免疫组化医学宣教专家讲座

一、原理与方法

免疫组织与细胞化学检验（Immunohistochemistryandimmunocytochemistryexamination)是利用免疫学原理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而深入经过级连放大，增加敏感性。最终用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白多肽、酶)等各种基因产物特异方法。

在病理学外检工作中可用于对不一样起源，HE难以诊疗肿瘤进行确诊和判别诊疗。

其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体)技术。免疫组化医学宣教专家讲座第1页EsophagealcarcinomaE-cad+inmembraneWuMing-Yaoetal.GFAP+incytoplasmofneurogliacell.TianDong-Ping,SuMinetal.Fos+innucleusImmunohistochemistry免疫组化医学宣教专家讲座第2页尖锐湿疣HPVIHC×200郭煜

免疫组化医学宣教专家讲座第3页原位癌IHC×400

胡彬

MCM2Ki67PCNA免疫组化医学宣教专家讲座第4页左)Ii（200/400)右)HLA-DR（200/400)双标染色结果免疫组化医学宣教专家讲座第5页双标染色Ii（400)DR（400)免疫组化医学宣教专家讲座第6页二、免疫组织化学技术主要步骤与惯用标识物

（一)主要步骤1．提取抗原(免疫原Immuno-gen);2．用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体)或免疫动物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体；3．纯化抗体；4．抗体标识组织切片；5．染色反应；6．观察结果。免疫组化医学宣教专家讲座第7页（二)惯用标识物1．酶为最惯用标识物。作为标识酶应含有以下条件：①底物是特异性，且易于显示；②酶反应产物稳定，不易扩散；③轻易取得纯酶分子且较稳定；④酶标识抗体后，不影响二者活性；⑤被检组织中不应存在内源性相同酶或其底物。惯用标识酶有辣根过氧化物酶（HRP)、硷性磷酸酶（AKP)、葡萄糖氧化酶（GOD)等。2．荧光素指在高能量光波激发下能产生荧光物质。惯用有异硫氰酸荧光素（FITC)、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC)。3．生物素其与卵白素亲和力显著高于抗原抗体结协力。4．金属标识物如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。免疫组化医学宣教专家讲座第8页三.惯用免疫组织化学染色方法（一)直接法将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标识在第一抗体上，以检验对应抗原。直接法含有特异性强优点，但敏感性差，花费抗体多。免疫组化医学宣教专家讲座第9页（二)间接法

先用荧光素或酶标识第二抗体，一抗为特异性抗体，二抗仅有种族特异性。特点:⑴预先标好二抗，较方便；

⑵比直接法敏感，但仍差。免疫组化医学宣教专家讲座第10页（三)PAP法与双PAP法：

既过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(PerixidaseAntiperoxidaseComplexMethod,PAP)

先将过氧化物酶（HRP)免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定多角形结构（PAP)。特点：⑴

敏感性较高；

⑵背景染色低（相对)；

⑶双PAP敏感性更高，但背景相对较重。免疫组化医学宣教专家讲座第11页（四)ABC法：1981年美籍华人许世明创造了ABC法Vector

既卵白素－生物素过氧化物酶复合物法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)

利用卵白素与生物素特有高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定百分比混合，形成一个复合物；同时先将二抗生物素化。免疫组化医学宣教专家讲座第12页１．如将卵白素换成链霉亲和素，则为：

ＳＡＢＣ法：(StreptAvidinBiotin-peroxidaseComplex)２．将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称：

ＬＳＡＢ法：labelledStreptAvidin-Biotin３．用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为：

Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidinPeroxidaseconjugataedmethod)特点:⑴敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍)；

