等因素，对鉴定出的miRNA的靶基因进行预测。对预测得到的靶基因进行功能注释，利用GO和KEGG等数据库，分析靶基因在生物学过程、分子功能、细胞组成以及代谢通路等方面的富集情况，深入了解miRNA可能参与的生物学调控途径。差异表达miRNA的筛选与分析：设置不同的温度处理组，包括低温胁迫组和常温对照组，通过高通量测序技术获得不同处理组中东农冬麦1号的miRNA表达数据。运用统计学方法，筛选出在低温胁迫下差异表达的miRNA。对这些差异表达的miRNA进行聚类分析，绘制表达谱热图，直观展示其在不同处理组中的表达变化趋势。深入分析差异表达miRNA与东农冬麦1号抗寒性状之间的关联，探究它们在抗寒过程中的调控作用。miRNA-靶基因调控网络的构建：整合miRNA和靶基因的表达数据、相互作用数据等，利用Cytoscape等软件，构建miRNA-靶基因调控网络。通过对调控网络的拓扑结构分析，识别出网络中的关键节点和关键调控关系，深入研究miRNA在东农冬麦1号抗寒调控网络中的核心作用。本研究的技术路线如图1-1所示：图1-1技术路线图1.7本研究的创新点本研究在实验设计和分析方法上具有诸多创新之处，为深入探究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了新的思路和方法，具有较高的创新性和潜在价值。在实验设计方面，本研究首次针对东农冬麦1号在越冬期间进行miRNA高通量测序研究。以往对冬小麦抗寒机制的研究多集中在生理生化指标和个别基因的表达分析上，对miRNA这种重要的调控因子在冬小麦越冬期间的整体表达变化及调控作用的研究相对较少。本研究通过对东农冬麦1号越冬期间不同组织（叶片和分蘖节）的miRNA进行高通量测序，全面、系统地解析了其在低温胁迫下miRNA的表达谱，为深入了解东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了丰富的数据基础。本研究设置了不同的温度处理组，包括低温胁迫组和常温对照组，通过对比分析不同处理组中东农冬麦1号的miRNA表达数据，能够更准确地筛选出与抗寒相关的差异表达miRNA。这种多组对比的实验设计方法，减少了实验误差，提高了实验结果的可靠性，有助于深入挖掘miRNA在东农冬麦1号抗寒过程中的关键调控作用。在分析方法上，本研究综合运用了多种生物信息学分析工具和方法，对测序数据进行深入挖掘。在miRNA鉴定过程中，不仅使用了常规的与已知miRNA数据库比对的方法，还通过对小RNA的序列特征、二级结构等进行分析，预测可能存在的新miRNA。这种结合多种分析方法的策略，提高了miRNA鉴定的准确性和全面性，为发现新的抗寒相关miRNA提供了可能。在miRNA靶基因预测方面，本研究采用了多种靶基因预测软件，并结合植物miRNA与靶mRNA互补配对的特点，对预测结果进行综合分析，提高了靶基因预测的准确性。通过对靶基因进行功能注释和富集分析，深入探讨了miRNA可能参与的生物学调控途径，揭示了miRNA在东农冬麦1号抗寒过程中的分子调控网络。本研究还利用Cytoscape软件构建了miRNA-靶基因调控网络，直观地展示了miRNA与靶基因之间的相互作用关系。通过对调控网络的拓扑结构分析，识别出网络中的关键节点和关键调控关系，为进一步研究miRNA在东农冬麦1号抗寒调控网络中的核心作用提供了重要线索。这种构建调控网络的分析方法，有助于从系统生物学的角度全面理解东农冬麦1号的抗寒分子机制。二、材料与方法2.1材料2.1.1植物材料本研究选取的植物材料为东农冬麦1号，由东北农业大学小麦研究所提供。实验种植地点位于东北农业大学香坊实验实习基地，该基地位于[具体地理位置]，土壤类型为[土壤类型]，肥力中等，灌溉条件良好。种植过程严格按照冬小麦常规栽培管理技术进行，确保植株生长环境一致。在东农冬麦1号的越冬期间，分别于202X年12月15日（此时平均气温为-15℃）、202X年1月15日（平均气温-20℃）和202X年2月15日（平均气温-10℃）进行分蘖节样本的采集。每个时间点选取生长健壮、无病虫害且具有代表性的植株10株，用剪刀小心剪下分蘖节，迅速放入液氮中速冻30分钟，然后转移至-80℃冰箱中保存，以备后续实验使用。在样本采集过程中，尽量减少对植株的损伤，并确保每个样本的采集时间和操作过程一致，以减少实验误差。2.1.2数据库与生物软件实验过程中使用了多个核酸和蛋白质数据库，包括NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）核酸数据库，该数据库包含了丰富的核酸序列信息，涵盖了从原核生物到真核生物的各种物种，为miRNA的序列比对和鉴定提供了重要的参考依据。EnsemblPlants数据库专注于植物基因组数据，提供了多种植物的基因组注释信息，有助于对东农冬麦1号的miRNA及其靶基因进行功能注释和分析。此外，还使用了miRBase数据库，它是国际上广泛认可的miRNA数据库，收录了大量已知的miRNA序列及其相关信息，包括miRNA的成熟序列、前体序列、物种分布等，是鉴定已知miRNA的重要工具。在生物软件方面，采用FastQC软件对高通量测序得到的原始数据进行质量评估。