生物分子固定化方法

1、生物传感器中生物组分的固定化方法 生物传感器由两部分组成: 生物敏感元件和信号转换器。生物传感器的选择性主要取决于敏感材料的选取，而灵敏度的高低则与转换器的类型、生物组分的固定化技术等有很大的关系。因此固定化技术的发展是提高传感器性能的关键因素之一。生物传感器要呈现良好的工作性能, 其固定化技术应满足以下条件: (1) 固定化后的生物组分仍能维持良好的生物活性；(2) 生物膜与转换器须紧密接触，且能适应多种测试环境；(3) 固定化层要有良好的稳定性和耐用性；(4) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。为了研制廉价、灵敏度高而且选择性好的生物传感器，固定化技术已成为研究者们努

2、力探求的目标。经过近20年的不懈探索，已建立了对各种不同生物功能材料的固定化方法。1.1.3.1 物理吸附法 此法是通过生物分子的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组分吸附于不溶性的惰性载体上。文献已经报道了一些材料可用作吸附其它材料的载体，比如，石墨粉25、石墨-聚四氟乙烯26、活性碳27、离子交换树脂28等。物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和，缺点是生物分子与载体表面的结合力弱，在表面进行任意取向的不规则分布，因此使制得的生物传感器容易发生生物分子的脱落和泄漏，从而造成传感器的灵敏度低，重现性差。1.1.3.2 包埋法 将生物组分与合成高分子经溶剂混合而使生物组分包埋于其中，制成敏感膜

3、的方法称作包埋法。采取的包埋方式通常包括凝胶包埋法和胶囊包埋法二种形式29,30。包埋法的优点是操作条件比较温和，膜的孔径和形状可随意控制，对生物组分活性的影响较小，缺点是需控制很多实验因素，而且生物组分在聚合物膜内的活性会受到影响。1.1.3.3 共价键合法将生物组分通过共价键与电极表面结合而固定的方法称作共价键合法。该法是利用基体表面进行活化处理，然后与生物组分偶联，从而使生物组分结合到基体表面。活化的方法有：烷基化法31、高碘酸氧化法32、迭氮法33等。该法的优点是通过形成特殊键将生物组分进行固定，因此生物组分不易发生泄漏，并且改善了生物分子在表面的定向，但缺点是操作复杂，成本高，而且生

4、物组分易失活。1.1.3.4 化学交联法化学交联法是在交联剂 (具有两个或两个以上功能团的试剂) 的作用下，生物分子间发生共价结合，也可将生物组分直接与载体共价交联。最常用的交联剂是戊二醛35。该法的优点是生物组分的固定比较牢固，不易脱落，缺点是反应难以控制，扩散阻力大，所需的生物样品量多。1.1.3.5 电化学聚合法电化学聚合法是通过将聚合物单体和生物组分同时混合于电解液内，通过恒电位法或者电位循环扫描法使单体电氧化或还原而形成聚合物膜，与此同时生物组分由于静电或吸附作用而被嵌入聚合物膜内。常用的构成生物传感器的聚合物膜分为导电型和非导电型两种。导电型聚合物常见的有聚吡咯35、聚苯胺36、聚

5、噻吩37等；非导电型常见的有聚邻苯二胺38、聚苯酚39等。电化学聚合法具有以下优点：(1) 电化学聚合和生物组分的固定可一步完成，简化了实验步骤；(2) 聚合层的厚度和生物组分的量易于控制，构制的传感器的重现性较好；(3) 抗干扰能力强。1.1.3.6 溶胶-凝胶技术溶胶-凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的一种方法。研究结果表明，溶胶-凝胶的多孔网状结构不仅适合固定小分子也适合固定生物大分子。使用溶胶-凝胶固定法可以为网络中的生物大分子提供一个水溶液的微环境，因为网络结构中含有大量的孔隙水。与传统的固定方法相比，溶胶-凝胶固定法的

