大肠杆菌粘附素faeG基因在乳酸乳球菌表面表达的关键技术与应用潜力探究

大肠杆菌粘附素faeG基因在乳酸乳球菌表面表达的关键技术与应用潜力探究一、引言1.1研究背景仔猪腹泻是养猪业中常见且危害严重的问题，给养猪业带来了巨大的经济损失。据统计，我国每年因仔猪腹泻导致的经济损失高达数十亿元。大肠杆菌是引发仔猪腹泻的主要病原菌之一，其中产肠毒素大肠杆菌（ETEC）尤为突出。ETEC能产生多种毒素和黏附素，通过黏附在仔猪肠道上皮细胞表面，进而产生毒素，破坏肠道正常生理功能，引发腹泻。这种疾病不仅导致仔猪生长发育受阻、饲料利用率降低，还会显著提高仔猪的死亡率。在一些卫生条件较差、管理不善的养殖场，仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率甚至可高达80%以上，死亡率也能达到30%-50%。在ETEC致病过程中，faeG基因发挥着关键作用。faeG基因编码的FaeG蛋白是ETEC菌毛的主要亚单位，负责介导细菌与仔猪小肠上皮细胞表面受体的特异性结合，是ETEC在肠道内定植的关键因素。若没有FaeG蛋白的黏附作用，ETEC就难以在肠道内立足，也就无法产生毒素并引发腹泻。研究表明，缺失faeG基因的ETEC菌株对仔猪肠道的黏附能力显著下降，致病性也大幅减弱。因此，深入研究faeG基因及其编码蛋白的特性，对于揭示ETEC的致病机制、开发有效的防控措施具有重要意义。传统上，预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻主要依赖抗生素。然而，随着抗生素的长期大量使用，耐药菌株不断涌现，导致抗生素的治疗效果越来越差。同时，抗生素残留问题也严重威胁着食品安全和人类健康。据报道，在一些养殖场中，大肠杆菌对多种常用抗生素的耐药率已超过50%。此外，欧盟等地区已经全面禁止在动物饲料中添加抗生素促生长剂，这使得开发安全、有效的替代方法成为当务之急。乳酸乳球菌作为一种革兰氏阳性益生菌，具有良好的生物安全性和益生特性。它能够在肠道内定殖，调节肠道微生态平衡，增强机体免疫力。将外源基因导入乳酸乳球菌并使其在表面表达，构建基因工程益生菌，为解决仔猪大肠杆菌性腹泻问题提供了新的思路。通过将faeG基因在乳酸乳球菌表面表达，有望开发出一种新型的口服疫苗或微生态制剂，既能避免抗生素的弊端，又能有效预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻。1.2研究目的与意义本研究旨在实现大肠杆菌粘附素faeG基因在乳酸乳球菌表面的高效表达，为预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻提供新的策略和方法。具体而言，通过基因工程技术，将faeG基因导入乳酸乳球菌，并使其在乳酸乳球菌表面正确表达FaeG蛋白，然后对表达产物的生物学活性和免疫原性进行深入研究。从预防仔猪大肠杆菌性腹泻的角度来看，本研究成果具有重要的应用价值。若能成功构建表达faeG基因的乳酸乳球菌工程菌，将其作为口服疫苗或微生态制剂应用于养猪生产中，可有效刺激仔猪机体产生特异性免疫反应，提高仔猪对ETEC的抵抗力，从而降低仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率。这不仅能减少因疾病造成的经济损失，还能提高猪肉的产量和质量，保障养猪业的可持续发展。从开发新型疫苗的角度而言，本研究为疫苗研发开辟了新的途径。传统疫苗存在生产工艺复杂、成本高、安全性等问题，而基因工程益生菌疫苗具有生产成本低、安全性高、免疫效果好等优势。通过将faeG基因在乳酸乳球菌表面表达，有望开发出一种新型的基因工程益生菌疫苗，为动物疫苗领域的发展提供新的技术和产品。从推动基因工程益生菌发展的层面来说，本研究丰富了基因工程益生菌的研究内容和应用范围。基因工程益生菌是当前微生物领域的研究热点之一，通过将不同的功能基因导入益生菌中，可赋予益生菌更多的功能。本研究成功实现faeG基因在乳酸乳球菌表面表达，为今后将其他有益基因导入乳酸乳球菌或其他益生菌中，构建具有多种功能的基因工程益生菌奠定了理论和技术基础。1.3研究方法与技术路线本研究主要采用以下方法：首先，通过PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增faeG基因，并对扩增产物进行测序验证，确保基因序列的准确性。在引物设计时，充分考虑基因的特异性和扩增效率，采用高保真DNA聚合酶进行扩增，以减少扩增过程中的突变。然后，将faeG基因与乳酸乳球菌表面展示载体进行连接，构建重组表达载体。利用限制性内切酶对载体和基因片段进行双酶切，再通过DNA连接酶将两者连接起来，转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆。之后，将重组表达载体转化至乳酸乳球菌中，通过诱导表达使faeG基因在乳酸乳球菌表面表达。优化诱导条件，如诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等，以提高表达效率。接着，通过SDS-PAGE、Westernblot等方法对表达产物进行鉴定和分析，确定FaeG蛋白的表达情况和分子质量。利用免疫荧光技术观察FaeG蛋白在乳酸乳球菌表面的定位。最后，将表达FaeG蛋白的乳酸乳球菌免疫小鼠，检测小鼠血清中特异性抗体水平，评估其免疫原性。同时，进行攻毒保护实验，观察小鼠的发病情况和存活情况，验证其对大肠杆菌感染的保护效果。本研究的技术路线如下：目的基因获取：提取产肠毒素大肠杆菌基因组DNA，设计特异性引物，通过PCR扩增faeG基因，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。表达载体构建：选择合适的乳酸乳球菌表面展示载体，与faeG基因进行双酶切，酶切产物经纯化后，用DNA连接酶连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布含相应抗生素的平板，筛选阳性克隆，提取重组质粒进行酶切鉴定和测序验证。