新高考2023届高考生物新人教版一轮复习讲义第10单元第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序

第6课时基因工程的基本工具和基本操作程序

［课标要求］1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三

种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载

体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，

进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应（PCR）扩噌DNA片段并完成电泳鉴定，

或运用软件进行虚拟PCR实验。

考点一重组DNA技术的基本工具

■梳理归纳夯实必备知识

1.基因工程的概念

⑴手段：按照人们的愿望,通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。

⑵目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

⑶水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组D\A技术。

柘展】基因工程的理论要出

①基因是控制生物性状的遗

传物质的结构和功能单位

外源若因在受

②遗传信息的传递都遵循中

体细胞内表达

心法则

③生物界共用一套遗传窖码

?重组/NA：一、转录f——I

1型译蛋白质

制一（性状）

:①DNA的基本组成单位都是

:四种脱氧核普酸

五蠢向理论:②DNA分子都遵循碱基互补

基因拼接J基玷：配对原则

:③双链DNA分子的空间结构

:都是规则的双螺旋结构

2.重组DNA技术的基本工具

⑴限制性内切核酸酶（也称"限制酶"）

主要来fl原核生物

电盘分离的限制物有虹种

识别双链DNA分子的特定核件酸序列

限特点

制

（专一性）使每一条链中特定部位的磷酸二酯

解键断开

'—/

鲤■断开两个核件酸之间的磷酸二弗键

上经~产生黏性末端和平末端

（2）DNA连接酶

作用将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制

酶切开的两个核件酸之间的磷酸二酯键

9-E.coliDNAJ源,大肠杆菌

阖［类型I连接酹也通-只“缝合”黏性末端

T4DNA产LT」噬菌体

连接一|功.,“缝合”黏性末端和平

末端

（3）载体

种类质粒（常用载体）：环状双链DNA分手

崛菌体、动植物病毒等

有一个至多个限制胸切割位点

携带外源DNA片段的质粒进入受体细

载特点胞后,能在细胞中进行门我复制,或整

体

合到受体DNA上,随受体DNA同步复制

常有特殊的标记基因,便于重组DNA

分子的筛选

携带外源DNA片段进入受体细胞

■教材隐性知识

（1）源于选择性必修3P「"旁栏思考"：①原核生物中存在限制函的意义是什么？

提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止9味病原物的危害。

②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNzX分子？

提示限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序

列已经被修饰。

⑵源于选择性必修3%"旁栏思考"：DNA连接酶和DNA聚合酶丕星（填"是"或"不是"）

一回事。原因是：①DNA连接的连接的是两个D\A片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苜

酸连接到已有的DNA片段上。②DM聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接

酸不需要模板。

延伸应用】图解限制酶的选择原则

PstISmaIPstI

Sma1抗病EcoRI

基因

甲

⑴不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstI,而不选择S.I。

（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所

以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择S.I.

⑶确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstI；

为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，

如图甲也可选择PstI和EcoRi两种限制酶。

■考向突破强化关键能力

考向一限制酶和DNA连接酶

I.（2022・长春市高三期中）下表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位

点，由此推断以下说法中，错误的是（）

限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点

Bcink\IGlGATCCKpnIGGTA0C

及•苏IClAAHCSa43AI*GATC

HindHGTY^RACSmaICCC^GGG

注：Y为C或T,R为A或G。

A./"〃dU、MI两种限制酶切割后形成平末端

B.Sa心AI限制酶的切割位点在识别序列的外部

C.原川I和Sau3AI两种限制酶切割后形成相同的黏性末端

D.一种限制酶一定只能识别一种核甘酸序列

答案D

解析"indU、乱阳1两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A项正确3A

I限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B项正确；痴加I限制酶识别GGATCC

序列，Sau3AI限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC,C项正确；Hind

II能识别GTCAAC,也能识别GTTAAC,D项错误。

2.第三代疫苗一DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适宜的质粒

（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机

体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是密/口、&加I和Sag

Io下列分析错误的是（）

A.构建DNA疫苗时，可用废/口和SaRAI切割目的基因和质粒

B.图乙中只用切血I切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团

C.用比苏I切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物

I）,抗原基因在体内表达时不需要解旋酶

答案C

解析从图甲看出，用反床I切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中氏。RI切口对

接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA,C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录

时不需要解旋酶，在RM聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。

考向二基因工程载体的应用

3.质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是()

A.质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中

B.细菌的基因只存在于质粒上

C.质粒为小型环状DNA分子

I),质粒是基因工程中的重要工具酶之一

答案C

4.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是()

A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒

B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体

C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子

D.作为我体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因

答案I)

