CN119510740A 脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物及其筛选方法 （扶桑药品工业株式会社）

201880054837.02018.07.05脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物及其筛本发明提供一种使用由式(I)所示的化合物作为荧光探针分子且用于检测被测化合物的脂以及用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病(例2烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至4.一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化3v)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。ü)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；v)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。包括：W)与成为脂质过氧化抑制活性的指标的12.一种用于选择脂质过氧化抑制活性高的候选化合物的筛选方法，其特征在于，包在化合物库是包含未被批准为食品或医药品的化合物的ü)进行借助于权利要求9中所述的、使用过氧化氢叔丁基的检定方法的筛选，选择示立)选择在i)和ü)的筛选中均示出高活性值的化合物。在化合物库是包含未被批准为食品或医药品的化合物的ü)按照MTT法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化氢叔4立)选择在i)和ü)的筛选中均示出高细胞存活率的候选化合物。i)从化合物库中选择通过权利要求13或14所述的筛选方法来选择的化合物的结构类ü)对于在i)选择的化合物和通过权利要求13或14所述的筛选方法来适当地选择的化立)对于在i)选择的化合物和通过权利要求13或14所述的筛选方法来适当地选择的化N)选择在ü)和立)的两个筛选方法中示出高活性值和高细胞存活率的候选化合物；v)对于在i)选择的化合物和通过权利要求13或14所述的筛选方法来适当地选择的化W)从在N)选择的化合物和在v)选择的化合物选择候选化合物。包含有效量的选自由下述组组成的组中的至少一种化合5[0003]脂质过氧化(lipidperoxidation)反应中的脂质自由基所参与的疾病涉及心血检测且能够在接近生物体的温和条件下分析多种试料的系统的检定(a[0006]已知年龄相关性黄斑变性(AMD)是治疗满意度和药剂对于治疗的贡献度低且未得6[0013]本发明提供一种使用荧光硝基氧探针(nitroxideprobe)化合物的检测脂质过氧性药物的、用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病(diseasesinducedbylipidperoxidationreactions)例如年龄相关性黄斑变性等的医[0015]本发明人等专心研究了用于检测、评价脂质过氧化抑制的检定方法以及筛选方[0025]2,2'偶氮双(2氨基丙烷)二盐酸盐的浓度7[0034]培养细胞的浓度为1x104～1x105细胞[0045]ü)添加选自由2,2'一偶氮双(2一氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组[0051]ü)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；8离子供给源物质组成的组中的至少一种化合或医药品的化合物的化合物库的情况下，在项[12]中所述的筛选方法的基础上进一步包[0077]i)从化合物库中选择通过项[13]或[14]所述的筛选方法来选择的化合物的结构9[0080]N)选择在ü)和立)的两个筛选方法中示出高活性值和高细胞存活率的候选化合[0081]v)对于在i)选择的化合物和通过项[13]或[14]所述的筛选方法适当[0082]W)从在N)选择的化合物和在v)选择的化合物选择候选化合物。