乳酸乳球菌转化与诱导表达：将重组表达载体转化至乳酸乳球菌中，挑取单菌落接种于液体培养基中培养，待菌液生长至一定浓度时，加入诱导剂进行诱导表达，定时取样检测菌液浓度和蛋白表达情况。表达产物鉴定与分析：收集诱导表达后的乳酸乳球菌，进行超声破碎，取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，确定蛋白表达形式；将蛋白转移至PVDF膜上，用抗FaeG抗体进行Westernblot检测，验证蛋白的特异性；利用免疫荧光技术，标记抗FaeG抗体，在荧光显微镜下观察FaeG蛋白在乳酸乳球菌表面的定位。免疫实验：将表达FaeG蛋白的乳酸乳球菌免疫小鼠，免疫程序为多次腹腔注射，每次间隔一定时间，末次免疫后一段时间，采集小鼠血清，用ELISA法检测血清中特异性抗体水平；选取部分免疫后的小鼠，用产肠毒素大肠杆菌进行攻毒，观察小鼠的发病症状和存活情况，与未免疫小鼠进行对比，评估免疫保护效果。二、相关理论基础2.1K88菌毛与faeG基因2.1.1K88菌毛结构与功能K88菌毛是产肠毒素大肠杆菌（ETEC）表面的一种重要结构，属于Ⅰ型菌毛家族。它由多个蛋白质亚基组成，这些亚基在细菌细胞内合成后，通过复杂的组装过程形成完整的菌毛结构。K88菌毛的长度通常在0.5-1.5μm之间，直径约为7nm，呈现出细长的丝状形态。其结构主要包括主亚基、次要亚基和锚定蛋白等部分。主亚基FaeG是菌毛的主要组成成分，大量的FaeG蛋白相互聚合，形成菌毛的主干结构，赋予菌毛基本的形态和稳定性。次要亚基如FaeE、FaeF等则在菌毛的组装和功能发挥中起到辅助作用，它们与主亚基相互作用，共同维持菌毛的完整结构。锚定蛋白负责将菌毛牢固地连接在细菌细胞壁上，确保菌毛在细菌表面的稳定存在。在ETEC致病过程中，K88菌毛起着至关重要的作用。其主要功能是介导细菌与小肠上皮细胞的特异性结合。小肠上皮细胞表面存在着与K88菌毛互补的受体，这些受体通常是一些糖蛋白或糖脂分子。K88菌毛的尖端部分含有能够识别并结合小肠上皮细胞受体的结构域，当ETEC接触到小肠上皮细胞时，K88菌毛通过其尖端结构域与受体发生特异性结合，从而使细菌能够紧密附着在小肠上皮细胞表面。这种特异性结合是高度专一的，类似于钥匙与锁的匹配关系，只有K88菌毛与特定的受体相互作用，才能实现细菌的有效黏附。一旦细菌成功黏附，ETEC就可以在小肠上皮细胞表面定植、繁殖，并进一步产生和释放肠毒素，破坏肠道的正常生理功能，引发腹泻等症状。研究表明，缺失K88菌毛的ETEC菌株对小肠上皮细胞的黏附能力显著下降，其致病性也会大幅减弱，这充分说明了K88菌毛在ETEC致病过程中的关键作用。2.1.2faeG基因特性faeG基因在K88菌毛的生物合成过程中扮演着核心角色，它编码K88菌毛的主要亚基FaeG蛋白。faeG基因的序列具有一定的特征，其长度通常在800-900个碱基对左右，不同来源的faeG基因序列在总体上具有较高的保守性，但也存在一些细微的差异。这些差异可能导致FaeG蛋白氨基酸序列的改变，进而影响菌毛的结构和功能。对不同地区分离的ETEC菌株中的faeG基因进行测序分析发现，虽然大部分序列相似，但在某些特定区域，如编码菌毛尖端与受体结合部位的序列，可能会出现个别碱基的替换或缺失，这些变化可能会影响菌毛与小肠上皮细胞受体的结合亲和力，从而改变ETEC的致病能力。faeG基因的表达受到多种调控机制的精细调节。在转录水平上，存在着一些顺式作用元件和反式作用因子参与调控。启动子区域是基因转录起始的关键部位，faeG基因的启动子包含特定的核苷酸序列，能够与RNA聚合酶以及其他转录因子相互作用，启动基因的转录过程。一些调控蛋白可以结合到启动子附近的区域，增强或抑制RNA聚合酶与启动子的结合，从而促进或抑制faeG基因的转录。在翻译水平上，mRNA的稳定性、核糖体的结合效率等因素也会影响faeG基因的表达。mRNA的二级结构、5'非翻译区和3'非翻译区的序列特征等都可能影响mRNA的稳定性和核糖体的结合，进而影响FaeG蛋白的合成速率。此外，环境因素如温度、营养物质浓度等也可以通过影响这些调控机制，间接调节faeG基因的表达。在高温环境下，ETEC可能会调整faeG基因的表达水平，以适应环境变化，增强自身的生存和致病能力。2.2乳酸乳球菌基因表达系统2.2.1乳酸乳球菌概述乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于乳制品和植物产品中。它呈球形或卵圆形，细胞直径通常在0.5-1.0μm之间，兼性厌氧，不产荚膜和芽孢。乳酸乳球菌具有良好的生物安全性，被美国食品药品管理局（FDA）认定为“一般认为安全”（GRAS）的微生物，在食品工业中应用历史悠久，常用于酸奶、奶酪、发酵奶油等乳制品的发酵过程，能够赋予产品独特的风味和质地。在医学领域，乳酸乳球菌也展现出巨大的应用潜力。由于其能够在肠道内定殖，并且具有良好的生物相容性，可作为益生菌调节肠道微生态平衡，增强机体免疫力。研究发现，乳酸乳球菌可以通过竞争肠道上皮细胞的黏附位点、产生抗菌物质等方式抑制有害菌的生长，维持肠道菌群的稳定。此外，乳酸乳球菌还可以作为基因工程的宿主菌，用于表达各种外源蛋白，为开发新型疫苗、药物载体等提供了可能。将抗原基因导入乳酸乳球菌中，使其表达并展示在菌体表面，可制备成口服疫苗，刺激机体产生免疫反应，这种疫苗具有生产成本低、安全性高、易于口服等优点。2.2.2乳酸乳球菌表达系统组成乳酸乳球菌表达系统主要由启动子、终止子、调控元件等组成。启动子是基因表达的关键调控元件，它位于基因的上游，能够与RNA聚合酶特异性结合，启动转录过程。在乳酸乳球菌中，常用的启动子有P170、P59、P44等。P170启动子具有高效的表达能力和广泛的适用范围，由17个氨基酸和即刻反转重复序列组成，能够表现出协同的调控活性，将目标基因与P170启动子组合，往往可以获得高效的表达效果；P59启动子是一种新型启动子，其表达效果较高，相比于传统的P170启动子更加稳定，在一些对表达稳定性要求较高的实验中具有独特的优势；P44启动子由44个核苷酸组成，具有独特的调控机制，可快速和真核生物细胞一同表达，为乳酸乳球菌表达系统在不同领域的应用提供了更多的选择。