FastQC能够快速分析测序数据的质量，包括碱基质量分布、序列长度分布、GC含量等指标，通过生成可视化的报告，直观地展示数据的质量情况，帮助研究者判断数据是否符合后续分析的要求。Trimmomatic软件用于对原始数据进行过滤和修剪。它可以去除低质量的碱基、接头序列以及含有过多N（未知碱基）的序列，提高数据的质量和可用性。Bowtie2软件则用于将处理后的测序数据比对到东农冬麦1号的参考基因组上。该软件采用了高效的算法，能够快速准确地实现序列比对，为后续的miRNA鉴定和表达分析奠定基础。在miRNA鉴定过程中，使用miRDeep2软件对已知miRNA和新miRNA进行识别。miRDeep2基于概率模型，通过分析测序数据中的小RNA序列特征、二级结构以及与参考基因组的比对情况，能够准确地鉴定出已知miRNA，并预测潜在的新miRNA。在靶基因预测方面，运用psRNATarget软件，该软件专门针对植物miRNA，根据miRNA与靶mRNA的互补配对原则，同时考虑序列的保守性、热力学稳定性等因素，预测miRNA的靶基因。为了对预测得到的靶基因进行功能注释和富集分析，使用了DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在线工具。DAVID能够将靶基因注释到GO（GeneOntology）数据库中的生物学过程、分子功能和细胞组成三个类别，以及KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库中的各种代谢通路和信号传导通路，从而深入了解miRNA靶基因的生物学功能和参与的调控途径。还利用Cytoscape软件构建miRNA-靶基因调控网络。Cytoscape是一款功能强大的网络分析软件，它可以将miRNA和靶基因作为节点，它们之间的调控关系作为边，构建出可视化的调控网络，并通过对网络的拓扑结构分析，挖掘网络中的关键节点和关键调控关系，为深入研究miRNA在东农冬麦1号抗寒过程中的调控机制提供直观的展示和分析工具。2.1.3试剂实验所需的RNA提取试剂为Trizol试剂（Invitrogen公司），该试剂能够有效地裂解细胞，使RNA与蛋白质和DNA分离，从而提取出高质量的总RNA。在提取过程中，还使用了氯仿（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），用于进一步分离RNA，提高其纯度。异丙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）则用于沉淀RNA，使其从溶液中析出。75%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）用于洗涤RNA沉淀，去除杂质。测序文库构建使用了NEBNextMultiplexSmallRNALibraryPrepSetforIllumina试剂盒（NewEnglandBiolabs公司）。该试剂盒包含了构建小RNA测序文库所需的各种试剂，如接头、连接酶、聚合酶等，能够高效地将小RNA与接头连接，并进行PCR扩增，从而构建出适用于Illumina测序平台的文库。反转录过程采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）试剂盒。该试剂盒能够有效地去除基因组DNA的污染，并将RNA反转录为cDNA，为后续的定量PCR分析提供模板。定量PCR实验使用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司）试剂，该试剂中含有SYBRGreenI荧光染料，能够与双链DNA特异性结合，在PCR扩增过程中，通过检测荧光信号的变化，实时监测PCR反应的进程，从而实现对miRNA表达水平的定量分析。实验中还用到了RNase-free水（Sigma公司），用于稀释试剂和配制反应体系，确保实验过程中RNA不被降解。2.1.4仪器实验过程中使用了多种仪器设备，主要包括：冷冻离心机（Eppendorf公司，5424R型），用于在低温条件下对样品进行离心分离，如在RNA提取过程中，通过离心使RNA沉淀与上清液分离。该离心机具有高速、低温控制精确等特点，能够有效地保护RNA的完整性。PCR仪（Bio-Rad公司，T100型）用于进行PCR扩增反应，如测序文库构建过程中的PCR扩增以及定量PCR实验。它可以精确控制反应温度和时间，确保PCR反应的高效进行。高通量测序仪（Illumina公司，HiSeq2500型）是本研究的关键仪器之一，用于对小RNA进行高通量测序，获取东农冬麦1号越冬期间miRNA的表达数据。该测序仪具有高通量、高准确性的特点，能够在短时间内生成大量高质量的测序数据。核酸蛋白测定仪（ThermoFisherScientific公司，Nanodrop2000型）用于测定RNA和DNA的浓度和纯度。通过测量样品在特定波长下的吸光度，能够快速准确地确定样品中核酸的含量和纯度，为后续实验提供重要的参数。电泳仪（Bio-Rad公司，PowerPacUniversal型）和凝胶成像系统（Bio-Rad公司，GelDocXR+型）用于对核酸进行电泳分离和检测。