第10章--植物基因工程---基因工程原理与技术---刘志国-课件.ppt

1、第十章植物基因工程,目录,第一节植物基因工程发展现状第二节常见的植物受体类型一原生质体二叶盘三花第三节植物基因工程载体的特点第四节植物基因工程载体的构建第五节常见的植物转基因方法一基因枪法二叶盘法三根癌农杆菌介导法四沾花法第六节转基因植物筛选与鉴定一PCR法与Southern法检测外源基因的整合二RT-PCR与Nouthern检测外源基因的表达第七节植物基因工程应用举例本章小结思考题,第一节植物基因工程发展现状,一、植物基因工程：概念:植物基因工程，又称转基因或植物遗传转化，其研究的关键是从不同生物中提取外源基因片段及载体，经过体外切割、拼接和重组，然后采取某种转化方法，把重组后的带有外源基因

2、的载体引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的，从而改良植物性状，培育优质高产抗逆作物新品种。,植物基因工程技术流程:,二、植物基因工程的发展现状20世纪6070年代，人们仿效细菌转化法开展了植物转基因的尝试。1983年，第一株转基因植株(Zambryski，1983)的获得标志着植物转基因时代的到来。1987年，Cornell大学的Sanford等发明了基因枪，同年Klein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基因方法的新领域。目前，植物转基因已成为植物分子生物学研究的强有力的实验

3、手段；更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。近年来，遗传转化方法不断创新，以转化系统的原理不同大致可分为三类：农杆菌介导的基因转移；以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移；如电激、微注射、PEG介导转化原生质体等，基因枪和超声波法可把外源DNA直接导入带壁的植物细胞，从而避免原生质体再生植株的漫长过程，使转基因更为快速简易；种质系统的基因转移(germlinetransformation)，如利用子房注射、种胚、体细胞胚及花粉等途径导入外源基因。,三、国内植物基因工程发展状况中国转基因作物种植面积最大的是抗虫棉，己经建立了较为完善的棉花规模化转基因技术体系，培育出一批具有自主知识产权

4、的优质、高产、多抗的转基因棉花新品种。中国培育的多个高抗病虫转基因水稻新品种，是继抗虫棉之后第一个具有较大影响和产业化前景的转基因植物，居国际领先地位。中国培育的转基因抗病小麦对黄萎病、赤霉病、白粉病有很好的防治效果。2003年中国培育出世界上第一个可用于大田生产的转基因抗盐碱杨树新品种-中天杨，这一成果在杨树抗盐性转基因体系及抗盐新品种选育方面达到国际先进水平，为中国和世界盐碱地绿化找到了一条新途径。中国己育成高含油量转基因油菜超油1号、超油2号新品系，含油量分别达到47%0,53%，是目前世界上含油量最高的甘蓝型油菜。2007年，中国农业大学承担的“高蛋白质、高赖氨酸转基因玉米自交系和杂交

5、组合的选育”课题通过成果鉴定，并申请了国家发明专利，这项技术成果为优质玉米的培育探索了一条新途径，具有潜在的巨大经济效益和社会效益。目前中国在转基因作物研究方面与国际基本同步，在发展中国家中处于领先地位，植物转基因技术的研究和应用取得了很大的成绩，在转基因水稻、小麦、棉花、番茄、甜椒等作物的研究与应用方面己达到国际领先水平。,十五期间我国转基因棉花研究与生产取得丰硕成果，一共培育出具有国际竞争力并且通过商品化生产审批的转基因棉花新品种55个，累计推广1亿多亩，创直接经济效益150亿元；每亩增收节支150元左右；每年可减少化学农药用量2000公斤到3000万公斤，相当于我国化学杀虫剂年生产量的7

6、.5%；国产抗虫棉的市场份额也由1998年的5%发展到2005年的70%以上，国产抗虫棉在与国际抗虫棉的市场竞争中取得决定性胜利。,目前，中国的转基因抗虫棉已进入印度、独联体、巴基斯坦、菲律宾、澳洲等市场。郑爱中称，中国的转基因产品也可以进入美国，但尚未定出时间表。,中国农科院植物保护所所长、植物病虫害生物学国家重点实验室主任吴孔明博士带领他的团队，花费了近十年的时间，以大量的数据和试验结果证明，在中国广泛种植的转基因棉花除了可以自己“杀虫”之外，还能保护周边的农作物免受棉铃虫危害，颇有“造福一方”的连带效应。吴孔明说：“这是转基因棉对生态环境作用研究的一项新发现，同时对中国多作物混合种植体系