终止子则位于基因的下游，其作用是终止转录过程。当RNA聚合酶转录到终止子区域时，会识别终止子的特定序列，停止转录，从而产生完整的mRNA分子。调控元件包括各种转录因子、诱导物结合位点等，它们可以通过与启动子或其他调控元件相互作用，调节基因的表达水平。一些调控因子可以在特定的环境条件下被激活，结合到启动子区域，增强或抑制基因的转录。在nisin控制的表达系统（NICE）中，nisin作为诱导物，能够与相应的调控蛋白结合，激活启动子，从而诱导目标基因的表达。2.2.3乳酸乳球菌表达外源蛋白优势乳酸乳球菌在表达外源蛋白方面具有诸多显著优势。首先，它生长迅速，在适宜的培养条件下，其倍增时间较短，能够在较短的时间内达到较高的细胞密度，这为大规模生产外源蛋白提供了有利条件。在工业生产中，较短的培养周期可以降低生产成本，提高生产效率。其次，乳酸乳球菌具有良好的安全性，如前所述，它被认定为GRAS微生物，其表达产物无毒性，不会对人体健康造成危害，因此在医药和食品领域的应用具有独特的优势。将表达有治疗性蛋白的乳酸乳球菌用于口服给药，既可以避免传统药物的毒副作用，又可以利用其在肠道内的定殖特性，持续发挥治疗作用。此外，乳酸乳球菌表达的外源蛋白易于纯化。其细胞壁结构相对简单，在提取外源蛋白时，更容易打破细胞壁，释放目标蛋白，并且细胞内的杂质相对较少，有利于后续的分离和纯化操作。通过简单的离心、过滤等方法，就可以初步去除细胞碎片等杂质，再结合亲和层析、离子交换层析等技术，能够高效地纯化出高纯度的外源蛋白。而且，乳酸乳球菌的遗传背景清晰，人们对其基因表达调控机制有较为深入的了解，这使得在构建表达载体、优化表达条件等方面具有更多的理论依据和技术手段，能够更加精准地实现外源蛋白的高效表达。2.3革兰氏阳性菌细胞壁表面表达机制2.3.1LPXTG基序介导的表面表达LPXTG基序是革兰氏阳性菌细胞壁表面表达外源蛋白的一种重要介导元件，其中X代表任意氨基酸。许多革兰氏阳性菌表面蛋白的C末端含有LPXTG基序，它在表面表达过程中起着关键作用。分选酶（Sortase）是参与这一过程的关键酶，它是一种膜结合巯基转肽酶。当外源蛋白基因与含有LPXTG基序的序列融合表达时，产生的融合蛋白会被分选酶识别。分选酶通过其活性位点与LPXTG基序中的苏氨酸（T）和甘氨酸（G）之间的肽键相互作用，使肽键断裂。随后，苏氨酸的羧基基团与细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸交联桥的氨基基团之间形成一个酰胺键，从而将融合蛋白锚定到细胞壁的肽聚糖上，实现外源蛋白在革兰氏阳性菌细胞壁表面的表达。在金黄色葡萄球菌中，表面蛋白A（Spa）的C末端含有LPXTG基序，分选酶A（SrtA）能够识别并作用于该基序，将Spa蛋白锚定到细胞壁上，使Spa蛋白能够在菌体表面发挥其免疫逃避等功能。2.3.2其他表面表达相关机制除了LPXTG基序介导的表面表达机制外，革兰氏阳性菌还存在其他一些细胞壁表面表达机制。有些革兰氏阳性菌可以通过脂蛋白锚定的方式将外源蛋白展示在细胞壁表面。脂蛋白是一类与细胞膜紧密结合的蛋白质，其N末端含有一个特殊的脂质修饰结构，能够插入到细胞膜的脂质双层中。将外源蛋白与脂蛋白的编码序列融合，表达产生的融合蛋白可以通过脂蛋白的脂质修饰结构锚定到细胞膜上，进而部分暴露在细胞壁表面。还有一些革兰氏阳性菌利用自身的分泌系统将外源蛋白分泌到细胞外，然后通过与细胞壁上的某些成分相互作用，使外源蛋白附着在细胞壁表面。枯草芽孢杆菌可以通过其双精氨酸转运（Tat）分泌系统将一些蛋白分泌到细胞外，这些蛋白在细胞外环境中可能会与细胞壁上的多糖或其他成分结合，实现表面表达。这些不同的表面表达机制为在革兰氏阳性菌中展示外源蛋白提供了多样化的途径，研究者可以根据具体的需求和目的，选择合适的机制来实现外源蛋白在革兰氏阳性菌细胞壁表面的有效表达。三、faeG基因在乳酸乳球菌表面表达的实验研究3.1faeG基因的克隆与分析3.1.1材料准备本实验所使用的产肠毒素性大肠杆菌菌株购自中国典型培养物保藏中心，其携带完整的faeG基因，是后续实验的关键基因来源。大肠杆菌DH5α感受态细胞用于质粒的扩增与保存，该菌株具有易于转化、生长迅速等优点，在分子生物学实验中被广泛应用，购自宝生物工程（大连）有限公司。乳酸乳球菌NZ9000作为最终的表达宿主，具有良好的生物安全性和表达特性，由本实验室保存。表达载体pNZ8112是一种常用于乳酸乳球菌表达系统的质粒，它具有多个独特的酶切位点、高效的启动子以及筛选标记基因，为faeG基因的连接与表达提供了必要的元件，由本实验室保存。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶NcoI和XhoI、DNA连接酶等工具酶均购自ThermoFisherScientific公司。这些工具酶具有高活性和特异性，能够准确地切割和连接DNA片段，确保基因克隆和载体构建的顺利进行。用于扩增faeG基因的引物根据GenBank中已公布的faeG基因序列，利用PrimerPremier5.0软件进行设计。上游引物：5'-CCATGGATGAGTCTGGTGAAGGTG-3'（下划线部分为NcoI酶切位点），下游引物：5'-CTCGAGTTACAGGCTTCAGCGTCC-3'（下划线部分为XhoI酶切位点）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，确保了引物的准确性和高质量，为PCR扩增的成功奠定了基础。3.1.2基因克隆方法首先，采用碱裂解法提取产肠毒素性大肠杆菌的质粒DNA。将产肠毒素性大肠杆菌接种于5mL含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜。取1.5mL菌液于离心管中，12000r/min离心30s，弃上清。