6、优势还表现在它可固定任何种类的生物组分，可以较好地保持蛋白质表面微观结构的整体性和方向均一性，从而对蛋白质的活性和稳定性的损伤较小40。1.1.3.7 聚电解质层层组装技术聚电解质是一种水溶性高分子化合物，在水溶液中以稳定的线性聚离子形式存在并带有大量的电荷41。 聚电解质层层组装技术是一种很有发展潜力的生物分子固定技术。自从Decher等提出通过聚电解质层层组装技术构制超薄膜以来42，该项技术已引起了研究者们的广泛兴趣。最近，Wang及其合作者报道了一种基于胱胺与聚苯乙烯磺酸盐自组装的压电免疫传感器43；Wu等报道了一种基于羧基纤维素与聚烯丙胺盐酸盐 (PAH) 之间的静电作用而进行自组装的

7、可反复更新的尿酶传感器44。1.1.3.8 纳米材料固定化技术纳米粒子是由数目很少的原子或分子组成的原子群或分子群，其颗粒的大小在1 100 nm之间。纳米粒子主要具有四方面的效应：表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，并由此产生出许多特殊性质：奇异力学、电学、磁学、热学、光学和化学活性等45。下文将详细介绍最常用的一种纳米材料-纳米金在生物分子固定化以及其他方面的应用。1 汪尔康. 分析化学新进展，南京:南京大学出版社, 1997: 4-72 汪尔康. 21世纪的分析化学，北京:科学出版社, 1999: 136-1513 马心英. 生命科学中的分析化学，菏泽师专学报，2002，

8、2(24)：51-534 Wang J, Tian B, Rogers K R. Thick-film electrochemical immunosensor based on stripping potentiometric detection of a metal ion label. Analytical Chemistry, 1998, 70 (9): 1682-16855 Niwa O, Xu Y, Halsall H B, et al. Small-volume voltammetric detection of 4-aminophenol with interdigitated

9、 array electrodes and its application to electrochemical enzyme immunoassay. Analytical Chemistry, 1993, 65 (11): 1559-15636 Kalb T, Skldal P. Disposable multichannel immunosensors for 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid using acetylcholinesterase as an enzyme label. Electroanalysis, 1997, 9 (2): 293-29

10、77 Wang J, Chen L, Hocevar S B, et al. One-step electropolymeric co-immobilization of glucose oxidase and heparin for amperometric biosensing of glucose. The Analyst, 2000, 125 (8): 1431-14348 Hedenmo M, Narvez A, Domnguez E, et al. Improved mediated tyrosinase amperometric enzyme electrode. Journal

11、 of Electroanalytical Chemistry, 1997, 425 (1): 1-119 Vanderlaan M, Watkins B E, Stanker L. Environmental monitoriby immunoassar. Environmental Science and Technology, 1998, 22 (2): 247-25410 Clark L C, Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgey. Annals of the New

12、York Academy of Sciences, 1962, 102, 29-4511 卢昕. 生物传感器-国内研究现状及发展动向. 广西师范大学学报, 1995, 13 (3): 61-6512 Dong Y Z, Shannon C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surface with electrochemical and scanning probe detection. Analytical Chemistry, 2000, 72 (11): 2371-2376

13、13 Bartlett P N, Booth S, Caruana D J, et al. Modification of glucose oxidases by the covalent attachment of a tetrathiafulvalent derivative. Analytical Chemistry, 1997, 69 (4): 734-74214 Campanella L, Pacifici F, Sammartino M P, et al. A new organic phase bienzymatic electrode for lecithin analysis

14、 in food products. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1998, 47 (1): 25-38 15 Lee T, Tsuzuki M, Takeuchi T, et al. Quantitative determination of cyanobacteria in mixed phytoplankton assemblages by an in vivo fluorimetric method. Analytica Chimica Acta, 1995, 302 (1): 81-8716 Oungpipat W, Alexande

15、r P W, Southwell-Keely P. A reagentless amperometric biosensor for hydrogen peroxide determination based on asparagus tissue and ferrocene mediation. Analytica Chimica Acta, 1995, 309 (1-3): 35-4517 Pandey P C, Weetall H H. Detection of aromatic compounds based on DNA intercalation using an evanesce

16、nt wave biosensor. Analytical Chemistry, 1995, 67 (5): 787-79218 Tombelli S, Mascini M, Braccini L, et al. Coupling of a DNA piezoelectric biosensor and polymerase chain reaction to detect apolipoprotein E poly-morphisms. Biosensors and Bioelectronics, 2000, 15 (7-8): 363-37019 Blackburn G F, Talley