⑵背景淡，链霉亲和素更加好；

⑶方法较简便，时间较短；

⑷应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。免疫组化医学宣教专家讲座第13页。

免疫组化医学宣教专家讲座第14页免疫组化医学宣教专家讲座第15页免疫组化阳性结果色度弱阳性:淡黄色中等阳性:棕黄色强阳性:棕黑色取决于:抗原量分布密度方法灵敏度免疫组化医学宣教专家讲座第16页免疫细胞化学阳性结果定位分布1.细胞膜阳性E-cad+inmembraneEsophagealcarcinoma免疫组化医学宣教专家讲座第17页免疫细胞化学阳性结果定位分布2.细胞浆阳性:GFAP+incytoplasmofneurogliacell.免疫组化医学宣教专家讲座第18页免疫细胞化学阳性结果定位分布3.细胞核阳性C-fos+innucleus免疫组化医学宣教专家讲座第19页免疫细胞化学阳性结果定位分布4.复合型:核+胞浆阳性注意:固定不及时，前处理过分能够造成假阳性免疫组化医学宣教专家讲座第20页免疫细胞化学阳性结果定位分布5.微绒毛型甲状腺、胃肠、胆管、卵巢腺癌微绒毛如上皮膜抗原免疫组化医学宣教专家讲座第21页免疫组化阳性结果定位分布1.局灶型2.片块型3.弥漫型4.网状型5.腺管型6.腔缘型7.菊团型免疫组化医学宣教专家讲座第22页免疫组化阳性结果强度Ⅰ<25%Ⅱ25~50%Ⅲ50~75%Ⅳ>75%免疫组化医学宣教专家讲座第23页四.免疫组织化学染色过程中需注意相关事项１．正确设置免疫组织化学对照

对照标准：首先对照第一抗体；替换对照要注意相同标准；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清楚，定位准确。阴性对照：（１)空白对照：用ＰＢＳ置换第一抗体；（２)血清替换对照：用同种动物正常血清代替第一抗体；（３)抑制对照：用未标识抗体先和对应抗原结合；（４)吸收对照：用纯化抗原反抗体先行吸收；阳性对照：用已知或已被试验证实为阳性组织；本身对照：利用组织切片内各种不一样组织成份作对照。免疫组化医学宣教专家讲座第24页2．假阳性反应：1)Non-specificreaction(非特异性反应)：边缘现象、皱折和刀痕、出血和

坏死等2)Endogenousperoxidase(内源性过氧化物酶}：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞

皮分泌物，以及一些富含过氧化物酶组织，如脑、肝等；3)Cross-reactive(交叉反应)：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应成份；4)Reagentconcentrationistoohighorinvalid试剂浓度过高或失效。

免疫组化医学宣教专家讲座第25页免疫组化医学宣教专家讲座第26页免疫组化医学宣教专家讲座第27页未封闭内源性过氧化物酶免疫组化医学宣教专家讲座第28页免疫组化医学宣教专家讲座第29页胃固有膜腺体免疫组化医学宣教专家讲座第30页3．假阴性反应：⑴

组织固定不妥或固定时间过长;⑵

抗体效价过低或久置失效;⑶

组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔;⑷DAB或H2O2浓度不妥。免疫组化医学宣教专家讲座第31页五、免疫组织化学在肿瘤诊疗和判别诊疗中应用

（一)在肿瘤诊疗中应用免疫组织化学染色原因：１在常规病理活检中,通常有５～１０％疑难病例不能明确诊疗。２形态结构相同肿瘤可为不一样组织起源（如未分化癌和恶性淋巴瘤)因而难于识别，给治疗带来困难。３一些转移性肿瘤经常缺乏特有组织学特征，因而无法确定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌)。４经过一些反应细胞增殖和与肿瘤恶性程度相关标识物帮助识别肿瘤良恶性。

免疫组化医学宣教专家讲座第32页（二)各种不一样组织及其肿瘤常见标识物：1．上皮组织及其肿瘤标识物：（１)存在于全部上皮细胞内标识物：

①桥粒蛋白（desmoplakin)

②细胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ)：一个中间丝蛋白（２)存在于大部分上皮细胞内标识物：

①角蛋白多肽（如ＣＫ１９)；

②组织多肽抗原（tissuepolypeptideantigen,ＴＰＡ)；

③上皮细胞膜抗原（epithelialmembraneantigen,ＥＭＡ)。（３)选择性存在于一些上皮细胞内标识物：

①角蛋白多肽（ＣＫ１３)，癌胚抗原（ＣＥＡ)；

②甲胎蛋白（ＡＦＰ)，乳铁蛋白（lecroferrin)；

③前列腺特异性抗原（ＰＳＡ)及激素类等。免疫组化医学宣教专家讲座第33页2．间叶组织（软组织)及其肿瘤标识物：（１)间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin)；（２)纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。①

抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ)；②

抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ)；③

溶菌酶（Lysozyme)。免疫组化医学宣教专家讲座第34页3．肌细胞及肌上皮肿瘤及其标识物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。⑴

结蛋白（Desmin)，最惯用，肌细胞分化最早标识；⑵

肌动蛋白（Actin)，属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不一样肌细胞、肌上皮细胞⑶

肌球蛋白（Myosin)，属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢)和Ⅱ型（快)收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。⑷