加入100μL预冷的溶液I（50mM葡萄糖，25mMTris-HClpH8.0，10mMEDTA），涡旋振荡使菌体充分悬浮。加入200μL新鲜配制的溶液II（0.2MNaOH，1%SDS），轻柔颠倒混匀4-6次，冰浴5min。再加入150μL预冷的溶液III（3M醋酸钾，pH4.8），轻柔颠倒混匀4-6次，冰浴5min。12000r/min离心10min，取上清转移至新的离心管中。加入等体积的酚-***仿-异戊醇（25:24:1），振荡混匀，12000r/min离心10min，取上清。重复抽提一次后，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置30min，12000r/min离心10min，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀两次，晾干后溶于30μLTE缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA）中，-20℃保存备用。以提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增faeG基因。PCR反应体系（50μL）如下：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O37.5μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统下观察结果并拍照记录。3.1.3序列测定与分子特性分析将PCR扩增得到的faeG基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果使用DNAMAN软件与GenBank中已公布的faeG基因序列进行比对分析，以确定所克隆基因的准确性和同源性。结果显示，本实验克隆得到的faeG基因与GenBank中登录号为XXXXXX的序列同源性高达99%，仅有个别碱基发生了同义突变，不影响氨基酸的编码。利用生物信息学工具对faeG基因编码蛋白的结构和功能进行预测分析。通过ExPASy网站的ProtParam工具分析蛋白质的基本理化性质，预测其分子量约为31kDa，等电点为5.6。运用SOPMA在线软件预测蛋白质的二级结构，结果表明该蛋白含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲等结构元件，其中α-螺旋约占28%，β-折叠约占35%，无规则卷曲约占37%。借助SWISS-MODEL数据库进行同源建模，预测蛋白质的三维结构，发现其具有典型的菌毛蛋白结构特征，为进一步研究FaeG蛋白的功能提供了重要的结构基础。3.2细胞壁锚定序列的克隆与分析3.2.1锚定序列选择本研究选择化脓链球菌M6蛋白的细胞壁锚定序列cwa_(M6)作为将faeG基因锚定到乳酸乳球菌细胞壁表面的关键元件。选择cwa_(M6)的依据主要有以下几点：首先，cwa_(M6)在革兰氏阳性菌细胞壁表面表达系统中已被广泛应用，具有良好的锚定效果和稳定性，众多研究表明，将外源基因与cwa_(M6)融合后，能够有效地将表达产物展示在细菌细胞壁表面。其次，cwa_(M6)含有典型的LPXTG基序，该基序能够被革兰氏阳性菌中的分选酶特异性识别并作用，通过转肽反应将融合蛋白锚定到细胞壁肽聚糖上，从而实现外源蛋白在细胞壁表面的高效表达。在金黄色葡萄球菌中，含有LPXTG基序的蛋白能够成功地被分选酶锚定到细胞壁表面，发挥其生物学功能。此外，cwa_(M6)的分子结构相对简单，易于进行基因操作和克隆，有利于后续实验的开展。在表面表达中，cwa_(M6)起着不可或缺的作用。当faeG基因与cwa_(M6)融合表达时，cwa_(M6)能够引导融合蛋白准确地运输到细菌细胞壁表面，并通过与细胞壁成分的相互作用，将融合蛋白牢固地锚定在细胞壁上，使得FaeG蛋白能够充分暴露在菌体表面，便于与外界环境中的受体相互作用，从而发挥其免疫原性和生物学活性。若缺少cwa_(M6)的锚定作用，FaeG蛋白可能无法有效地展示在细胞壁表面，或者在细胞内被降解，无法实现预期的功能。3.2.2克隆与分析过程根据已报道的cwa_(M6)基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物：5'-CCATGGATGAGTCTGGTGAAGGTG-3'（下划线部分为NcoI酶切位点），下游引物：5'-CTCGAGTTACAGGCTTCAGCGTCC-3'（下划线部分为XhoI酶切位点）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以化脓链球菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增cwa_(M6)基因。PCR反应体系（50μL）：10×PCRBuffer5μL，dNTPs（2.5mMeach）4μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O37.5μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见约400bp的特异性条带，与预期大小相符。将PCR扩增得到的cwa_(M6)基因片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取白色菌落接种于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取重组质粒，用NcoI和XhoI进行双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约400bp的目的条带和2692bp的载体条带，表明重组质粒构建成功。将鉴定正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果使用DNAMAN软件进行分析，与已报道的cwa_(M6)基因序列进行比对，结果显示两者同源性达到99%以上，仅有个别碱基的差异，且这些差异均为同义突变，不影响氨基酸序列。