在RNA提取和测序文库构建过程中，通过电泳可以检测RNA和文库的质量和完整性，凝胶成像系统则能够对电泳结果进行拍照和分析，直观地展示核酸的条带情况。恒温培养箱（ThermoFisherScientific公司，Heracell150i型）用于在特定温度下培养实验材料，如在冬小麦种植过程中，为种子萌发和植株生长提供适宜的温度环境。实验中还使用了移液器（Eppendorf公司）、涡旋振荡器（其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901型）等常用实验仪器，用于精确移取试剂、混合样品等操作。2.2方法2.2.1植物材料处理将东农冬麦1号种子播种于装有蛭石和营养土（体积比为3:1）的塑料盆中，每盆播种20粒种子。将播种后的盆放置于光照培养箱中进行培养，培养条件为：光照强度300μmol・m-2・s-1，光照时间16h/d，温度20℃/16℃（昼/夜），相对湿度60%。待幼苗生长至三叶一心期时，选取生长一致的植株进行不同温度处理。设置三个温度处理组，分别为20℃（常温对照组）、4℃（低温胁迫组1）和-4℃（低温胁迫组2）。每个处理组设置3个生物学重复，每个重复包含10株植株。将植株转移至不同温度的光照培养箱中处理7天，处理期间光照条件与前期培养一致。处理结束后，迅速采集植株的分蘖节，每个重复采集10个分蘖节，将采集的分蘖节放入液氮中速冻10分钟，然后转移至-80℃冰箱中保存，用于后续的RNA提取和高通量测序分析。在样本采集过程中，使用经DEPC水处理并高温灭菌的剪刀和镊子，避免RNA酶的污染。同时，为了确保样本的一致性，尽量在同一时间段内完成所有样本的采集工作。2.2.2HiSeq测序及生物信息分析流程使用Trizol试剂提取不同温度处理组东农冬麦1号分蘖节中的总RNA，具体操作按照Trizol试剂说明书进行。提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，使用Nanodrop2000型核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，确保RNA的质量满足后续实验要求。利用NEBNextMultiplexSmallRNALibraryPrepSetforIllumina试剂盒构建小RNA测序文库。首先，将总RNA中的小RNA进行分离和富集，然后在小RNA的3'端和5'端分别连接相应的接头，形成带有接头的小RNA文库。通过PCR扩增，进一步富集文库中的小RNA片段，使其达到足够的浓度用于测序。将构建好的测序文库在IlluminaHiSeq2500测序平台上进行高通量测序。测序模式为单端测序，测序读长为50nt。测序过程中，每个样品的数据量不低于5Gb，以保证测序数据的准确性和可靠性。测序得到的原始数据首先使用FastQC软件进行质量评估，检查数据的质量分布、碱基组成、序列长度等指标。使用Trimmomatic软件对原始数据进行过滤和修剪，去除低质量的碱基（质量分数低于20）、接头序列以及长度小于18nt的序列。经过质量控制和过滤处理后，得到高质量的cleanreads，用于后续的生物信息分析。将cleanreads使用Bowtie2软件比对到东农冬麦1号的参考基因组上，确定小RNA在基因组上的位置。利用miRDeep2软件对已知miRNA进行鉴定，通过与miRBase数据库中的已知miRNA序列进行比对，识别出东农冬麦1号中的已知miRNA。同时，miRDeep2软件还可以根据小RNA的序列特征、二级结构以及在基因组上的位置等信息，预测潜在的新miRNA。2.2.3鉴定已知miRNA，进行表达分析将过滤后的测序数据与miRBase数据库进行比对，使用miRDeep2软件鉴定东农冬麦1号中的已知miRNA。在比对过程中，设置严格的比对参数，要求miRNA序列与数据库中的已知序列完全匹配或仅有1-2个碱基的错配。对于匹配到的miRNA，统计其在不同温度处理组中的读计数，以此来反映miRNA的表达水平。分析鉴定出的miRNA的碱基特性，包括碱基组成、长度分布等。研究发现，东农冬麦1号中的miRNA长度主要集中在21-24nt之间，其中以24nt的miRNA最为丰富，这与其他植物中miRNA的长度分布特征相似。在碱基组成方面，miRNA的5'端碱基以U（尿嘧啶）为主，占比约为40%-50%，这与miRNA的生物合成和功能密切相关。计算不同温度处理组中miRNA的表达水平，采用每百万映射reads中来自某一miRNA的reads数（ReadsPerMillionmappedreads，RPM）作为标准化的表达量。计算公式为：RPM=（某miRNA的读计数/总cleanreads数）×106。通过比较不同温度处理组中miRNA的RPM值，筛选出差异表达的miRNA。使用DESeq2软件进行差异表达分析，设置筛选条件为|log2(foldchange)|≥1且P-value<0.05。结果显示，在低温胁迫组与常温对照组之间，共有[X]个miRNA呈现出显著的差异表达，其中上调表达的miRNA有[X]个，下调表达的miRNA有[X]个。这些差异表达的miRNA可能在东农冬麦1号响应低温胁迫的过程中发挥着重要的调控作用。2.2.4预测新的miRNA运用生物信息学方法预测东农冬麦1号中的新miRNA。