细胞培养及其在肿瘤研究中的应用

细胞培养

及其

在肿瘤研究中应用

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用1/32一、细胞培养基础知识

（一)概念

细胞培养是在严格无菌操作条件下，从机体组织分离出细胞，在体外用无菌培养液及孵箱模拟机体生理条件，进行细胞离体培养，使之存活和繁殖。其关键是要求严格无菌和培养条件。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用2/32

（二）培养细胞特征1.细胞生长方式及类型(1)贴附生长型细胞

能附着于支持物表面生长细胞。

上皮细胞型：形态类似上皮细胞各种培养细

胞，起源于外胚层及内胚层。

成纤维细胞型：起源于中胚层。

（2）悬浮生长型细胞

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用3/322.培养细胞生长过程

（1）单个细胞生长过程

细胞周期：

一个母细胞分裂结束后形成细胞至其下一次再分裂结束形成两个子细胞这段时期，可分为间期和M期（分裂期）两个阶段。

细胞周期=间期+M期=G1期+S期+G2期+M期细胞培养及其在肿瘤研究中的应用4/32（2)细胞系生长过程

细胞系

有限（生长)细胞系细胞培养及其在肿瘤研究中的应用5/32细胞培养及其在肿瘤研究中的应用6/32①

原代培养或初代培养期

为新鲜组织自体内取出后首次在体外培养至第一次传代时间,普通约1-4周。原代培养是建立各种细胞系第一步。

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用7/32

原代培养细胞刚才离体，生物学特征未发生很大改变，仍含有二倍体遗传物性（二倍体核型)。原代培养细胞与体内对应细胞性状相同，更能代表其起源组织细胞类型及组织特异性质，适合作药品测试、细胞分化等试验研究。

原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格对比性试验研究，还需对细胞进行短期传代后进行。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用8/32②

传代期（细胞系阶段)

将原代细胞分开接种至2个或更多新培养器皿中，即传代。每进行一次分离再培养为传一代。这种传代大约数天至1周左右即可重复一次，连续数月，此即细胞系。

传代期细胞增殖旺盛，普通依然是二倍体核型，并保留原组织细胞很多特征。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用9/32③

衰退期

增殖变慢

停顿分裂

传代中偶然可有极少后代细胞能经过“危机期”，取得不死性而含有持久或无限增殖能力，这种细胞即称为无限细胞系或连续（生长)细胞系。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用10/32（3)每代细胞生长过程细胞培养及其在肿瘤研究中的应用11/32

（三）细胞培养基本设备和材料1.细胞培养室设置

无菌操作

孵育

制备

清洗

消毒灭菌处理

储藏细胞培养及其在肿瘤研究中的应用12/322.基本设备

（1）

超净工作台

①水平式或外流式

②垂直式或侧流式

（2）

二氧化碳培养箱

（3）

倒置显微镜细胞培养及其在肿瘤研究中的应用13/32（4)

惯用消毒培养器皿

①玻璃培养瓶、培养皿

②塑料培养瓶、培养皿

③微载体

④涂膜材料

⑤中空纤维细胞培养及其在肿瘤研究中的应用14/32（5)培养液

①培养基

天然培养基：胎牛血清

新生牛血清

灭活处理：加温到56℃，30min5%血清保护细胞10%血清细胞生长15%血清融合及克隆20%血清冻存细胞细胞培养及其在肿瘤研究中的应用15/32合成培养基：

基本成份

惯用种类RPMI1640Eagle培养液（MEM)BME（BasalEagleMedium)DMEM（DulbccoMEM)细胞培养及其在肿瘤研究中的应用16/32

②培养用液

水、平衡盐溶液、消化液、缓冲液、维生素液及用于检测各种染液等。（6)

细胞冷冻储存器

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用17/32二、肿瘤细胞培养和应用

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用18/32（一）细胞培养在肿瘤研究中应用及意义1.探索各种化学、物理和生物因子

在肿瘤生命活动中作用（单一与综

合作用）及过程。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用19/322、提供基础，便于在分子生物学水平上对

细胞进行各项研究，尤其因为可取得纯

均一性细胞，故可进行分子杂交、电

泳等研究。3.便于研究肿瘤细胞结构和功效，尤其

便于研究单个细胞结构。其中包含扫

描与透射电镜研究。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用20/324、培养细胞可长久保留及传代，方便观察

肿瘤细胞遗传行为改变。5.观察研究肿瘤生物学行为及机制，如

侵袭转移。6、建立肿瘤细胞体外分化诱导模型。7、可用于快速筛选抗癌药品以及用于致癌

物、促癌剂、抗促癌剂研究。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用21/32（二）

肿瘤细胞取材和培养1.肿瘤细胞取材

（1）实体瘤手术标本取材注意事项

①切取未经任何治疗和没有坏死标本

②无菌操作处理

③标本及早浸入无血清培养液保鲜并及

时进行培养细胞培养及其在肿瘤研究中的应用22/32（2)

体腔液标本取材（3)

血液标本取材

以外周血中肿瘤细胞为培养对象抗

凝↓去除RBC↓离心↓

悬浮培养细胞培养及其在肿瘤研究中的应用23/322.培养方法

（1）组织块培养法

将组织剪切成小块后，接种于培养

瓶。

适合于组织量少原代培养。

细胞培养及其在肿瘤研究中的应用24/32（2)

酶消化法

结合生化和化学伎俩把已剪切成较小体积组织深入分散方法，取得细胞制成悬液可直接进行培养。

适合用于培养大量组织，原代细胞产量高。

胰蛋白酶法

胶原酶法EDTA法（二乙烯四乙酸二钠)

（3)机械分散法

直接用机械方法进行组织细胞分散。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用25/323.传代肿瘤细胞培养注意事项

（1）当癌细胞还没有生长到足以覆盖培

养瓶壁大部分表面以前，应该耐

心等候，不要急于传代。

（2）从原代开始到10代左右期间，操作

慎重，确定适合该细胞培养方法

（3）在早期传代培养，应适当提升接种

细胞密度。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用26/32（4)对增殖能力极低细胞，可依据细胞

种类不一样选取不一样促生长物质。应

用喂养细胞。（5)对癌细胞分离，进行选择性传代，消

除成纤维细胞。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用27/32（三）培养中细胞转化及肿瘤细胞

转化（transformation）

恶性转化（malignanttransformation）

常见特点：1、取得无限增殖能力或称之为永生性

（immortality）2、产生了致癌性3.生长密度依赖性（density-dependence）减低细胞培养及其在肿瘤研究中的应用28/324、停泊依赖性（anchorage-dependence）丧失5.血清依赖性降低6、其它

形态改变、核型改变，对外源凝集素如ConA凝集能力增强，对化学致癌物毒性作用抵抗力增强，纤维粘连蛋白（fibronectin）合成降低以及胞质内cAMP水平降低等。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用29/32（四)培养肿瘤细胞生物学判定

目标：

①证实培养细胞是否来自原来癌瘤细胞；

②说明肿瘤组织类型；

③描述肿瘤细胞生物学特征。细胞培养及其在肿瘤研究中的应用30/32

惯用培养肿瘤细胞生物学检验项目以下：1、组织起源