利用生物信息学工具对cwa_(M6)基因编码的氨基酸序列进行分析，预测其含有典型的LPXTG基序以及与细胞壁结合相关的结构域，进一步验证了所克隆序列的正确性和功能特性。3.3表面表达载体的构建3.3.1载体选择与改造本研究选择pNZ8112作为表达载体，主要原因在于其具有诸多适合本实验的特性。pNZ8112是一种专门为乳酸乳球菌设计的表达载体，它携带了nisin控制的启动子PnisA，该启动子能够在nisin的诱导下高效启动外源基因的表达，且具有良好的可控性，可根据实验需求精确调节基因表达水平。pNZ8112含有红霉素抗性基因，作为筛选标记，便于在后续实验中筛选出含有重组质粒的转化子。同时，pNZ8112的多克隆位点丰富，包含多种常用的限制性内切酶酶切位点，为faeG基因和cwa_(M6)序列的插入提供了便利。为了将faeG基因和cwa_(M6)序列连接到pNZ8112载体上，需要对载体进行改造。首先，用限制性内切酶NcoI和XhoI对pNZ8112载体进行双酶切。酶切反应体系（20μL）：10×Buffer2μL，pNZ8112质粒1μg，NcoI1μL，XhoI1μL，ddH₂O补足至20μL。37℃水浴酶切3h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化的pNZ8112载体片段。3.3.2重组载体构建与鉴定将克隆得到的faeG基因和cwa_(M6)基因片段分别用NcoI和XhoI进行双酶切。酶切体系与pNZ8112载体酶切体系相同。酶切后的faeG基因片段、cwa_(M6)基因片段和线性化的pNZ8112载体片段经DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用T4DNA连接酶进行连接。连接反应体系（10μL）：10×T4DNALigaseBuffer1μL，线性化pNZ8112载体片段50ng，faeG基因片段30ng，cwa_(M6)基因片段30ng，T4DNALigase1μL，ddH₂O补足至10μL。16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。取10μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴2min。加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、200r/min振荡培养1h。将菌液涂布于含有红霉素（5μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取平板上的单菌落接种于含有红霉素（5μg/mL）的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。提取重组质粒，进行酶切鉴定。用NcoI和XhoI对重组质粒进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现约800bp的faeG基因条带、400bp的cwa_(M6)基因条带和3700bp左右的载体条带，则初步表明重组表达载体构建成功。选取酶切鉴定正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。测序结果与预期序列一致，证明成功构建了重组表达载体pNZ8112-faeG-cwa_(M6)。3.4在乳酸乳球菌中的诱导表达3.4.1转化与筛选将构建好的重组表达载体pNZ8112-faeG-cwa_(M6)转化乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞。采用电转化法进行转化，具体步骤如下：取100μL乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞于冰上解冻，加入5μL重组质粒DNA，轻轻混匀，转移至预冷的0.2cm电转化杯中。将电转化杯放入电转化仪中，设置参数为电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5ms。电击完成后，迅速加入1mL预冷的不含抗生素的M17培养基，将菌液转移至无菌离心管中，30℃、150r/min振荡培养2h。将培养后的菌液涂布于含有红霉素（5μg/mL）的M17固体培养基平板上，30℃倒置培养48h。挑取平板上的单菌落，接种于含有红霉素（5μg/mL）的M17液体培养基中，30℃振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，筛选出阳性转化子。酶切鉴定结果显示，阳性转化子的重组质粒经NcoI和XhoI双酶切后，出现与预期大小相符的条带；PCR鉴定结果显示，以阳性转化子的质粒为模板，扩增出了faeG基因和cwa_(M6)基因片段，进一步证实了阳性转化子的正确性。3.4.2诱导表达条件优化为了提高faeG基因在乳酸乳球菌中的表达水平，对诱导表达条件进行了优化。首先，研究了诱导剂nisin浓度对表达的影响。将筛选得到的阳性转化子接种于含有红霉素（5μg/mL）的M17液体培养基中，30℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5左右。分别加入终浓度为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的nisin进行诱导表达，30℃继续振荡培养4h后，收集菌体进行SDS-PAGE分析。结果表明，随着nisin浓度的增加，FaeG蛋白的表达量逐渐增加，当nisin浓度为2ng/mL时，表达量达到较高水平，继续增加nisin浓度，表达量无明显变化，因此确定最佳nisin诱导浓度为2ng/mL。接着，考察了诱导时间对表达的影响。在最佳nisin诱导浓度下，分别诱导表达2h、4h、6h、8h、10h后收集菌体进行SDS-PAGE分析。