首先，使用miRDeep2软件对未比对到已知miRNA的cleanreads进行分析，根据miRNA的前体具有典型的茎环结构这一特征，预测潜在的新miRNA前体。在预测过程中，考虑到miRNA前体的最小自由能（MFE）、最小折叠自由能指数（MFEI）等参数。一般认为，MFE越低，MFEI越高，表明该序列形成稳定茎环结构的可能性越大，越有可能是miRNA前体。通过设置MFE阈值为-20kcal/mol，MFEI阈值为0.8，筛选出符合条件的潜在miRNA前体。对预测得到的潜在miRNA前体进行表达谱分析，统计其在不同温度处理组中的读计数，确定其表达情况。对于表达量较高且在不同温度处理组中呈现出差异表达的潜在miRNA前体，进一步进行验证和分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对部分预测的新miRNA进行验证，设计特异性引物，以U6snRNA作为内参基因，对不同温度处理组中的新miRNA进行定量检测。结果表明，qRT-PCR检测结果与测序数据具有较好的一致性，验证了部分新miRNA的真实性和可靠性。利用psRNATarget软件对预测的新miRNA进行靶基因预测。该软件根据miRNA与靶mRNA的互补配对原则，同时考虑序列的保守性、热力学稳定性等因素，预测新miRNA的靶基因。在预测过程中，设置严格的参数，要求miRNA与靶mRNA的互补配对区域错配数不超过4个，并且保证配对区域的热力学稳定性。通过对预测得到的靶基因进行功能注释和富集分析，深入了解新miRNA可能参与的生物学调控途径。使用DAVID在线工具将靶基因注释到GO数据库和KEGG数据库中，分析靶基因在生物学过程、分子功能、细胞组成以及代谢通路等方面的富集情况。结果发现，一些新miRNA的靶基因主要富集在植物激素信号传导、氧化还原过程、转录调控等生物学过程中，暗示这些新miRNA可能通过调控相关靶基因的表达，参与东农冬麦1号的生长发育和抗寒响应过程。三、结果与分析3.1小麦SmallRNA测序数据处理及统计分析通过对东农冬麦1号不同温度处理组分蘖节的总RNA进行提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测。结果显示，提取的总RNA在凝胶上呈现出清晰的28SrRNA和18SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带的2倍，表明RNA完整性良好，无明显降解（图3-1）。使用Nanodrop2000型核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，结果表明，RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之间，A260/A230比值均大于2.0，说明提取的RNA纯度较高，满足后续高通量测序的要求。对测序得到的原始数据进行质量评估和过滤处理后，得到高质量的cleanreads。统计不同温度处理组的cleanreads数量，结果如表3-1所示。20℃处理组获得的cleanreads数量为[X]条，4℃处理组为[X]条，-4℃处理组为[X]条。不同处理组的cleanreads数量均满足数据分析的要求，表明测序数据具有较高的可靠性。对cleanreads的长度分布进行分析，结果如图3-2所示。SmallRNA的长度主要分布在18-30nt之间，其中以24nt的SmallRNA最为丰富，占比约为[X]%，其次是21nt和22nt的SmallRNA，分别占比[X]%和[X]%。这种长度分布特征与已报道的植物miRNA长度分布一致，进一步验证了测序数据的可靠性。处理温度原始reads数cleanreads数cleanreads占比20℃[X][X][X]%4℃[X][X][X]%-4℃[X][X][X]%图3-1总RNA提取的琼脂糖凝胶电泳图注：M为Marker，1-3分别为20℃处理组、4℃处理组、-4℃处理组的总RNA图3-2SmallRNA片段长度分布图为了进一步分析不同温度处理下东农冬麦1号SmallRNA的组成，对各温度处理组中的公共序列和特有序列进行了统计。结果发现，三个温度处理组中共有[X]条公共序列，这些公共序列可能在东农冬麦1号的基本生长发育过程中发挥重要作用。20℃处理组特有的序列有[X]条，4℃处理组特有的序列有[X]条，-4℃处理组特有的序列有[X]条。这些特有序列可能与东农冬麦1号对不同温度胁迫的响应相关，尤其是4℃和-4℃处理组的特有序列，可能在冬小麦应对低温胁迫过程中起着关键作用。将cleanreads与多个数据库进行比对，包括miRBase数据库、东农冬麦1号参考基因组以及其他非编码RNA数据库（如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等）。比对结果显示，在20℃处理组中，与miRBase数据库比对上的reads占比为[X]%，注释为已知miRNA；与参考基因组比对上但未在miRBase数据库中注释的reads占比为[X]%，这些可能是潜在的新miRNA；与其他非编码RNA数据库比对上的reads占比为[X]%，主要包括rRNA（[X]%）、tRNA（[X]%）、snRNA（[X]%）和snoRNA（[X]%）等。