解析在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造

的常错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，

B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错

误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DXA进行鉴定和选择的标记基因,而且能在受体

细胞中复制并稳定保存,D正福。

考点二基因工程的基本操作程序

■梳理归纳夯实必备知识

1.目的基因的筛选与获取

(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等

的基因。

（2）筛选合适的目的基因

①从相关的已知结构和功能邈的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

②利用序列数鲤和序列比对工具进行筛选。

（3）目的基因的获取

①人工合成目的基因。

②常用&L特异性地快速扩增目的基因

【归纳总结】PCR技术和DNA复制的比较

DNA复制）

细版内（主要是

细胞核内）

解旋酶催化

解族海、

DNA聚合科

细胞内温和条件

一DNA分子

均需要模板（DNA双链）、原料

（四种脱氧核昔酸）、能量

【易错提醒】（1）在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTI\dTTP、dCTP），既可作为

合成D\A子链的原料,又可为DXA的合成提供能量。

（2）引物既可以是DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物,

一般为RXA片段。

（3）真核细胞^细菌的DNA聚合酶都需要蛇;激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加

（4）PCR扩增过程中的循环图示与规律

,,—*5；uDumnniB-r3,

一抑nnnn运二¥

15加aL.海哩：

/

,/,3,一加垩j3-'面鸣

.；Ji®hlHHWIWIII0吟

―7r•:',Eniieb

-5麻而皿畦,

\通/二勺，£Unnnrnirmi,

畔一E

3,一团嘤

一目标序列

——序列

口引物A

口引物B一乳:循环2：,需环3；

变性—复性T•是仲丈性-复性一足伸变性-复性一延伸

循环次数123n

DNA分子数248

含引物A（或

B）的DNA分子1372"-1

数

同时含引物

A、B的DNA分0=2'-22=2?■26=2、-22"-2

子数

共消耗的引物

2=2，+，-26=22+，-214=2，+，-22/，+，-2

数量

■教材隐性知识-

源于选择性必修3%"相关信息"：仇抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠

道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因

此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。

2.基因表达载体的构建一基因工程的核心

（1）目的：使目的基因在受体纽胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因

能够表达和发挥作用。

（2）基因表达载体的组成及作用

目的基因：编码蛋白质的基因或具TF

调控作用的因子

虚云》应动工：RNA聚合酶识别和结合的部位;

限制原能驱动基因转录出mRNA

飞二终止子：转水的终点,在转录过程中起

调控作用

标记基因:供币:组DNA分子的筛选

⑶构建过程

质粒分子

、DNA/

‘同一种限制降或地产生相同

末端的限制梅切割

一个切口；两个黏性末端两个切口；获得目的基因

、——,

[DNA连接聃

市:组DNA分子（重组质粒）

易错提醒】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比

项目启动子终止子起始密码子终止密码子

本质DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶识别和

使转录在所需要的翻译的起始信号翻译的结束信号

功能结合的部位，驱动

地方停下来（编码氨基酸）（不编码氨基酸）

基因转录出mRNA

3.将目的基因导入受体细胞

生物种类植物动物微生物

农杆菌转化法、花

常用方法显微注射法量1处理法

粉管通道法

受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞

将目的基因插入Ti将含有目的基因的表达载Ca。处理细胞一细胞处

转化过程

质粒的T-DNA中一体提纯一取卵（受精卵）一于一种能吸收周围环境

农杆菌一导入植物显微注射一受精卵发育一中DNA分子的生理状态

细胞一整合到受体获得具有新性状的动物一基因表达载体导入

细胞的染色体DNA

上一表达

辨析1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

此处“转化"与肺炎链球菌转化实验中的"转化”含义相同，实质都是基因重组。

2农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T

-DNA±,第二次拼接非人工操作是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色

体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入非人工操作

是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

3农杆菌特点

①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。

②农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵

染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

4.目的基因的检测与鉴定

分子水平检测个体生物学

水平鉴定

■考向突破强化关键能力

考向一目的基因的获取

5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错

误的是（）

A.PCR用的DNA聚合酶是一和耐高温酶

B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶

C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则

D.延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苗酸

答案D

6.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素翦基因进行合理性改造，其过程

如下图所示。下列分析不正碓的是（）

引物a引—c

PCR1|引物b痛d

、工PCR2

产物AB________________、

[①产物CD

AB上链：

CD下链

突变位点上、

突变产物AD

|PCR3

大垃突变产物AD

A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果

B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基

C.①过程需要先加热至90。（：以上后再冷却至50℃左右

D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD

答案I）

考向二基因工程的基本操作程序

7.（2022•云南高三联考）戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2.基因编码的结构蛋白（pORF2）

位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达

PORF2,制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是（）

戊型肝炎病毒④

大肠杆萧

A.过程①需要的酶是R\A聚合酶，原料是A、l\G、C

B.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒

C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DXA分子的生理状

态

D.过程⑥大量制备P0RE2蛋日前应做相应的检测与鉴定

答案I)