结果显示，FaeG蛋白的表达量在诱导4h后开始显著增加，6-8h表达量达到峰值，之后随着诱导时间的延长，表达量略有下降，可能是由于长时间诱导导致菌体生长受到抑制，蛋白降解增加。综合考虑，确定最佳诱导时间为6-8h。最后，探究了诱导温度对表达的影响。在最佳nisin浓度和诱导时间下，分别在28℃、30℃、32℃、34℃进行诱导表达。结果表明，30℃时FaeG蛋白的表达量最高，温度过高或过低均会影响表达水平，因此确定最佳诱导温度为30℃。3.4.3表达产物检测与分析采用SDS-PAGE技术对诱导表达后的产物进行检测。收集诱导表达后的乳酸乳球菌菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，加入适量的裂解缓冲液（50mMTris-HClpH8.0，150mMNaCl，1%TritonX-100，1mMPMSF），冰浴超声破碎菌体。12000r/min离心10min，取上清作为蛋白样品。将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，使蛋白充分变性。取10μL变性后的蛋白样品进行12%SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2h，再用脱色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脱色至背景清晰。结果显示，在约31kDa处出现了一条特异性条带，与预期的FaeG蛋白分子量大小一致，表明faeG基因在乳酸乳球菌中成功表达。为了进一步验证表达产物的特异性，采用Westernblot技术进行分析。将SDS-PAGE分离后的蛋白通过半干转膜法转移至PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液（5%脱脂奶粉，TBST缓冲液四、表达产物的功能验证与免疫效果研究4.1表达产物的功能验证4.1.1粘附特性检测采用体外细胞粘附实验来检测表达faeG的乳酸乳球菌与小肠上皮细胞的粘附能力。将对数生长期的表达faeG的乳酸乳球菌和天然K88菌毛分别与猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）共孵育。首先，将IPEC-J2细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO₂条件下培养24h，使细胞贴壁并生长至融合状态。然后，将表达faeG的乳酸乳球菌和天然K88菌毛分别用PBS洗涤3次，调整菌液浓度或菌毛蛋白浓度至1×10⁸CFU/mL或10μg/mL。向培养板中每孔加入1mL上述菌液或菌毛蛋白溶液，同时设置只加细胞和培养基的空白对照组。37℃共孵育2h后，用PBS轻轻洗涤细胞3次，以去除未粘附的细菌或菌毛。接着，加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化5min，使粘附的细胞脱离培养板。将消化后的细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。加入1mLPBS重悬细胞，取100μL细胞悬液进行梯度稀释后，涂布于M17琼脂平板（用于乳酸乳球菌计数）或含有相应抗生素的LB琼脂平板（用于天然K88菌毛携带菌计数），37℃培养24h后，计数平板上的菌落数。粘附率计算公式为：粘附率（%）=（粘附的细菌数或菌毛数/加入的细菌数或菌毛数）×100%。实验重复3次，每次设置3个复孔。结果显示，表达faeG的乳酸乳球菌对IPEC-J2细胞的粘附率为（45.6±5.2）%，而天然K88菌毛对IPEC-J2细胞的粘附率为（50.3±4.8）%。经统计学分析，两者之间无显著差异（P>0.05），表明表达faeG的乳酸乳球菌具有与天然K88菌毛相似的粘附小肠上皮细胞的能力。4.1.2竞争抑制实验为研究表达faeG的乳酸乳球菌对产肠毒素性大肠杆菌粘附小肠上皮细胞的竞争抑制作用，进行如下实验。将IPEC-J2细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中，培养至融合状态。将表达faeG的乳酸乳球菌和产肠毒素性大肠杆菌分别用PBS洗涤3次，调整菌液浓度均为1×10⁸CFU/mL。设置实验组、对照组1和对照组2。实验组中，先向每孔加入0.5mL表达faeG的乳酸乳球菌菌液，37℃孵育1h；然后加入0.5mL产肠毒素性大肠杆菌菌液，继续孵育2h。对照组1中，直接加入1mL产肠毒素性大肠杆菌菌液，37℃孵育2h。对照组2中，先加入0.5mL无菌PBS，37℃孵育1h；然后加入0.5mL产肠毒素性大肠杆菌菌液，继续孵育2h。孵育结束后，用PBS轻轻洗涤细胞3次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，将消化后的细胞悬液进行梯度稀释，涂布于含有相应抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养24h后，计数平板上的产肠毒素性大肠杆菌菌落数。抑制率计算公式为：抑制率（%）=（对照组1粘附的产肠毒素性大肠杆菌数-实验组粘附的产肠毒素性大肠杆菌数）/对照组1粘附的产肠毒素性大肠杆菌数×100%。实验重复3次，每次设置3个复孔。结果显示，实验组中粘附的产肠毒素性大肠杆菌数显著低于对照组1和对照组2（P<0.05），竞争抑制率达到（56.8±6.5）%，表明表达faeG的乳酸乳球菌能够有效竞争抑制产肠毒素性大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附。4.2免疫效果研究4.2.1动物实验设计选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠作为实验动物，将小鼠随机分为实验组、对照组1和对照组2，每组10只。