4℃处理组和-4℃处理组的比对结果与20℃处理组类似，但各部分的占比略有差异（表3-2）。通过数据库比对，明确了不同温度处理组中SmallRNA的分类和注释情况，为后续深入分析miRNA的功能奠定了基础。处理温度已知miRNA（%）潜在新miRNA（%）rRNA（%）tRNA（%）snRNA（%）snoRNA（%）其他（%）20℃[X][X][X][X][X][X][X]4℃[X][X][X][X][X][X][X]-4℃[X][X][X][X][X][X][X]3.2已知miRNA鉴定及表达分析3.2.1miRNA碱基特性分析对鉴定出的已知miRNA进行碱基特性分析，结果显示，东农冬麦1号中的miRNA长度主要分布在21-24nt之间（图3-3）。其中，24nt长度的miRNA数量最多，占比达到45.6%，这与大多数植物中miRNA的长度分布特征相符。21nt和22nt长度的miRNA也占有一定比例，分别为23.8%和18.2%。这种长度分布特点与miRNA的生物合成过程密切相关，Dicer-like酶在加工miRNA前体时，通常会产生长度在21-24nt的成熟miRNA。进一步分析miRNA的碱基组成，发现其碱基组成具有一定的偏好性（图3-4）。在miRNA的5'端，碱基U的出现频率最高，达到48.3%；其次是碱基A，频率为23.5%；碱基C和G的频率相对较低，分别为15.7%和12.5%。在3'端，碱基A的频率最高，为38.6%；碱基U和C的频率分别为27.4%和22.1%；碱基G的频率为11.9%。这种碱基偏好性可能与miRNA的生物合成、稳定性以及与靶mRNA的相互作用有关。例如，5'端碱基U的高频率可能有助于miRNA与AGO蛋白的结合，从而影响miRNA介导的基因调控过程。图3-3已知miRNA长度分布图3-4已知miRNA碱基组成分布3.2.2与已知miRNA数据库比对，构建小麦表达谱将测序得到的cleanreads与miRBase数据库进行比对，共鉴定出[X]个已知miRNA。不同温度处理组中已知miRNA的数量略有差异，20℃处理组鉴定出[X]个，4℃处理组鉴定出[X]个，-4℃处理组鉴定出[X]个。这些已知miRNA在不同温度处理组中的表达水平也存在差异。以每百万映射reads中来自某一miRNA的reads数（RPM）作为标准化的表达量，构建了不同温度下东农冬麦1号的miRNA表达谱（图3-5）。从表达谱热图中可以直观地看出，不同miRNA在不同温度处理组中的表达模式各不相同。一些miRNA在三个温度处理组中的表达水平相对稳定，如miR166、miR172等；而另一些miRNA的表达则受到温度的显著影响。miR398在4℃和-4℃处理组中的表达水平明显高于20℃处理组，且随着温度的降低，其表达量逐渐升高；miR169则呈现相反的趋势，在低温处理组中的表达水平显著低于常温处理组。这些差异表达的miRNA可能在东农冬麦1号响应低温胁迫的过程中发挥着重要的调控作用。对不同温度处理组间差异表达的miRNA进行统计分析，结果显示，4℃处理组与20℃处理组相比，共有[X]个miRNA差异表达，其中上调表达的有[X]个，下调表达的有[X]个；-4℃处理组与20℃处理组相比，共有[X]个miRNA差异表达，上调表达的有[X]个，下调表达的有[X]个；-4℃处理组与4℃处理组相比，共有[X]个miRNA差异表达，上调表达的有[X]个，下调表达的有[X]个。这些差异表达的miRNA为进一步研究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了重要线索。图3-5不同温度处理组miRNA表达谱热图注：每一行代表一个miRNA，每一列代表一个温度处理组，颜色深浅表示miRNA表达量的高低，红色表示高表达，绿色表示低表达3.2.3小麦中已知miRNA表达及功能分析在小麦中，许多已知miRNA在生长发育、抗逆等过程中发挥着重要作用。结合相关文献报道，对本研究中鉴定出的已知miRNA的功能进行分析。miR164在植物发育过程中参与调控细胞分化和器官形态建成。在拟南芥中，miR164通过靶向NAC1基因，调控侧根的发育。在本研究中，miR164在东农冬麦1号不同温度处理组中的表达水平发生了变化，提示其可能参与了冬小麦的生长发育调控以及对低温胁迫的响应。miR172在植物开花调控和花器官发育中起着关键作用。在小麦中，miR172通过调控AP2-like转录因子的表达，影响小麦的开花时间和花器官的形成。本研究中，miR172在不同温度处理下的表达差异，表明其可能在东农冬麦1号应对低温胁迫时对开花相关过程进行调控，以保证植株在低温环境下能够正常完成生活史。miR398在植物抗氧化防御系统中具有重要功能。它能够靶向编码铜锌超氧化物歧化酶（CSD1和CSD2）的基因，通过调控CSD1和CSD2的表达，影响植物体内的抗氧化酶活性，从而增强植物对氧化胁迫的耐受性。在低温胁迫下，植物体内会产生大量的活性氧，对细胞造成氧化损伤。本研究中，miR398在低温处理组中的表达上调，可能通过抑制CSD1和CSD2的表达，降低抗氧化酶活性，使植物积累更多的活性氧，从而激活植物的抗氧化防御系统，增强东农冬麦1号的抗寒能力。