肌红蛋白（Myoglobin)，是心肌和横纹肌结合氧肌红蛋白，存在于分化成熟横纹肌中。免疫组化医学宣教专家讲座第35页４．内皮细胞肿瘤及其标识物：血管内皮肉瘤

⑴第Ⅷ因子相关抗原（FactorⅧ-relatedAntigen,Ｆ８)⑵

荆豆凝集素（UlexEuropaeus－1Lectin,ＵＥＡ－１)；⑶

ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。免疫组化医学宣教专家讲座第36页５．骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标识物：

⑴Ｓ－１００，Vimentin阳性;

⑵Lysozyme少数阳性。免疫组化医学宣教专家讲座第37页６．滑膜及间皮肿瘤及其标识物:双向分化，无特异性标识物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等都有可能阳性。免疫组化医学宣教专家讲座第38页７．周围神经肿瘤及其标识物：

⑴S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。⑵

髓性缄性蛋白（Myelinbasicprotein,MBA)；

⑶髓鞘相关蛋白（MAG)；

⑷层粘连蛋白（Laminin)。免疫组化医学宣教专家讲座第39页8．淋巴造血组织肿瘤及其标识物：(１)LCA（LeucocyteCommonAntigen，白细胞共同抗原)；(２)Ｌ２６、ＭＢ２、Ｋｉ－Ｂ３、４ＫＢ５－－标识Ｂ淋巴细胞；(３)ＵＣＨＬ－１、ＭＴ１－－标识Ｔ淋巴细胞；(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标识组织细胞；(５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen)－－标识Ｒ－Ｓ细胞；(６)ＬｅｕＭ１－－标识单核细胞、粒细胞。免疫组化医学宣教专家讲座第40页9．神经及神经内分泌肿瘤及其标识物：（１)胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,ＧＦＡＰ)：胶质细胞、室管膜细胞；（２)髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ)：少枝细胞；（３)神经细胞烯醇化酶（Neurunspecificenolosa,ＮＳＥ)：神经细胞；（４)神经微丝（Neurofilaments,ＮＦ)神经细胞、嗜铬细胞、副节细胞、ＡＰＵＤ瘤；（５)嗜铬素Ａ（ChromograninＡ)：神经内分泌肿瘤。（６)其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin、Serotonin等。免疫组化医学宣教专家讲座第41页免疫组织化学最突出优点是能在微观世界原位地确定组织及细胞结构化学成份因为其方法简便且可重复性强,当前已得到广泛应用,并正继续向着更微细、更准确原位分子杂交和免疫电镜方向发展,向着分子病理学领域推进。免疫组化医学宣教专家讲座第42页免疫组化医学宣教专家讲座第43页免疫组化医学宣教专家讲座第44页免疫组化医学宣教专家讲座第45页免疫组化医学宣教专家讲座第46页免疫组化医学宣教专家讲座第47页免疫组化医学宣教专家讲座第48页免疫组化医学宣教专家讲座第49页免疫组化医学宣教专家讲座第50页细胞角蛋白胃腺癌免疫组化医学宣教专家讲座第51页免疫组化医学宣教专家讲座第52页免疫组化医学宣教专家讲座第53页免疫组化医学宣教专家讲座第54页免疫组化医学宣教专家讲座第55页免疫组化医学宣教专家讲座第56页送检（肉眼)：“胃体”部分胃壁切除标本，15×6×5cm，切开见1个圆形肿物，大小10.5×6×5cm，切面灰白、质地稍硬。图8图9图10免疫组化结果：肿瘤细胞Vimentin（+)图11免疫组化结果：肿瘤细胞（CD117+)免疫组化医学宣教专家讲座第57页免疫组化医学宣教专家讲座第58页免疫组化医学宣教专家讲座第59页免疫组化医学宣教专家讲座第60页免疫组化医学宣教专家讲座第61页免疫组化医学宣教专家讲座第62页免疫组化医学宣教专家讲座第63页抗原修复

从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定术就像一把双刃剑：

福尔马林（10%甲醛溶液)是一经典常规病理诊疗用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。免疫组化医学宣教专家讲座第64页抗原修复