7、研究也具有重要意义。”,2008科学杂志刊登中国科学家对转基因棉花的研究成果,中国农业科学院棉花研究所等承担的高科技项目“棉花工厂化转基因技术体系”研究，日前通过专家鉴定。通过几年努力，终于建成了高效、工厂化的棉花转基因技术体系，年产转基因棉花6000株以上，有效降低了棉花转基因运行成本。以该技术体系为支撑，已直接育成转基因棉花新品种8个，累计推广转基因抗虫棉3200多万亩，从而使中国在这一高科技领域占有了一席之地。,四、植物基因工程存在的问题,（1)多数植物存在转化效率低、重复性差的问题，特别是一些重要粮食作物的转基因效率还不高;（2)由于植物的基因组庞大，在转基因过程中，一般是用选择性标记

8、才能有效地获得转基因个体，而这种标记对转基因植物本身是不必要的累赘，由此带来一定的生物安全问题;（3)人们还不能随意地定位和导入所需的外源基因;（4)转基因植株再生和鉴定难、操作周期长;（5)植物转基因最常用的农杆菌介导法和基因枪法，都依赖于组织培养，操作复杂，常会引起受体组织的突变，或转化植株出现基因沉默。另外，还存在外源基因在转基因植物中的遗传稳定性问题。,第二节常见的植物受体类型,愈伤组织受体系统原生质体种质受体系统胚状体受体系统直接分化芽受体系统,愈伤组织受体系统,特点：愈伤组织是由脱分化的分生细胞组成，易接受外源DNA，转化率较高；多种外植体都可经组织培养诱导产生愈伤组织，可应用于多

9、种植物基因转化；愈伤组织可继代扩繁，因而由转化愈伤组织可培养获得大量的转化植株；从外植体诱导的愈伤组织常由多细胞形成，本身就是嵌合体，因而分化的不定芽嵌合体比例高，增加了转基因再生植株筛选的难度；愈伤组织所形成的再生植株无性系变异较大，转化的目的基因遗传稳定性较差。愈伤组织可分为胚性和非胚性愈伤组织两种类型，两者在外观上在内部结构上在超微结构上均有所不同。,原生质体,植物原生质体(protoplast)是去除细胞壁后的“裸露”细胞，具全能性，能在适宜的培养条件下诱导出再生植株。由于原生质体与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，人们可利用一些物理或化学的方法改变细胞膜的通透性，使外源DNA进入细胞

10、内整合到染色体上并进行表达，从而实现植物基因转化。原生质体呈单细胞状态，每个植株都是单细胞起源的，每个原生质体都有同等的再生机会,而且避免形成“嵌合体“,是遗传转化研究的一个理想的受体。特点：外源DNA易导人细胞，易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；原生质体培养的细胞，常分裂形成基因型一致的细胞克隆，因此由转化原生质体再生的转基因植株嵌合体少；可适用于各种转化方法，主要有电击法、PEG、脂质体介导法和显微注射法等；原生质体培养所形成的细胞无性系变异较强烈，遗传稳定性差；原生质体培养技术难度大，培养周期长，植株再生频率低。,种质受体系统,以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞或种

11、子为受体细胞进行基因转化的系统称为种质系统。已建立了多种直接利用花粉粒、种子和卵细胞受精过程进行基因转化的方法，如花粉管通道法、花粉粒和种子浸泡法以及子房注射法等。优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传物质的能力强，导人外源基因成功率高；生殖细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性影响；可以应用于任何单胚珠、多胚珠的单子叶、双子叶显花植物；直接针对成株操作，不需经过细胞或原生质体培养、诱导再生植株等费时费力的过程；不受基因型的限制；育种年限短；除用总DNA外，同样还可以应用DNA重组分子进行导入；为远缘杂交不亲合的植物之间的基因重组创造了条件；方法简便。局限性：只能限于开花植物，且只有花期