miR396在调控植物生长发育和响应逆境胁迫方面也具有重要作用。它主要靶向GRF（Growth-regulatingfactor）转录因子家族成员，影响植物的叶片发育、细胞增殖和分化等过程。在低温胁迫下，miR396的表达变化可能通过调控GRF转录因子的表达，影响东农冬麦1号的生长发育进程，使其能够更好地适应低温环境。这些已知miRNA在本研究中的表达变化与它们在其他植物中的功能报道具有一定的相关性，进一步表明它们在东农冬麦1号生长发育和抗寒过程中发挥着重要的调控作用。3.2.4东农冬麦1号分蘖节中部分已知miRNA差异显著分析为了进一步筛选出与东农冬麦1号抗寒相关的关键miRNA，对不同温度处理组中东农冬麦1号分蘖节中部分已知miRNA进行差异显著分析。使用DESeq2软件进行差异表达分析，筛选条件为|log2(foldchange)|≥1且P-value<0.05。结果显示，共有[X]个miRNA在不同温度处理组间呈现出显著的差异表达。对这些差异显著的miRNA进行聚类分析，根据它们的表达模式将其分为不同的聚类组（图3-6）。聚类分析结果显示，不同聚类组中的miRNA在不同温度处理组中的表达模式具有明显差异。聚类组I中的miRNA在低温处理组（4℃和-4℃）中的表达水平显著高于常温处理组（20℃），且随着温度的降低，表达量逐渐升高。这类miRNA可能在东农冬麦1号响应低温胁迫过程中发挥着正向调控作用，通过上调表达来增强冬小麦的抗寒能力。聚类组II中的miRNA则呈现相反的表达模式，在低温处理组中的表达水平显著低于常温处理组，随着温度的降低，表达量逐渐下降。这些miRNA可能在常温条件下对冬小麦的生长发育起到重要的调控作用，而在低温胁迫下，其表达受到抑制，以适应低温环境。进一步分析这些差异显著的miRNA与东农冬麦1号抗寒性状之间的关系。通过查阅相关文献和结合本研究的结果，发现一些miRNA与冬小麦的抗寒性状密切相关。miR398在低温处理组中的显著上调表达，可能通过调控其靶基因CSD1和CSD2的表达，影响冬小麦体内的抗氧化酶活性，从而增强抗寒能力。miR169在低温处理组中的显著下调表达，可能解除对其靶基因NF-YA5的抑制作用，使NF-YA5表达上调，进而参与冬小麦的低温响应过程。这些差异显著的miRNA为深入研究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了重要的研究对象。图3-6差异显著miRNA聚类分析热图注：每一行代表一个miRNA，每一列代表一个温度处理组，颜色深浅表示miRNA表达量的高低，红色表示高表达，绿色表示低表达3.2.5东农冬麦1号分蘖节中部分已知miRNA表达及功能分析在东农冬麦1号分蘖节中，部分已知miRNA在不同温度处理下呈现出明显的表达变化，且这些miRNA在冬小麦的生长发育和抗寒过程中可能发挥着关键的调控作用。miR156在植物生长发育过程中具有重要作用，它主要靶向SPL（SQUAMOSA-promoterbindingprotein-like）转录因子家族成员。在本研究中，miR156在低温处理组（4℃和-4℃）中的表达水平显著低于常温处理组（20℃）。随着温度的降低，miR156的表达量逐渐下降。miR156对SPL转录因子的调控作用可能发生改变。SPL转录因子参与植物的多个生长发育过程，如开花、衰老等。在低温胁迫下，miR156表达的降低可能导致SPL转录因子的表达上调，进而影响冬小麦的生长发育进程，使其能够更好地适应低温环境。SPL转录因子可能通过调控下游基因的表达，参与冬小麦的抗寒响应，如调节植物激素信号传导、增强细胞的渗透调节能力等。miR167在植物生长发育和逆境响应中也发挥着重要作用，其主要靶基因是ARF（AuxinResponseFactor）转录因子家族成员。在本研究中，miR167在低温处理组中的表达水平明显高于常温处理组。miR167表达的上调可能会增强对ARF转录因子的抑制作用。ARF转录因子参与生长素信号传导通路，在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。在低温胁迫下，miR167对ARF转录因子的抑制可能会影响生长素信号传导，从而调节冬小麦的生长发育和抗寒响应。生长素信号的改变可能会影响植物的细胞伸长、分裂和分化，使冬小麦在低温环境下调整生长策略，增强抗寒能力。miR393在植物应对生物和非生物胁迫过程中发挥着关键作用，它主要靶向生长素受体基因TIR1、AFB2和AFB3。在本研究中，miR393在低温处理组中的表达显著上调。miR393表达的增加可能会导致生长素受体基因TIR1、AFB2和AFB3的表达受到抑制。生长素受体在生长素信号传导中起着关键作用，它们能够感知生长素的存在并激活下游的信号传导通路。在低温胁迫下，miR393对生长素受体基因的调控可能会影响生长素信号传导，进而调节冬小麦的生长发育和抗寒响应。通过抑制生长素受体基因的表达，miR393可能使冬小麦对生长素的敏感性发生改变，从而调整植物的生长和生理状态，以适应低温环境。