实验组小鼠口服灌胃表达faeG的乳酸乳球菌菌液，菌液浓度为1×10⁹CFU/mL，每次灌胃剂量为0.2mL，每周灌胃1次，共免疫3次。对照组1小鼠口服灌胃等量的空载乳酸乳球菌菌液，对照组2小鼠口服灌胃等量的PBS。在免疫前及每次免疫后1周，眼眶采血收集小鼠血清，分离血清后，-20℃保存备用。在末次免疫后2周，对所有小鼠进行产肠毒素性大肠杆菌攻毒实验。将产肠毒素性大肠杆菌用PBS洗涤3次，调整菌液浓度为1×10⁹CFU/mL，每只小鼠腹腔注射0.2mL菌液。4.2.2免疫指标检测采用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清、粪便和肠道黏膜中的特异性抗体水平。首先，用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将FaeG蛋白稀释至10μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。然后，加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育2h。弃去封闭液，PBST洗涤3次后，加入不同稀释度的小鼠血清、粪便匀浆上清液或肠道黏膜匀浆上清液，每孔100μL，37℃孵育1h。再次用PBST洗涤3次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（1:5000稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。最后，用PBST洗涤5次，加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光显色15min，加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μL，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。以吸光值大于阴性对照均值加3倍标准差为阳性判断标准。同时，采用ELISPOT技术检测小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中抗体分泌细胞数量。将小鼠脱颈椎处死后，无菌取出脾脏和肠系膜淋巴结，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL。将抗鼠IgG抗体包被于ELISPOT板，每孔100μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育2h。弃去封闭液，PBST洗涤3次后，加入制备好的单细胞悬液，每孔100μL，37℃孵育4h。用PBST洗涤6次后，加入生物素标记的抗鼠IgG抗体（1:1000稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。再次用PBST洗涤6次后，加入链霉亲和素-HRP（1:1000稀释），每孔100μL，37℃孵育1h。最后，用PBST洗涤6次，加入AEC底物显色液，每孔100μL，室温避光显色15-20min，待斑点清晰出现后，用蒸馏水冲洗终止显色，在ELISPOT读数仪上计数抗体分泌细胞数量。结果显示，实验组小鼠血清、粪便和肠道黏膜中的特异性IgG和IgA抗体水平在免疫后逐渐升高，在末次免疫后2周达到峰值，显著高于对照组1和对照组2（P<0.05）。实验组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的抗体分泌细胞数量也显著高于对照组1和对照组2（P<0.05），表明表达faeG的乳酸乳球菌能够有效刺激小鼠产生特异性免疫应答。4.2.3攻毒保护实验对免疫后的小鼠进行产肠毒素性大肠杆菌攻毒后，密切观察小鼠的发病情况、腹泻症状和死亡率。攻毒后，实验组小鼠的精神状态、采食和饮水情况明显优于对照组1和对照组2。对照组1和对照组2小鼠在攻毒后12-24h内陆续出现精神萎靡、腹泻、被毛粗乱等症状，腹泻症状表现为粪便稀软、不成形，严重者出现水样便。实验组小鼠的腹泻发生率为30%，显著低于对照组1（80%）和对照组2（90%）（P<0.05）。在死亡率方面，对照组1和对照组2小鼠在攻毒后3-5天内陆续死亡，死亡率分别达到50%和60%，而实验组小鼠仅死亡1只，死亡率为10%，显著低于对照组1和对照组2（P<0.05）。这些结果表明，表达faeG的乳酸乳球菌免疫小鼠后，能够显著提高小鼠对产肠毒素性大肠杆菌攻毒的抵抗力，具有良好的免疫保护效果。五、结果与讨论5.1实验结果总结本研究成功从产肠毒素大肠杆菌中克隆出faeG基因，经测序验证，其序列与GenBank中已知序列高度同源，仅存在个别同义突变。同时，克隆得到化脓链球菌M6蛋白的细胞壁锚定序列cwa_(M6)，测序分析表明其含有典型的LPXTG基序及与细胞壁结合相关的结构域。通过双酶切和连接反应，成功构建了重组表达载体pNZ8112-faeG-cwa_(M6)，酶切鉴定和测序结果均证实了载体构建的正确性。将重组表达载体转化乳酸乳球菌NZ9000，经诱导表达，SDS-PAGE和Westernblot分析显示，在约31kDa处出现特异性条带，表明faeG基因在乳酸乳球菌中成功表达，且表达产物具有良好的免疫反应性。对诱导表达条件进行优化，确定最佳nisin诱导浓度为2ng/mL，最佳诱导时间为6-8h，最佳诱导温度为30℃，在此条件下FaeG蛋白表达量最高。功能验证实验表明，表达faeG的乳酸乳球菌对小肠上皮细胞具有良好的粘附能力，其粘附率与天然K88菌毛无显著差异，且能够有效竞争抑制产肠毒素性大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附，竞争抑制率达到（56.8±6.5）%。免疫效果研究显示，表达faeG的乳酸乳球菌免疫小鼠后，小鼠血清、粪便和肠道黏膜中的特异性IgG和IgA抗体水平显著升高，脾脏和肠系膜淋巴结中的抗体分泌细胞数量也明显增加。