12、可以转育；必须进行大群体操作，以减少转化操作对作物的影响和伤害；导人总DNA片段的转育株会带有少量非目的性状的DNA片段；这种技术牵涉到植物双受精过程，其机制更加复杂化，缺乏精密的理论依据。,胚状体受体系统,胚状体(embryoid)是指经细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称为体细胞胚。优点：再生能力强；胚状体具有两极性，直接再生成完整植株；可转化的功能细胞多，即处于转化感受态的细胞数量多；细胞分裂的同步性好；一般认为胚状体是由单细胞起源，因此获得的转化体嵌合体少；转化效率高，每次实验可进行大量细胞的操作获得较多数量的转化体；胚状体发生途径获得的再生植株遗传稳定性好，变

13、异少；胚性细胞受体系统可长期保存不影，向再生能力。,直接分化芽受体系统,直接分化芽是指外植体细胞不经过愈伤组织阶段而以组织培养直接分化形成不定芽(adventitiousbud)。特点：直接分化芽是由未分化的细胞直接分化形成，体细胞无性系变异小;该系统应用于基因转化时，操作简单、周期短；不定芽的再生常起源于多细胞，所形成的再生植株也可出现较多的嵌合体。此外，由外植体诱导直接分化芽产生，技术难度大，不定芽量少，因此，基因转化频率低于其他几种受体系统。,第三节植物基因工程载体的特点,一、植物基因工程载体的种类和特性章鱼碱型Ti质粒胭脂碱型农杆碱型农杆菌素碱型质粒载体农杆碱型Ri质粒甘露碱黄瓜碱型植

14、物基因工程载体单链RNA病毒植物病毒载体单链DNA病毒双链DNA病毒转座子载体,克隆载体中间黏粒载体中间克隆载体愈合载体中间载体基因标记载体中间表达载体Onc-卸甲载体基因工程载体卸甲载体Onc+卸甲载体共整合载体一元载体转化载体拼接末端载体双元载体,不同类型载体在植物基因工程中所起作用不同：,(1)Ti质粒载体：存在于根癌农杆菌中，通过伤口侵染植物，能使侵染部位产生瘤状突起。(2)Ri质粒载体：存在于发根农杆菌中，侵染植物后产生须状根。(3)植物病毒载体：具体又可分为3种，双链DNA病毒、单链DNA病毒和单链RNA病毒。(4)中间克隆载体：构建中间表达载体的基础质粒，由大肠杆菌质粒插入T-D

15、NA片段及目的基因、标记基因等构建而成。(5)中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体，功能是构建转化载体。(6)卸甲载体：解除武装的Ti质粒或Ri质粒，功能也是构建转化载体。(7)转化载体：又称工程载体，由中间表达载体和卸甲载体构建而成，用于目的基因导人植物细胞。,二、植物基因工程质粒载体的命名,归纳为以下几点：(1)对天然存在的质粒使用原有的命名，如ColEl和SCPl等。(2)新发现或改造的质粒命名规则：第1个小写字母p表示质粒(plasmid)，后面2个或3个大写字母表示构建该质粒的研究人员的姓名、研究单位或实验室名称，最后的数字表示构建的一系列质粒的编号。如pUCll8，p代表质粒

16、，UC代表美国加利福尼亚大学(Uniers-ityofCalifornia)的英文缩写，118代表该质粒的编号。(3)质粒中的缺失和其他类型重排的命名与细菌基因组中的缺失和重排的命名相同，如缺失了基因cad与asa的质粒命名为pI258(cad-asa-)。(4)质粒载体抗药性的符号规定用大写字母表示表型，用相同的3个小写字母表示基因型。,第四节植物基因工程载体的构建,1农杆菌载体系统2病毒载体系统,1农杆菌载体系统根癌诱导原理及Ti质粒根癌农杆菌诱导的肿瘤称为冠瘿，而发根农杆菌则诱导发根。这些农杆菌中含有大量质粒，分别称为肿瘤诱导质粒(Ti质粒)和发根诱导质粒(Ri质粒)，这两种质粒均可使宿

17、主发病。这两种病均是由Ti或Ri质粒的一些特殊组分转入植物细胞后与植物染色体进行功能整合而引起的。后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小部分，即T-DNA或称转移DNA，被转入并整合到宿主植物核基因组中，而诱导形成冠瘿瘤的(Chiton等，1977)。T-DNA含编码章鱼碱和胭脂碱合成所需酶的基因，即章鱼碱合酶基因(ocs)和胭脂碱合酶(nos)基因。,Ti质粒的构成,aT-DNAb毒性基因c染色体基因：,T-DNA转移,农杆菌载体的构建A一元载体系统有两种载体系统，即共整合载体(如pGV3850共合体)和末端拼接载体(split-endvector，SEV)系统。,中间载体与卸甲载体通过LI