解析戊型肝炎病毒是一种RNA病毒,过程①是以病毒RNA为模板合成DNA,获取目的基因

的过程,需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核甘酸,A项错误；启动子是一段有特殊结

构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种

或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达P0RE2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细

胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，R项错误；将目的基因导入微生物

细胞的方法是Ca&处理法，需要用Ca0处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使

其处于一种能吸收周围环境中DXA分子的生理状态，C项错误。

8.某质粒上有Sail、〃/阂皿、Bank\I三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和

抗氨莘青霉素基因。利用此质应获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：

HindUIBamWIsalI

含抗盐基

因的DNAf-

salI抗盐基因

salI

重组质粒

抗四环素基因

抗原节青H质粕

BamWI

'雅索加氏

HindHI

农杆菌

愈伤组织烟草细胞

转法因抗盐

烟草幼苗

⑴将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是

；该质粒含有一E蜡殊的DNA片段，称为该方法

中农杆菌的作用是

(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用必力din和Sal

I两种酶的质是___________________________________________________________________

(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨节青霉素和四环素

的培养基上都可以生长繁殖，衣杆菌中是否已含有目的基因？(填"是"或"否")。

为什么？

(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种

到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含夙茉

青霉素)和C(含四环素和氨羊青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长

状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出

来。

含四环索和含皴节

氨节青布素青霉素

答案(DTi质粒T-DNA感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上

⑵防止目的基因自连和质粒目连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率(3)否含

有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏

(4)如图所示

含四环素和含氨苇

女节吉霉素青褥素

考点三DNA的制邮与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定

■基础提炼通读实验内容

1.DNA的粗提取与鉴定

⑴基本原理

①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其

他成分。

②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于噩；DNA能溶于2moiL」的WC1溶液。

③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二茎胺试剂会呈现蓝色。

(2)操作流程

取材、研磨

在漏斗中垫上纱布，将研磨液过

灌到烧杯中,在4ct冰箱中放世

去除滤液中

几分钟后（或直接将研磨液倒入

杂质

塑料离心管中.离心5min）,再

取上清液

在上清液中加入等体积的、预冷

的体积分数为绊的酒精溶液.

静置2~3min,用玻璃棒沿一个

DNA的折出方向搅拌.卷起丝状物.用猿纸

吸去上面的水分（或将溶液倒入

塑料离心管中,离心5min.弃上清

液,将管底的沉淀物晾干）

将丝状物或沉淀物用2mol/L的NaCI

溶液溶解,然后加入二苯胺试剂.

DNA的签定

混匀后置于遮K中加热5min,冷

却后观察颜色变化

注意事项加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA

分子不能形成絮状沉淀。

2.DNA片段的扩增及电泳鉴定

⑴实验基5出

①PCR原理：利用了D\A的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。

②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。

③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、

DNA分子的大小和构象等有关.

（2）PCR实验操作步骤

出7八_用微址移液器按照配方或PCR试剂盒的

也巡尸说明书.向微lit高心管中依次加入各组分

画］一款严离心管的盖子

诲~加将微量闵心管放在离心机里，离心约10s,

回匕厂使反应液集中在管的底邺

行『_设置好PCR仪的循环程序,将装有反应液

回㈣-的微址离心管放在PCR仪中进行反应

（3）DNA的电泳鉴定

琼脂糖凝胶制备：根据待分岗DNA片段的

大小,用电泳缓冲液配制琼脂辘溶液（•般

质垃分数为0.8%~1.2%）

凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒入模具,

排入梳子形成加样孔.凝胶溶液完全凝固后

电投出梳子,将凝胶放入电泳槽内

泳

鉴点样：加电泳缓冲液.然后用微地移液管将

定扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液的

混合液加入加样孔,一孔加标准参照物

电泳：接通电源，设定好电压，一般为

1~5V/cm.进行电泳

观察：在紫外灯下观察和照相

注意事项1为避免外源DXA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸储

水等在使用前必须进行宣矗遹处理。

2每吸取一种试剂后，移液器上的枕头都必须更换。

3电泳时,DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子

的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。

■考向突破强化关键能力

考向一DNA的粗提取与鉴定

9.下列利用洋葱进行"DNA的粗提取与鉴定"实验的叙述，正确的是（）

A.将研磨液加入切碎的洋葱,充分研磨后过滤，要弃去上清液

B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DXA的方法可去除部分杂质

C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损

D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化

答案B

解析将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去沉淀物，收集上清液，A错误；

DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理可将DXA与蛋白质

进一步分离，进行DNA的粗提取，B正确；用塑料离心管可减少提取过程中DNA的损失,C

错误；将白色丝状物溶解在"C1溶液中，加入二苯胺试剂后，将试管置于沸水中加热5min,

观察颜色变化，I）错误。

10.下图是"DNA的粗提取与鉴定"实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的

是（）

A.选用植物细胞提取DNA时需先研磨破碎细胞

B.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显

C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精

D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺试剂出现蓝色

答案D

解析图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面，可能导致加热不充分，试管2

中蓝色变化不明显，B正确；图2试管1起对照作用，目的是证明沸水浴下物质的量浓度为

2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺•式剂不会出现蓝色，而DNA遇二去胺试剂出现蓝色，D错误。