福尔马林固定甲醛反应造成组织蛋白质发生一系列反应,最终造成蛋白质交联

这种特殊蛋白质交联依赖于氨基酸侧链参加

这种蛋白质交联可造成蛋白质变性,降低或丢失免疫活性反应。免疫组化医学宣教专家讲座第65页抗原修复

纵观历史，福尔马林固定并不适合于蛋白质免疫组化检测，只有极少例外。

但这个问题已被Shietal.等人所处理，当他们发觉煮沸组织（“抗原修复”)能够恢复许多抗体免疫反应。

综合了其它组织病理学抗原修复技术，极大地促进了免疫组化在临床应用。

当前绝大多数经过福尔马林固定处理过组织样本经过抗原修复方法都能够恢复抗原免疫活性而被检测。免疫组化医学宣教专家讲座第66页抗原修复

从概念上讲,福尔马林固定后热修复免疫反应这一发觉是惊人、反常态。就像煮一个鸡蛋,蛋白质暴露于高温下发生了不可逆转变性,其蛋白免疫活性也会随之减弱。

有学者解释沸腾也能够从相反各种机制包含反转由福尔马林所介导蛋白质交联,从而解释了为何沸腾组织切片能够恢复免疫反应活性。

即使福尔马林介导蛋白质交联能够在抗原修复中被打开,还并不清楚在如此猛烈处理后蛋白质怎样恢复其天然构象并恢复其免疫活性。免疫组化医学宣教专家讲座第67页抗原修复

以前研究揭示甲醛能够与蛋白质发生各种化学反应。然而,从应用诊疗试验室角度,我们重点关注甲醛固定造成抗原丢失,修复怎样使抗原活性重新展现化学反应机理。

所以重点阐述肽抗原表位模型系统研究怎样固定和抗原修复影响抗体与他们表位结合能力很主要

此研究独特方面是使用肽链抗原表位,而不是细胞、部分组织或整个蛋白,聚焦研究破译抗原修复机制还原路径。免疫组化医学宣教专家讲座第68页抗原表位--定义抗原表位，又称抗原决定簇(antigenicdeterminant，AD)，是指抗原分子中决定抗原特异性特殊化学基团，因而表位代表了抗原分子上一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面抗原受体结合。严格说来，抗体特异性是针对表位而不是针对完整抗原分子。抗原经过抗原表位与对应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引发免疫应答;抗原也借表位与对应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。抗原表位性质、数目和空间构型决定抗原特异性。

免疫组化医学宣教专家讲座第69页

抗原分子以其B细胞表位与抗体分子抗原结合部位发生互补性结合A.抗原--抗体复合物立体构象;B.采取电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子相互作用仅发生在抗原分子B细胞表位和抗体分子抗原结合部位之间，二者展现结构互补。C.抗体互补决定区与抗原表位结合示意图C免疫组化医学宣教专家讲座第70页普通情况下，一个多肽表位含5~6个氨基酸残基;一个多糖表位含5~7个单糖;一个核酸半抗原表位含6~8个核苷酸。抗原表位大小与对应抗体抗原结合部位相适合。一个抗原表位特异性由组成它全部残基共同决定，但其中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残基被称为免疫显性基团。免疫组化医学宣教专家讲座第71页抗原表位--分类覆盖型和非覆盖型表位

一些抗原分子表面,不一样表位之间相对分离,各自结合特异性抗体,互不影响,这类表位被称为非覆盖型表位。

若某一表位与对应抗体结合会影响另一表位与抗体结合,这类表位称为覆盖型表位。功效性和隐蔽表位

位于抗原分子表面表位易被对应淋巴细胞所识别,即含有易靠近性,可直接开启免疫应答,故称为功效性表位。

存在于抗原分子内部表位无直接触发免疫应答功效,称为隐蔽表位。若经过理化原因处理抗原,使其结构发生改变,内部隐蔽表位被暴露,可能成为新有功效表位。

免疫组化医学宣教专家讲座第72页按表位结构不一样,分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。连续性表位又称线性表位,是由肽链上次序连续氨基酸组成通常这种结合比较弱,因为小肽并不含完整天然蛋白构象,在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位一部分。对其研究依赖于多肽固相化学合成技术。后者又称构象型抗原表位,是由那些空间邻近但次序上不连续氨基酸组成。

分类免疫组化医学宣教专家讲座第73页

按照与抗原受体细胞结合不一样,分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。分类特征T细胞表位B细胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需无需表位性质主要是线性多肽天然多肽、多糖、脂多糖、有机化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15个氨基酸，5-7个单糖或5-7个核苷酸表位类型线性表位构象、线性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面免疫组化医学宣教专家讲座第74页研究意义表位是蛋白质抗原性基础，研究蛋白质抗原表位，对于设计含有免疫原性和中和活性多肽、新型疫苗分子及新型诊疗试剂含有较大意义。应用:多在诊疗与疫苗研究中,尤其是在制作良好特异性诊疗试剂盒中更为主要。免疫组化医学宣教专家讲座第75页免疫组化医学宣教专家讲座第76页主要参考文件

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