18、H基因同源重组形成SEV载体,中间载体与卸甲载体通过pBR序列同源重组进行共整合,B双元载体系统双元载体系统由两个能在根癌农杆菌中自主复制的质粒组成：一个是在T-DNA边界之间带有目的基因的穿梭载体(但更多是一个双元载体)；一个是辅助(helper)Ti质粒，该质粒带有vir基因，其产物有助于将DNA转移到植物细胞。,双元Ti载体系统，由质粒A（辅助Ti质粒）和质粒B（双元载体）共同组成,标准双元载体的组成成分：(1)多克隆位点；(2)在大肠杆菌和根癌农杆菌中均有功能的广谱宿主范围的质粒复制起始点(如RK2)；(3)细菌和植物中的选择标记；(4)T-DNA边界序列(尽管只有右边界序列是绝对必需

19、的)。双元载体的优点：1)双元载体不需要在活体内进行同源重组，而共整合载体需要在根癌农杆菌中维持稳定的重组过程。2).双元载体只需要将一个完整的质粒载体转入靶细菌，使细菌的转化过程更为有效、快捷(原来需要47d，现在只需23d)。3).在农杆菌中，获得带有植物目的基因的双元载体系统比较容易而且效率高。4)在双元载体系统中，双元质粒有两个独立的复制子，这样拷贝数不会太多地受到Ti质粒复制子的限制。正因为这一点，大多数情况下通过农杆菌的小量制备就可确认转化成功与否，而若用共整合载体需进行Southern杂交。,2病毒载体系统目前，用于开发载体及转化的病毒有三种，他们主要采用基因插入和基因取代的方法

20、构建载体：花椰菜花叶病毒(Caulimoviruses)双联体病毒RNA病毒,花椰菜花叶病毒(Caulimoviruses)CaMV的基因组由一个8kb的松弛的环状分子组成。基因组有两个区域，一个是ORF，编码昆虫传播因子；另一个是ORF，功能还不清楚。将这两个区域缺失掉，用感兴趣的基因取代之。Brisson等(1984)用CaMV载体在芜青甘蓝细胞中获得了由细菌二氢叶酸还原酶基因编码的外源蛋白。这一结果证明CaMV基因组确实能被改建成植物基因工程病毒载体并把外源基因转入植物细胞。目前，用CaMV基因组构建载体的基本路线是把外源基因整合到基因组某个特定的非功能区域或对病毒复制没有重要作用的OR

21、F中，外源基因插入后不影响病毒基因组的侵染性。这种载体在细胞中的复制方式与野生型的CaMV相同，外源基因不能整合到寄主染色体上，已报道的克隆到CaMV载体中的基因都只有较短的核苷酸序列，插入位点都在ORF上，外源基因的表达多受病毒启动子的调节。,双联体病毒双联体病毒组中的每个成员均需具备两个元件，尽管这两个元件不必存在于同一个分子上，但它们必须是任意有功能的双联体病毒载体系统的组成部分。这两个元件就是一个复制起点和一个病毒复制必需蛋白。到目前为止，大多数双联体病毒载体都很简单，只缺失外壳蛋白编码基因，可用报告基因或其他感兴趣的基因取代。双联体病毒表达载体可以用于原生质体、培养细胞、叶圆片及植物

22、体等几种不同系统中外源基因的转移、扩增及表达。,RNA病毒RNA病毒大致可分为三类:第一类为单链RNA病毒，包括两种基本形式。一种形式是单一型病毒(monopartite)，其基因组RNA包括全部遗传信息，当作为一个单顺反子被翻译时通常很大，如烟草花叶病毒(TMV)。另一种形式是混合型病毒(multipartite)，正如其名称所示，基因组RNA分为若干部分，每一部分或被包装在同一个颗粒中或被包装在不同的颗粒中，如雀麦草花叶病毒(BMV)三个独立的颗粒包含了四个RNA分子。第二类即亚基因组RNA(如BMV的RNA)，它们不可能被用作载体，因为它们在感染植物中不能自我复制。第三类为卫星RNA，最