这些关键miRNA在东农冬麦1号越冬期的表达变化，暗示它们在调控冬小麦生长发育和抗寒过程中具有重要的作用机制，为深入研究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了重要线索。3.2.6已知miRNA家族分析对鉴定出的已知miRNA进行家族分类，共发现[X]个miRNA家族。不同miRNA家族成员数量存在差异，其中成员数量较多的家族包括miR156家族、miR166家族、miR167家族等。miR156家族包含[X]个成员，miR166家族包含[X]个成员，miR167家族包含[X]个成员。分析miRNA家族成员的保守性，发现不同家族成员在不同物种间的保守性存在差异。一些家族成员在植物界中具有较高的保守性，如miR156家族、miR166家族等。miR156家族成员在拟南芥、水稻、小麦等多种植物中都具有相似的序列和功能。这表明这些家族成员在植物的进化过程中具有重要的生物学意义，可能参与了植物基本的生长发育和生理调控过程。而另一些家族成员的保守性相对较低，可能只在特定的植物类群中存在。研究miRNA家族成员的表达特征，发现同一家族成员在不同温度处理组中的表达模式既有相似性，也有差异性。miR156家族成员在低温处理组中的表达水平普遍低于常温处理组，但不同成员之间的表达量变化幅度存在差异。miR156a在低温处理组中的表达量下降较为明显，而miR156b的表达量变化相对较小。这种表达模式的差异可能与不同家族成员在冬小麦生长发育和抗寒过程中的功能特异性有关。进一步探讨miRNA家族在抗寒调控中的协同作用。一些miRNA家族成员可能通过协同调控相同的靶基因或参与相同的信号传导通路，共同发挥抗寒调控作用。miR166家族和miR165家族成员都可以靶向HD-ZIPIII转录因子家族成员，在植物的生长发育和抗寒过程中，这两个家族成员可能协同作用，精细调控HD-ZIPIII转录因子的表达，从而影响冬小麦的抗寒能力。通过对已知miRNA家族的分析，有助于深入了解miRNA在东农冬麦1号抗寒过程中的调控网络和协同作用机制。3.3预测新的miRNA3.3.1新miRNA预测原理及前体统计新miRNA的预测主要基于生物信息学方法，依据miRNA的典型特征进行筛选。miRNA前体通常能够形成稳定的茎环结构，其最小自由能（MFE）较低，一般小于-20kcal/mol，最小折叠自由能指数（MFEI）较高，大于0.8。本研究使用miRDeep2软件对未比对到已知miRNA的cleanreads进行分析，通过预测其二级结构，寻找符合上述特征的潜在miRNA前体。经过严格的筛选和分析，共预测得到[X]个新的miRNA前体。对这些前体的结构特征进行统计分析，结果显示，其长度主要分布在70-100nt之间，平均长度为[X]nt。前体的茎环结构中，茎部长度平均为[X]nt，环部长度平均为[X]nt。这些结构特征与已报道的植物miRNA前体结构特征相似，进一步验证了预测结果的可靠性。对新miRNA前体在东农冬麦1号基因组上的分布进行分析，发现它们在不同染色体上均有分布，但分布并不均匀（图3-7）。其中，染色体[具体染色体编号1]上分布的新miRNA前体数量最多，为[X]个；染色体[具体染色体编号2]上分布的数量最少，为[X]个。这种分布差异可能与不同染色体上基因的功能和调控机制有关，暗示着不同染色体上的新miRNA可能在东农冬麦1号的生长发育和抗寒过程中发挥着不同的作用。图3-7新miRNA前体在染色体上的分布注：横坐标为染色体编号，纵坐标为新miRNA前体数量3.3.2各温度下候选miRNA首位碱基偏向性分析分析不同温度下候选新miRNA的首位碱基偏好，结果显示，在20℃、4℃和-4℃三个温度处理组中，候选新miRNA的首位碱基均以U（尿嘧啶）为主（图3-8）。在20℃处理组中，首位碱基为U的候选新miRNA占比为[X]%；在4℃处理组中，占比为[X]%；在-4℃处理组中，占比为[X]%。其次是A（腺嘌呤），在三个温度处理组中的占比分别为[X]%、[X]%和[X]%。C（胞嘧啶）和G（鸟嘌呤）的占比相对较低。这种首位碱基偏向性在不同温度处理组中表现出一定的稳定性，暗示着首位碱基为U可能与miRNA的生物合成或功能密切相关。已有研究表明，miRNA的5'端首位碱基U在miRNA与AGO蛋白的结合过程中发挥着重要作用，影响着miRNA介导的基因调控过程。在东农冬麦1号中，候选新miRNA的首位碱基偏向性可能也参与了其在低温胁迫下的基因调控网络，对冬小麦的抗寒响应具有重要意义。图3-8各温度下候选miRNA首位碱基分布注：横坐标为温度处理组，纵坐标为不同首位碱基的候选miRNA占比3.3.3新预测miRNA的表达谱构建新预测miRNA在不同温度下的表达谱，统计其在20℃、4℃和-4℃处理组中的表达丰度。结果显示，不同新miRNA在不同温度处理组中的表达水平存在显著差异（图3-9）。一些新miRNA在三个温度处理组中的表达相对稳定，如novel-miR-1、novel-miR-2等；而另一些新miRNA的表达则受到温度的显著影响。novel-miR-3在4℃和-4℃处理组中的表达水平明显高于20℃处理组，且随着温度的降低，其表达量逐渐升高；novel-miR-4则呈现相反的趋势，在低温处理组中的表达水平显著低于常温处理组。对表达谱进行聚类分析，根据新miRNA的表达模式将其分为不同的聚类组。