17、 D B, Booth P M, et al. Potentiometric biosensor employing catalytic antibodies as the molecular recognition element. Analytical Chemistry, 1990, 62 (20): 2211-221620 Pena N, Kuiz G, Reviejo A J, et al. Graphite-teflon composite bienzyme electrodes for the determination of cholesterol in reversed mi

18、celles: Application to food samples. Analytical Chemistry, 2001, 73 (6): 1190-119521 Sergeyeva T A, Soldatkin A P, Achkov A E, et al. b-Lactamase label-based potentiometric biosensor for a-2 interferon detection. Analytica Chimica Acta, 1999, 390 (1-3): 78-8122 姚守拙. 压电化学与生物传感. 长沙: 湖南师范大学出版社, 1997, 3

19、86-39123 Toppozada A R, Wright J, Eldefrawi A T. Evaluation of a fiber optic immunosensor for quantitating cocaine in coca. Biosensors and Bioelectronics, 1997, 12 (2): 113-12424 Pizziconi V B, Page D L. A cell-based immunosensor with engineered molecular recognition-part: design feasibility. Biosen

20、sors and Bioelectronics, 1997, 12 (3): 287-29925 Jeffries C, Pasco N, Baronian K, et al. Evaluation of a thermophile enzyme for a carbon paste amperometric biosensor: L-glutamate dehydrogenase. Biosensors and Bioelectronics, 1997, 12 (3): 225-23226 Dominguez R, Serra B, Reviejo A J, et al. Chiral an

21、alysis of amino acids using electrochemical composite bienzyme biosensors.Analytical Biochemistry, 2001, 298 (2): 275-28227 Motonaka J, Kamizasa M, Faulkner L R. Micro-enzyme sensors with osmium complex as mediator for L- and D-amino acids. Journal of Electroanalytical Chemistry, 1994, 373 (1-2): 75

22、-8128 Greenway G M, Ongomo P. Determination of L-ascorbic acid in fruit and vegetable juices by flow injection with immobilised ascorbate oxidase. Analyst, 1990, 115 (10), 1297-129929 Tor R, Freeman A. New enzyme membrane for enzyme electrodes. Analytical Chemistry, 1986, 58 (6): 1042-104630 Alaejos

23、 M S, Garcia-Montelongo F J. Application of amperometric biosensors to the determination of vitamins and a-amino acids. Chemical Review, 2004, 104 (7): 3239-326631 Zhang G J, Zhou Y K, Yuan J W, et al. A chemiluminescence fiber-optic biosensor for detection of DNA hybridization. Analytical Letters,

24、1999, 32 (14): 2725-273632 刘树庭, 林朝晖, 沈国励, 等. 醋酸纤维膜固定过氧化氢酶电极的研究. 分析化学, 1994, 22 (10): 998100133 Thevenot D R, Sternberg R, Coulet P R, et al. Enzyme collagen membrane for electrochemical determination of glucose. Analytical Chemistry, 1979, 51 (1): 96-10034 Sacks V, Eshkenazi I, Neufeld T, et al. Imm

25、obilized parathion hydrolase: an amperometric sensor for parathion. Analytical Chemistry, 2000, 72 (9): 2055-205835 Fortier G, Brassard E, Belanger D. Optimization of a polypyrrole glucose oxidase biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 1990, 5 (6): 473-49036 Mu S L, Xue H G. Bioelectrochemical ch

26、aracteristics of glucose oxidase immobilized in a polyaniline film. Sensors and Actuators B, 1996, 31 (3): 155-16037 Zotti G, Zecchin S, Schiavon G, et al. Conductivity in redox modified conducting polymers: Enhanced redox conductivity in ferrocene-substituted polypyrroles and polythiophenes. Chemis

27、try of Materials, 1995, 7 (12): 2309-231538 Zhang S B, Zheng F, Wu Z S, et al. Highly sensitive electrochemical detection of immunospecies based on combination of Fc label and PPD film/gold nanoparticle amplification. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 24(1): 129-13539 Bartlett P N, Tebbutt P, Tyrrell C H. Electrochemical immobilization of enzymes. 3. Immobilization of glucose oxidase in thin films of electrochemically polymerized phenols. Analytical Chemistry, 1992, 64 (2): 138