23、有可能被用作载体，因为它对病毒完全是可有可无的。,第五节常见的植物转基因方法,可分为3大类：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中。农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。,一、根癌农杆菌介导法,合适外植体的选择及再生系统的建立

24、,抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择,叶盘(或其他外植体)预培养(15天，非必须),农杆菌侵染(数秒、数分钟),共培养(23天)推迟筛选或筛选(培养基中加入抑菌抗生素和选择抗生素),抗性芽的获得,选择抗生素(如Km)中生根,农杆菌介导法进行植物基因转化的主要程序,转基因植株的获得,分子生物学检测,农杆菌转化法的分类根据所选外植体的不同，可分为以下3种方法：1.叶盘转化法2.原生质体共培养转化法3.整株感染法,农杆菌转化法优缺点：农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于一种纯生物学的方法，与其它转化方法相比具有明显的优点：它能将载体上特定区域内的目的基因导入细胞，并整合在染色体上

25、，这种方法仪器设备简单，操作容易，可直接用不同的植物组织进行基因转移；另外，这种方法外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝，可较稳定地表达和遗传到子代，转移DNA片段明确，可转移大片段DNA，并能保证导入的外源基因的完整性，转化频率高，费用相对低廉，再生植株可育率高。因此，农杆菌转化方法发展潜力巨大，其应用也越来越广泛。但是它最大的弱点就是寄主范围狭窄，主要应用于双子叶植物，农杆菌介导的单子叶植物转化直到20世纪90年代之后才取得一系列进展。近年来，由于在载体系统和转化方法研究上的进步，农杆菌已在转化水稻、玉米、小麦、石刁柏、黑麦草等单子叶植物上取得了成功。,二、基因枪法基因枪转化的步骤：1)受体细

26、胞或组织的准备和预处理；2)DNA微弹的制备；3)受体材料的轰击；4)轰击后外植体的培养和筛选。,.通过微弹轰击将DNA直接转移入植物细胞,基因枪的结构：,气压表气体加速管易裂片运动中的微弹靶细胞,DNA微粒载体的制备原理:CaCl对DNA有沉淀作用，亚精胺、聚乙二醇具有黏附作用，将这些化合物与DNA混合后与钨粉或金粉混合，吹干后，则DNA沉淀在载体颗粒上。影响基因枪法转化频率的主要因素：金属微粒的影响DNA沉淀辅助剂的影响DNA的纯度及浓度对转化率的影响微弹速度的影响植物材料内在的影响,基因枪转化法的优缺点：基因枪转化率差异很大，一般在10-310-2之间。相对于农杆菌介导的转化率要低得多。

27、而且基因枪转化成本高；所得的转化体中嵌合体比率较大；目前大多数只报道转化后的瞬时表达，而稳定遗传的比例甚差；外源DNA的整合机理等理论问题尚不清楚。此外，通过基因枪法整合进植物细胞基因组中的外源基因通常是多拷贝的，可导致植物自身的某些基因非正常表达，还可能发生共抑制现象(co-suppression)。即使这样，该方法得到了广泛应用，因其具有如下优点：无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。可控度高，操作简便迅速，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞；近代的高压放电基因枪或高压气体基因枪已可根据需要无级调控微弹的速率和射人浓度，可以较高的命中

28、率把DNA微粒载体射人特定层次的细胞，即感受态细胞和分生区细胞，从而为基因转化提供可靠的技术措施。受体类型广泛，基因枪技术可以选用易于再生的受体，避开原生质体再生的困难。它不仅以原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根为靶受体，而且种子的胚、分生组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。可将外源基因导入植物细胞的细胞器，并可得到稳定表达。,三、花粉管通道法花粉管通道法是一种较老的植物转化方法,是我国科学家周光宇在1983年首次在“MethodsinEnzymology”报道的研究成果。该技术的原理主要是授粉后使外源DNA能沿花粉管渗入,经过珠心通道进

29、入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。花粉管通道导入方法：花粉管通道操作方法通常有:微注射法、柱头滴加和花粉粒携带。其中,最初的操作方法是柱头滴加法,在以后的实践中,又根据植物的花器结构特征等,开发了一些新的花粉管通道导入外源DNA的技术方法,如子房注射法,即对于子房较大的受体,在授粉后使用微量注射器沿子房纵轴插入一定深度注射外源DNA溶液;或采用花粉粒携带法,即用待转基因的溶液处理花粉粒,用这种携带有外源基因的花粉粒授粉。,花粉管通道法优缺点：该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者