考向二DNA片段的扩增及电泳鉴定

11.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关"DNA片段的扩增及电泳鉴定"实

验的相关叙述，错误的是（）

A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸储水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理

B.PCR利用了DNA的热变性原理

C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换

答案C

解析PCR所用缓冲液和醒从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲

液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。

12.下列有关电泳的叙述，不正确的是（）

A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程

B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率

C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动

I）.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定

答案C

重温高考真题演练

1.（2019•江苏,10）下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（）

A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近

B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂

C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA

I）,用二苯胺试剂鉴定DXA需要进行水浴加热

答案A

解析哺乳动物（如兔）成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA,故兔血不

宜作为该实验的实验材料，八错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且

沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预

冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA,C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈

现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，I）正确。

2.（2020•北京，12）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金

属转运蛋白（〃物3基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转

基因杨树苗中是否含有导入的〃捌3基因，同时避免内源/m基因的干扰，在进行PCR扩增

时，应选择的引物组合是（）

左边界①③右边界

)

杨树内源二杨树内源

启

终

止

DNA动DNA

|基因子

子

-

②④

（注：①、②、③、④表示用物）

A.①+③B.①+②

C.③+②D.③+④

答案B

解析引物①扩增的片段含有启动子和〃捌3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②

扩增的片段既含有启动子,又含有〃物3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白（〃口⑶基

因与外源高效启动子连接，导人杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导

入的〃物3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和MM3基因序列，应选择

的引物组合是①+②，B正确.

3.（2021・山东，25）人类丫基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点

结合BCL11A蛋白后，丫基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对Y基因表达

的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了Y基因上游不同长度的片段，

将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCU1A蛋白结合位点的具体

位置。相关信息如图所示。

注：

调控序列F1-F7,R:引物

,基因

及启动子P:雌激素诲导下发

挥作用内启动子

一米制薛识别序列及

切割位点：

Xho

।MunI'SaiI终止千Mun।.c'AATTG

载体的部终止荧光蛋BCLIIAXhoI:C'TCGAG

分结构子门基因P基因

EcoR1:CAATTC

T彭夕多MlSalI:C*TCGAC

NheIIMunIEc曲IXhoI终止子NheI:G'CTAGC

（D为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别

序列。据图可知，在Fl~F7末端添加的序列所对应的限制酶是，在R末端添加

的序列所对应的限制酶是_____________本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程

共需要种酶。

（2）将构建的载体导入除去应。"基因的受体细胞，成功转化后，含Fl~F6与R扩增产物

的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R

扩增产物的受体细胞无荧光的原因是

⑶向培养液中添加适量的雌激素，含Fl~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含

F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若丫基因上游调控序列上与引物序列所对应的位

置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCLI1A蛋白结合位点位于

理由是________________________________

答案（l）Sa/I历乐I6（2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表

达（3）引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判断户~

1-1与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于囱所对应调控序列的下游（右侧）F5~

F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所

以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上

解析（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有

启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的K

端与荧光蛋白基因中限制酶业〃力识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导

荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限

制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有物〃I和Xhol

的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶，血〃I和助。I所识S1L故

应该选用添加限制酶应苏I和限制酶Sail识别序列，由图中可知，限制酶.痴1识别并切

割后的黏性末端与限制酶I识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对

应的限制酶是反或I，在Fl~F7末端添加的序列所对应的限制酶是Sall；荧光蛋白基因

中含有限制酶笈流I的识别位点，故对载体使用限制酶例〃I和助。I切割。综上所述，对

载体使用限制酶MunXhol切割，对犷增后的产物用限制酶Ec而I和限制醐Sall切割，

然后在DNA连接酶的催化作用下,连接形成重组载体；产物扩增中需要使用河㈤NA聚合酶

催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是

左如NA聚合酶、限制酶反流工、限制酶％/1、限制酶加〃I、限制酶后。I、INA连接酶。

⑵受体细胞中已经除去BCLUA基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光

蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，7能完成荧光蛋白基因的转录

过程；含Fl~F6与K扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细抱有荧光，含F7与R扩增产

物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。

⑶向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的以2/〃基因表达，产生BCL11A蛋白，

BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含Fl~F4与R扩

增产物的受体细胞不再有荧光,则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序

列上；含F5-E6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCI.11A蛋白结合位点在引物

F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上

所对应序列之间的区段上。

五分钟查落实

一、易错辨析

1.限制酶也可