机构核心库(Corelibrary)或普雷斯特威克化合物库(Prestwickche[0096]图2是示出用于评价荧光硝基氧探针的脂质过氧化反应响应性的试验的结果的[0097]图3是示出用于评价荧光硝基氧探针与各种还原性物质的反应性的试验的结果的并测定了40分钟之后的荧光强度(λEx/λEm＝470/530nm)。荧光强度的比率是与各种抗氧化使用的抗氧化物质的化学结构，(b)是通过探针与抗氧化物质的反应得到的荧光强度的比[0098]图4是示出用于评价荧光硝基氧探针与各种氧化性物质的反应性的试验的结果的470/530nm)。荧光强度的比率是与各种氧化性物质反应后的探针的荧光强度除以ctrl(_)[0099]图5是示出用于评价在AAPH系统中的人工脂质膜中反应引发剂浓度依赖性脂质过力的(a)为刺激浓度依赖性(AAPH为0_20mM)，(b)为抗氧化物质浓度依赖性(AAPH为20mM，[0100]图6是示出用于评价Fe2+系统中的人工脂质膜中反应引发剂浓度依赖性脂质过氧[0101]图7是示出用于评价培养细胞系统中的细胞内脂质过氧化反应的试验的结果的质50μM并测定了荧光强度变化(λEx/λEm＝470/530nm)。(NBD_TEEPO的荧光强度，(c)是添加tBHP(0_300μM)并经45分钟之后的NBD_TEEPO的荧光强[0102]图8是示出用于评价使用了MTT检定的培养细胞系统中的脂质过氧化诱发性细胞存活率变化的试验的结果的图。在HepG2细胞1.0×104细胞数中添加各种氧化性物质和抗加系统：添加100μM的AA并经24小时之后、tBHP添加系统：添加100μM的BHP并经24小时之[0104]图10是示出AAPH系统中的东京大学创药机构1次筛选的结果的图。混合脂质体[0105]图11是示出Fe2+系统中的AUC评价的结果的图。混合脂质体(2.5mg/mL的EggPC、[0106]图12是示出Fe2+系统中的使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的1次筛[0107]图13是示出使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的2次筛选的结果的的AA添加系统中的活性值为30％以上且tBHP添加系统中的活性值为50％以上的部分的放[0108]图14是示出根据MTT检定方法的使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的[0109]图15是示出使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的3次筛选的结果的[0110]图16是示出根据MTT检定方法的使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的是添加tBHP并经24小时之后的各化合物的活性值，(c)是AA添加系统和tBHP添加系统中的活性值的图示，(d)是(c)的AA添加系统中的活性值为0％以上且tBHP添加系统中的活性值[0111]图17是示出用于评价使用东京大学创药机构核心库(Corelibrary)的3次筛选的[0112]图18是示出使用普雷斯特威克化合物库(Prestwickchemicallibrary)的1次筛[0113]图19是示出使用普雷斯特威克化合物库(Prestwickchemicallibrary)的1次筛选的结果以及候选化合物与对象疾病领域的关系的图。(a)是1次筛选中的AAPH系统和Fe2+活性值为0.7以上且Fe2+添加系统中的活性值为0.8以上的部分的[0114]图20是示出年龄相关性黄斑变性(AMD)模型小鼠的制备方法的图。(a)是AMD模型[0116]图22是示出汇总了对于活性指标化合物和候选化合物的主要作用/作用点、半数al)表示口服给药(oral述检定方法及检定试剂盒用于开发一次就能够试验并评价多种化合物的筛选方法(例如，以及选自由2,2'偶氮双(2氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至来源的磷脂酰胆碱(EggPC))和双十六烷基磷酸酯(DCP)制备的脂质体作[0123]自由基反应引发剂包含选自“APPH”)或二价铁离子供给源物质(例如，FeSO4)中任一物。