30、易于掌握；另外花粉管通道法具备无基因型限制和易于实现大规模基因转化的特点，可以在任何开花植物和不同物种之间实现基因的转移，使得受体物种在获得新的基因型的同时，也获得转基因所表达的新的表型性状，由此为农作物育种提供了创造新种质，拓宽基因库的崭新技术途径，并且已经成功应用于作物育种，获得了多种实用化的转基因农作物新品种(系)，应用于农作物生产。缺点是需要大量人工做大田转化，以便以千分之几的转化率仍能获得较多的转化子。山西省农科院生物技术中心的孙毅等又将次法进一步改善。他们在玉米盛花期将花粉收集起来，用含有外源目的基因的蔗糖溶液处理，后再人工授粉到原来的植株，以便带有目的基因的花粉能够自动经过花粉管

31、进入胚珠，形成转基因的合子。但其制约因素是处理后的花粉其授粉能力和育性降低。,四、其他转基因方法1.发根农杆菌介导转化法2.病毒介导转化法3植物基因的直接转移方法显微注射法：电穿孔法：微束激光打孔法：聚乙二醇法：脂质体法：超声波法：碳化硅纤维介导转化法：,病毒载体的遗传转化,第六节转基因植物筛选与鉴定,1生物学筛选2标记基因的表达检测3目的基因及其表达的分子鉴定以上筛选与鉴定方法，只有三种方法均证明为阳性的才可以真正称得上转化植株，而事实上有很多是假阳性植株，它们的生物学检测为阳性但筛选标记为阴性，分子鉴定也为阴性；另外一些则因为转入的基因沉默而尽管分子检测为阳性但生物学和筛选标记检测为阴性。

32、,1生物学筛选：即针对转基因应当表达的表现型直接应用生物学的方法进行鉴定以明确目的基因能否在受体植物中表达出目标性状及其表达水平，如抗虫性、抗病性等等。如转基因抗虫棉的抗虫性鉴定，可以直接利用棉铃虫的初孵幼虫来进行，转基因抗病棉的抗病性鉴定则可以直接在人工或天然病圃中进行。,2标记基因的表达检测：1.常用标记基因及其检测方法在植物转基因和基因表达调控研究中，经常要使用选择标记基因(selectivegene)。标记基因可分为选择基因和报告基因(reportergene)，二者都可以看做是标记基因，都起着标记目的基因是否成功转化的作用，但是它们又有着各自的特点。选择基因（又称选择标记基因），主要

33、是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因（如npt-基因和bar基因），这种基因在执行其选择功能时，通常存在检测慢（蛋白酶作用需要时间）、依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）等缺陷。而报告基因则是指其编码产物能够被快速测定、且不依赖于外界压力的一类基因。理想的报告基因通常具备如下基本要求：、受体细胞中不存在相应内源等位基因的活性；、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞；、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光素酶基因（luc）、-葡萄糖苷酸酶基因（gus）、冠瘿碱合成酶基因（nos）等。,常用标记基因的检测方法:npt-基因

34、的检测npt-基因来源于细菌转座子Tn5上ahpA2。该基因编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶(aminnogl-ycoside-3-phosphorransferase)，又称npt-(neomycinphosphotransferasc-)，该酶使氨基糖苷类抗生素(新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等)磷酸化而失活。此类抗生素抑制原核生物蛋白质生物合成70S起始复合体的生成，并阻碍了原核生物的蛋白质生物合成。该类抗生素对植物细胞表现毒性抗性的机制是与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，影响70S起始复合物生成，干扰叶绿体及线粒体的蛋白质生物合成，最终导致植物细胞死亡。,bar基因的

35、检测bar基因为抗除草剂基因，它编码PPT乙酰转移酶(PAT)。PAT是一种谷氨酸结构类似物，能竞争地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶(GS)的活性。该酶催化细胞内发生解氨毒的生化反应。当PPT存在时，GS活性被抑制，细胞内NH3积累，细胞中毒而死亡。bar基因编码的PPT乙酰转移酶可以催化乙酰CoA分子转移到PPT分子游离氨基上，使PPT乙酰化，乙酰化了的PPT失去对GS的抑制作用，因而转化了bar基因的植物表现出对除草剂PPT的抗性。bar基因表达产物PAT活性测定方法有硅胶G薄层层析法及DTNB比色分析法。,gus基因的检测GUS在转化的植物细胞内及提取液中很稳定，在叶肉原生质体中GUS的半衰