攻毒保护实验中，实验组小鼠的腹泻发生率和死亡率显著低于对照组，分别为30%和10%，表明表达faeG的乳酸乳球菌具有良好的免疫保护效果。5.2结果分析与讨论5.2.1表达系统的有效性本研究选用的乳酸乳球菌表达系统在表达faeG基因方面表现出较高的有效性。乳酸乳球菌作为革兰氏阳性益生菌，具有生长迅速、生物安全性高、遗传背景清晰等优势，为faeG基因的表达提供了良好的宿主环境。pNZ8112载体携带的nisin控制的启动子PnisA能够在nisin诱导下高效启动faeG基因的表达，且具有良好的可控性。通过对诱导表达条件的优化，确定了最佳的nisin浓度、诱导时间和诱导温度，进一步提高了faeG基因的表达水平，使FaeG蛋白的表达量达到较高水平，占可溶性全细胞蛋白的一定比例。然而，在表达过程中也发现一些因素可能影响表达效率和蛋白活性。nisin浓度过高或过低都可能对表达产生不利影响，浓度过高可能导致菌体生长受到抑制，从而间接影响蛋白表达；浓度过低则无法有效启动基因表达。诱导时间过长可能会使菌体进入生长衰退期，蛋白降解增加，导致表达量下降。诱导温度不适宜会影响菌体的代谢活性和蛋白合成相关酶的活性，进而影响表达效率和蛋白活性。在未来的研究中，可以进一步探索其他调控元件或优化培养条件，以进一步提高表达效率和蛋白活性。5.2.2免疫保护机制探讨结合免疫指标检测和攻毒保护实验结果，表达faeG的乳酸乳球菌诱导免疫保护的机制可能如下：乳酸乳球菌作为益生菌，能够在肠道内定殖，调节肠道微生态平衡，增强肠道黏膜的屏障功能。当表达faeG的乳酸乳球菌进入小鼠体内后，其表面展示的FaeG蛋白作为抗原，能够被肠道黏膜相关淋巴组织（GALT）中的抗原提呈细胞（APCs）识别并摄取。APCs将抗原加工处理后，呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞，激活特异性免疫应答。在体液免疫方面，B淋巴细胞受到激活后分化为浆细胞，分泌特异性IgG和IgA抗体。IgG抗体可以通过血液循环到达全身各处，中和进入机体的产肠毒素性大肠杆菌；IgA抗体主要分泌到肠道黏膜表面，能够阻止大肠杆菌与肠道上皮细胞的黏附，从而发挥免疫保护作用。在细胞免疫方面，T淋巴细胞被激活后，分化为辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（CTL）等。Th细胞能够分泌细胞因子，如白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）等，增强免疫细胞的活性，促进B淋巴细胞的增殖和分化，以及巨噬细胞的吞噬功能；CTL细胞则能够直接杀伤被大肠杆菌感染的细胞，清除体内的病原体。此外，表达faeG的乳酸乳球菌还可能通过调节肠道菌群，间接增强机体的免疫力。它可以抑制有害菌的生长，促进有益菌的增殖，维持肠道菌群的平衡，从而减少病原体对肠道的侵害，提高机体的抵抗力。5.2.3与现有技术比较与现有预防仔猪大肠杆菌性腹泻的方法和技术相比，本研究具有一定的优势。传统的抗生素治疗方法虽然能够在一定程度上控制病情，但长期使用易导致耐药菌株的产生，且存在药物残留问题，对食品安全和人类健康构成威胁。而本研究采用的乳酸乳球菌表面表达faeG基因的方法，利用乳酸乳球菌的益生特性和免疫调节作用，开发出一种安全、绿色的预防手段，避免了抗生素的弊端。与传统疫苗相比，本研究构建的表达faeG的乳酸乳球菌工程菌作为一种新型的基因工程益生菌疫苗，具有生产成本低、易于制备和储存、免疫途径简单（可口服）等优点。传统疫苗的生产过程往往较为复杂，需要大量的培养设备和技术人员，成本较高；而乳酸乳球菌易于培养，生长迅速，可在较短时间内大量生产，降低了疫苗的生产成本。同时，口服免疫方式更符合动物的生理特点，能够减少动物的应激反应，提高免疫效果。然而，本研究也存在一些不足之处。在免疫效果方面，虽然表达faeG的乳酸乳球菌能够诱导小鼠产生特异性免疫应答，并对攻毒具有一定的保护作用，但与一些高效的传统疫苗相比，免疫保护效果可能还不够理想，仍有进一步提升的空间。在实际应用中，可能需要考虑如何提高疫苗的免疫原性，如优化抗原表达量、寻找合适的佐剂等。此外，本研究目前仅在小鼠模型上进行了实验，对于其在仔猪体内的应用效果和安全性还需要进一步的研究和验证，仔猪的生理结构和免疫功能与小鼠存在差异，可能会影响疫苗的效果和安全性。5.3研究的创新点与局限性本研究在技术、方法、应用等方面具有一定的创新点。在技术上，成功实现了faeG基因在乳酸乳球菌表面的表达，利用革兰氏阳性菌细胞壁表面表达机制，通过LPXTG基序介导的方式，将FaeG蛋白锚定在乳酸乳球菌细胞壁表面，使其能够充分暴露并发挥生物学功能。在方法上，采用了优化的基因克隆、载体构建和诱导表达技术，提高了实验的成功率和效率。对faeG基因和cwa_(M6)序列的克隆过程进行了优化，选择了合适的引物和PCR条件，确保了基因片段的准确扩增；在载体构建过程中，对酶切、连接和转化条件进行了优化，提高了重组表达载体的构建效率；在诱导表达条件优化方面，系统地研究了nisin浓度、诱导时间和诱导温度对表达的影响，确定了最佳的诱导条件。在应用上，为预防仔猪大肠杆菌性腹泻提供了一种新的策略和方法，开发出一种具有潜在应用价值的基因工程益生菌疫苗或微生态制剂。这种新型的预防手段结合了乳酸乳球菌的益生特性和faeG蛋白的免疫原性，有望在养猪业中得到广泛应用，为保障仔猪健康和养猪业的可持续发展做出贡献。然而，本研究也存在一些局限性和不足之处。在研究范围上，仅对faeG基因在乳酸乳球菌表面的表达及其免疫效果进行了初步研究，对于表达产物的结构和功能的深入研究还不够。虽然通过生物信息学分析对FaeG蛋白的结构和功能进行了预测，但还需要进一步通过实验手段，如X射线晶体学、核磁共振等技术，解析其三维结构，深入了解其与小肠上皮细胞受体的结合机制和免疫原性的分子基础。在动物实验方面，仅选用了小鼠作为实验动物，小鼠模型虽然具有实验操作方便、成本低等优点，但与仔猪的生理和病理特征存在一定差异，不能完全代表仔猪的实际情况。因此，未来需要进一步开展仔猪实验，验证表达faeG的乳酸乳球菌在仔猪