[0126]作为为了在本发明的检定方法和检定试剂盒中使用而所观测且通过测定荧光强度可评价为作为对脂质自由基的捕获进行检测的探针有[0128]作为检测对象的脂质分子的大部分存在于生物体膜内且环境响应性荧光生色团最适宜，其虽然在亲水性环境中荧光衰减，但在疏水性环境中选择6四甲基哌啶1氧基(以下称为“TEMPO”)、2,2,6,6四乙基哌啶1氧基(以下称为性的NBDTEEPO化合物而作为荧光硝基氧检定方法是能够评价脂质过氧化反应及抗氧化物质所带来的其抑制[0142]ü)添加选自由2,2'一偶氮双(2一氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组[0152]2,2'偶氮双(2氨基丙烷)二盐酸盐的浓度[0156]本发明除了提供上述无细胞系统的检定方法之外，还提供一种使用由式(I)所示[0160]ü)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；[0164]在1个实施方式中，本发明的细胞系统检定试剂盒包括反应引发剂为花生四烯酸化合物的脂质过氧化抑制的活性值与附加的说明书中所记载的指标化合物的活性值进行氨基丙烷)二盐酸盐的无细胞系统的检定方法、丁基的细胞系统的检定方法组成的组中的至少两种以上检定为过氧化氢叔丁基的细胞系统的检定试剂盒组成的组中的至少两种以上检定试剂盒的组[0176]在脂质过氧化反应促进疾病的发作和进展的过程中发生脂质过氧化诱发性的细[0179]ü)按照MTT法，执行使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化氢叔丁[0180]本发明的检定方法及检定试剂盒可以组合上述本发明的无细胞系统和/或细胞系统的检定方法以及检定试剂盒而包括遵照该MTT法[0185]ü)将包含由式(I)所示的化合物和脂质体或培养细胞的溶液分配到各孔中；离子供给源物质组成的组中的至少一种化合[0188]N)用酶标仪(MicroplateReader)测定荧光。方法包括对于某些化合物库使用本发明的检定方如，欧洲药品管理局(EMEA))的批准的化合物的化合物库(例如，普雷斯特威克化合物库(PRESTWICKCHEMICALLIBR的综合库(Generallibrary)中的核心库(Corelibrary))。图9示出了本发明的筛选方法来源的自由基物种的水溶性高的抗氧化物质至抑制脂质过氧化链式反应的脂溶性高的抗2+系统检定方法的筛选脂质体AAPH系统筛选中缩小了范围的化合物，在脂质体Fe2+系统筛选中进一步缩小候选[0194]使用本发明的检定方法的筛选方法作为1次筛选包括借助于使用脂质体的无细胞[0198]立)接下来，进行借助于使用在ü)的工序中示出了高活性值的化合物的、使用二[0199]根据在上述ü)的筛选中测定的荧光强度并基于下式算出各被测化合物的活性[0205]根据在上述立)的筛选中测定的荧光强度并基于下式算出各被测化合物的活性[0215]ü)执行使用过氧化氢叔丁基的细胞系统检定方法，并选择示出高活性值的化合[0216]立)选择在i)和ü)的检定方法中均示出高活性值的化合物。[0217]在利用上述细胞系统检定方法的筛选中，根据在作为反应引发剂分别使用AA或[0220]AUCSample：根据有反应引发剂且有各化合物(n＝1)时的荧光强度算出的曲线下方[0221]AUCControl：根据有反应引发剂而无各化合物时的荧光强度算出的曲线下方的面[0225]作为用于检查细胞系统中的细胞死亡抑制活性的筛选，使用以人肝癌为来源的HepG2细胞并进行将AA和tBHP用作自由基引发剂的检定而测定细胞存活率。根据该细胞存[0234]ü)按照MTT法，进行借助于使用包含培养细胞的培养基、被测化合物以及过氧化[0235]立)选择在i)和ü)的检定方法中均示出高细胞存活率的候选化合物。含例如与在前面所述的低层次的筛选检定(例如[0241]i)从化合物库中选择通过基于本发明细胞系统检定的筛选方法来选择的化合物[0242]ü)对于在i)选择的化合物和原先适当地选择的化合物执行利用本发明细胞系统[0243]立)对于在i)选择的化合物和原先适当地选择的化合物执行利用按照本发明MTT[0244]N)在ü)和立)的两个筛选方法中选择示出高活性值和高细胞存活率的候选化合[0245]v)对于在i)选择的化合物和通过基于细胞系统检定的筛选或基于按照MTT法的[0246]W)从在N)选择的化合物和在v)选择的化合物选择候选化合物。并且含有在医药领域中通常使用的无毒性且惰了含有有效活性成分之外，还可以根据各种用途活性药物或医药组合物可以与公知的活性药物或医药组公知的方法制备的物质。