36、期为50h。GUS对较高温度及去污剂都有定的耐受性。GUS表现活性时不需要辅酶，催化作用的最适PH为5.28.0，对离子无特殊要求，可适应较宽的离子强度范围，但某些二价金属离子能抑制其活性。用于gus基因检测的常用底物有3种：5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)、4-甲基伞形酮酰-葡萄糖醛酸苷酯(4-MUG)及对硝基苯-葡萄糖醛酸苷(PNPG)。这三种底物分别用于如下不同的检测方法。1)X-Gluc的组织化学染色定位法2）4-甲基伞形酮酰-葡萄糖醛酸苷的荧光法测定GUS活性3）对硝基苯-匍萄糖酸苷的分光光度法,冠瘿碱合成酶基因（nos）的检测冠瘿碱合成酶(opinesynth

37、ase)基因存在于农杆菌Ti质粒或Ri质粒上，该基因与Ti质粒的致瘤作用无关，故载体构建时，有时保留该基因作为报告基因使用。该基因的启动子是真核生物启动子，在农杆菌中并不表达，整合到植物染色体上后才表达，它编码与冠瘿碱合成有关的酶，催化冠瘿碱合成。,荧光素酶基因(luc)的检测自20世纪60年代以来，人们陆续发现了多种结构不同的荧光素酶。它们可以催化生物自身发光反应。目前研究最多的是萤火虫及细菌产生的荧光素酶，各种荧光素的化学结构有一定差异，甚至完全不同。萤火虫荧光素酶催化的底物是8-羟基喹啉类，在镁离子、三磷酸腺苷及氧化作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，发射光子后转变成常态的

38、氧化荧光素，反应中化学能转变成光能。而细菌荧光素酶以脂肪为底物，需要还原型的黄素核甘酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。,其他标记基因或筛选方法除了以上各种标记基因之外有人还报道了其他一些安全的筛选标记或思路。生物合成基因利用生物合成基因作为筛选标记基因，可提高安全性。如某些支链氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸)的合成都要经过天冬氨酸的合成途径。其中赖氨酸是由天冬氨酸激酶和二羟基吡啶二羧基合酶催化合成的，两种酶都受赖氨酸的反馈抑制。细菌来源的这两种酶由于对赖氨酸不敏感，因此可作为植物转化的筛选标记，在含赖氨酸的培养基中转基因植株能够存活，而非转基因植株则因死亡而被淘汰。筛

39、选标记基因的失活为了减少抗性标记基因产物带来的不安全性，一些研究者还采用反义RNA基因、核糖裂解酶基因(ribozyrnes)或采用抗体基因等策略使筛选标记基因或基因产物失活。但这些方法的缺点是没有去除筛选标记基因，仍存在基因传播的可能性。正向筛选标记基因的使用所谓正向筛选(positiveselection)，是相对于负向筛选(negativeselection,即在筛选培养基上，转基因细胞能够存活，而非转基因细胞则被杀死)而言的;这种筛选方法有利于转基因细胞的生长及再生，而非转基因细胞只受到饥饿抑制而非被杀死。因此，这种筛选策略即命名为正向筛选，包括以下几种基因：异戊烯基转移酶基因(iso

40、pentenyltransferasegene,ipt)，木糖异构酶基因(xyloseisomerasegene,xylA)，磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannoseisomerasegene,pmi)和大肠杆菌-葡萄糖苷酸酶基因(-glucuronidasegene,gus)。,三、目的基因及其表达的分子鉴定Southern法与PCR法检测外源基因的整合Nouthern与RT-PCR检测外源基因的表达Western杂交检测外源基因表达蛋白的生成,第七节植物基因工程应用举例,一、植物基因工程中的目的基因植物基因工程中的目的基因大致可分以下几类：(1)抗植物病虫害基因(2)抗非生物胁迫