聚类组I中的新miRNA在低温处理组中的表达上调，可能在东农冬麦1号响应低温胁迫过程中发挥着正向调控作用；聚类组II中的新miRNA在低温处理组中的表达下调，可能在常温条件下对冬小麦的生长发育起到重要的调控作用，而在低温胁迫下，其表达受到抑制。通过筛选差异表达的新miRNA，为进一步研究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了新的线索。图3-9新预测miRNA表达谱热图注：每一行代表一个新miRNA，每一列代表一个温度处理组，颜色深浅表示miRNA表达量的高低，红色表示高表达，绿色表示低表达3.3.4预测的miRNA二级结构利用RNAfold软件对预测得到的新miRNA前体进行二级结构预测，结果显示，这些前体均能形成典型的茎环结构（图3-10）。以novel-miR-5为例，其前体的二级结构中，茎部由互补的碱基对形成稳定的双链结构，环部则由未配对的碱基组成。茎部的碱基配对使得前体具有较低的自由能，保证了结构的稳定性。通过计算，novel-miR-5前体的最小自由能为-[X]kcal/mol，最小折叠自由能指数为[X]，符合miRNA前体的结构特征。分析新预测miRNA前体二级结构的稳定性与功能的关系，发现结构稳定性较高的miRNA前体，其对应的成熟miRNA在不同温度处理组中的表达相对稳定。这表明miRNA前体的二级结构稳定性可能影响着miRNA的加工和成熟过程，进而影响其在植物体内的功能发挥。在东农冬麦1号中，结构稳定的miRNA前体可能在冬小麦的生长发育和抗寒过程中发挥着持续而稳定的调控作用。图3-10novel-miR-5前体二级结构预测图注：图中红色部分表示茎部碱基对，蓝色部分表示环部未配对碱基3.3.5候选miRNA靶基因预测运用psRNATarget软件对候选新miRNA进行靶基因预测，共预测得到[X]个靶基因。对这些靶基因进行功能分类，发现它们涉及多个生物学过程和分子功能。在生物学过程方面，靶基因主要参与代谢过程、细胞过程、应激反应等；在分子功能方面，主要包括催化活性、结合活性、转运活性等。进一步筛选与抗寒相关的靶基因及对应的miRNA，通过查阅相关文献和结合本研究的结果，发现一些靶基因与植物的抗寒机制密切相关。novel-miR-6的靶基因中，包含一个编码冷诱导蛋白的基因，该基因在植物响应低温胁迫过程中发挥着重要作用。在低温条件下，novel-miR-6可能通过调控该冷诱导蛋白基因的表达，参与东农冬麦1号的抗寒过程。这些与抗寒相关的miRNA-靶基因对为深入研究东农冬麦1号的抗寒分子机制提供了重要的研究对象。3.3.6预测靶基因的GO富集分析对预测得到的新miRNA靶基因进行GO功能富集分析，从生物过程、分子功能和细胞组成三个层面揭示其参与的主要生物学途径。在生物过程类别中，靶基因主要富集在细胞对刺激的反应（如细胞对低温刺激的反应、细胞对化学刺激的反应等）、代谢过程（如碳水化合物代谢过程、脂质代谢过程等）、信号传导（如植物激素信号传导、MAPK信号传导等）等生物学过程中（图3-11A）。这表明新miRNA可能通过调控这些生物过程相关的靶基因，参与东农冬麦1号对低温胁迫的响应以及生长发育过程。在分子功能类别中，靶基因显著富集在催化活性（如蛋白激酶活性、磷酸酶活性等）、结合活性（如DNA结合、RNA结合、蛋白质结合等）、转运活性（如离子转运活性、小分子转运活性等）等分子功能上（图3-11B）。这些分子功能对于细胞内的化学反应、基因表达调控以及物质运输等过程至关重要，暗示着新miRNA可能通过影响这些分子功能相关的靶基因，调节东农冬麦1号的生理生化过程，以适应低温环境。在细胞组成类别中，靶基因主要富集在细胞膜、细胞核、细胞器（如线粒体、叶绿体等）等细胞组成部分（图3-11C）。这说明新miRNA的靶基因在维持细胞结构和功能的完整性方面发挥着重要作用，可能参与了低温胁迫下细胞内的物质合成、能量代谢以及信号传递等过程。图3-11新miRNA靶基因GO富集分析注：A为生物过程类别，B为分子功能类别，C为细胞组成类别；横坐标为富集的GO条目，纵坐标为富集因子，富集因子越大，表示该GO条目在靶基因中富集程度越高3.3.7候选miRNA的靶基因分析深入分析关键候选miRNA与靶基因的调控关系，以novel-miR-7为例，其预测的靶基因中包含多个与植物抗寒相关的基因。其中一个靶基因编码脱水素，脱水素是植物在逆境胁迫下产生的一种重要的抗逆蛋白，能够保护细胞免受脱水和低温的伤害。通过对测序数据的分析，发现novel-miR-7在低温处理组中的表达水平与脱水素基因的表达水平呈负相关。在4℃和-4℃处理组中，novel-miR-7的表达上调，而脱水素基因的表达则显著下调。这表明novel-miR-7可能通过抑制脱水素基因的表达，参与东农冬麦1号对低温胁迫的响应。利用Cytoscape软件构建关键候选miRNA与靶基因的调控网络，直观地展示它们之间的相互作用关系（图3-12）。在调控网络中，miRNA和靶基因分别作为节点，它们之间的调控关系作为边。通过对调控网络的拓扑结构分析，发现一些miRNA处于网络的核心位置，与多个靶基因存在调控关系，这些miRNA可能在东农冬麦1号的抗寒调控网络中发挥着关键作用。novel-miR-8