核心库(Corelibrary)化合物、普雷斯特威克化合物库的4氟7硝基2,1,3苯并噁二唑并加入了342mg(2.0mmol)的、+)计算值(caldfor)C15H20N5NaO4[M+Na]+：357.1413,测得值4氨基2,2,6,6四甲基哌啶1氧基并在冰浴中加入了1.35g(5.0mmol)的5(二甲基氨=99：1)进行分离提纯，得到了396mg(收率：20％)。HRMS(ESI+)计算值(caldfor)C21H8186)中记载的方法制备了2,2,6,6四乙基4(4硝基苯并[1,2,5]噁二唑7基氨基)哌氯7硝基2,1,3苯并噁二唑和61μL的Et3N(三乙胺)并加入了100mg(0.44mmol)的4氨413.2024[0275]与2,2,6,6四乙基4(4硝基苯并[1,2,5]噁二唑7基氨基)哌啶1氧基(NBD氧(NBDTEMPO化合物或DansylTEMPO化合物)(5.0μM)和脂质体(2.5mg/mL的EggPC、[0283]在37℃下，在包含脂质体(2.5mg/mL的EggPC、0.1mg/mL的DCP)的磷酸缓冲液NBDPen化合物、或NBDTEEPO化合物)和50μM的各种还原性物质(AsA、UA、TPL、Eda、体内起水溶性抗氧化物质作用且在诸多食品等中也含有的AsA、作为人体血液中含量最高数(LogPo/w)以AsA<UA<TPL<Eda<Catechin<Trolo[0291]无论在哪一个探针分子，荧光强度在与ROS的反应中均几乎未上升。可知NBD_TEMPO化合物对于脂质过氧化反应的响应性最低，NBD_TEEPO化合物和NBD_Pen化合物具有[0297]无论在AAPH系统中还是在Fe2+系统中探针的荧光强度均以浓度依赖方式上升(图8.7#4.9#3.2#5.4#3.2#性物质(10μM)、脂质体(2.5mg/mL的EggPC、0.1mg/mL的DCP)。混合AAPH(20mM)或FeSO4[0309]使用DMEM培养基(包含10％的FBS、1％的青霉素_链霉素以及1×MEM非必需氨基基(DMSO为0.5乙腈为0.5％)中添基(DMSO为0.5乙腈为0.5％)中添加AA(0_1004.1#2.2#6.5#3.8#2.8#5.0#25.0#6.3#4.7#6.9#4.8#6.9#物依达拉奉更高的活性值。决定将该836个化合物作为一次筛选中的苗头(hit)化合物(候[0340]接着，对于在AAPH系统中示出了比依达拉奉更高的脂质过氧化抑制效果的836个将溶液A通过自动分液器(MultidropCombi)分配了36μL。将溶液B通过自动化移液工作站的FeSO4。在37℃下混合反应混合物并每3分钟经时测定了激发波长为470nm、荧光波长为[0346]从东京大学创药机构获得了化合物10添加495μL测定用DMEM培养基而调节为化合物100μM1.物(100μM1.0％DMSO)中手动分配了包含12.5μM的NBD_TEEPO化合物的DMEM培养基(1.25%乙腈)64μL、溶解于PBS中的AA(2000[0347]在37℃下混合反应混合物并每3分钟经时测定了激发波长为470nm、荧光波长为中根据60分钟的荧光强度算出了AUC，并根据说明书中所记载的式子算出了各被测化合物胺[0363]从东京大学创药机构获得了化合物10添加495μL测定用DMEM培养基而调节为化合物100μM1.0％DM630nm的吸光度。以未添加AA或tBHP为100并根据说明书中所记载的式子计算了细胞存[0380]在东京大学创药机构核心库(CoreLibrary)中，针对于各化合物包含结构类似DMEM培养基(DMSO0.5％)中对HepG2细胞添加50μM抗氧化物质并在37℃下孵育72小时之后具有抗氧化活性(HuML.,etal.,Nutr.Bioche在蒸馏水中包含4.0mM的FeSO4的溶液B。将溶液A、溶液B通过自动分液器(Multidrop4[0439]2)普雷斯特威克化合物库(Prestwickchemicallibrary)是汇集了已知具有药[0442]将作为萎缩型AMD模型小鼠广泛地使用的光照射模型用作试验模型而进行了试验。就被测化合物而言，对于通过与上述普雷斯特威克化合物库(Prestwickchemicallibrary)相关的筛选来分选的16个候选化合物，进一步缩小到据报道血视网膜屏障(BRB)[0456]奥氮平(2甲基4(4甲基1哌嗪基)10H噻吩并[2,3b][1,5]苯并二氮卓