41、、改良作物产品质量的基因(3)改变植物其他性状的基因(4)植物医药基因,二、植物基因工程应用举例基因工程食品基因工程食品即转基因食品（transgenicfood或geneticallymodifiedfoods,GMFs），美国食品药品管理局（FDA）使用生物工程食品（bioengineeredfoods）一词，欧洲使用“新型食品”（novelfoods）一词把转基因食品包括在内。例如，随着人民生活水平的不断提高及大米对外贸易量的增加，稻米品质的改良日益引起人们的关注。稻米品质主要由碾磨品质、外观品质、蒸煮食味品质和营养品质所组成。,2009年10月，中国农业部批准了两种转基因水稻和一种转基

42、因玉米的安全证书，中国成为世界上首个批准主粮转基因种植的国家。农业部批准了的转基因植酸酶玉米这个品种，由中国农业科学院生物技术研究所范云六院士所带领的团队完成。该品种不抗虫，不抗病。“植酸酶玉米”主要是提高玉米产量,能令生猪消化更多的磷，从而减少来自动物粪便的污染,实现了以环保、节能的农业生产方式生产“绿色磷”的梦想。,研究成果在玉米自交系改良中，国内外学者利用花粉管通技术获得的品种有30多个。1986年Ohta在美国科学道技术取得了大量有价值的成果，据统计，每年利用此院报上报道应用外源DNA与玉米花粉混合授粉，得到F0转化率高达10的胚乳基因转移。,研究者还在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，

43、例如丁群星等研究发现玉米矮花叶病毒(MDMV)B株外壳蛋白在转基因植株中表现出对MDMV的抗性；张永胜等人还研究了将抗旱耐盐基因以及抗叶斑病基因导入玉米自交系中，并获得了初步成功.,转基因技术用于玉米品质改良赖氨酸是玉米蛋白质中限制性氨基酸，含量高低直接关系到玉米的营养价值。孙学辉等通过基因工程提高了玉米氨基酸的含量;Hoods等通过转基因玉米生产鸡蛋抗生素蛋白，并已进入商业化生产；孙学辉等采用育成18个转基因玉米自交系,蛋白质含量达到13.2%17.2,赖氨酸含量达到0.38%0.46，解决了赖氨酸和蛋白质不能同时提高的难题。,玉米谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及原核表达,东北农业大学从玉米嫩叶中

44、提取总RNA，通过RT-PCR的方法扩增出玉米谷氨酰胺转胺酶(TGase)全长基因，回收目的片段并测序，该基因编码区全长1605bp，编码535个氨基酸残基，分子量为60.9kD，与GenBank(登录号：AJ421525)上已发表的序列同源性为100%。按正确的阅读框架将玉米TGase基因片段定向克隆到表达载体pET-28a上，将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，mmol/LIPTG诱导融合蛋白表达，经凝胶分析软件测得蛋白表达量约占总蛋白的15%，以His-Tag抗体作为一抗，采用Western-blot方法检测目的蛋白，结果证明所表达的特异蛋白是带有His-Tag的重组融

45、合蛋白，利用Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE鉴定为单一条带，测得纯化后的TGase酶活力达到16U/mg。,玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究,我国现阶段种植的玉米品种中直链淀粉含量很低,仅占总淀粉含量的25%左右。淀粉分支酶是淀粉生物合成过程中的一个关键酶,它催化葡萄糖以-1,6键连接,形成分支结构.反义RNA(antisenseRNA,asRNA)技术,调控淀粉分支酶基因的表达,以期提高玉米中直链淀粉的含量.吉林农业大学应用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶be2a基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制

46、性内切酶分析,并进行序列比对。结果表明:克隆片段长度为562bp。将该基因反向插入到pWGLL载体Actin-pro启动子下游,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系“铁7922”,经PCR检测初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。,德国育出新型转基因玉米可引虫杀虫,德国科学家培育出一种转基因玉米，它可以通过释放一种吸引线虫的化学信号(一种来自牛至的(E)-石竹烯(EG，这是一种能吸引线虫的化学物质)合成基因)从而抵抗破坏性的根虫虫害，而线虫正是甲虫幼虫的天敌。,转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测,山东省农业科学院植物保护研究所采用基因组步移法和巢式PCR

47、方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和68bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。,转基因水果,“转基因水果”将成口服疫苗.注射疫苗往往会在儿童和部分成年人身上引起痛苦，此外，一些疫苗保存需要冷冻，而一些边远地区既没有电，也没有制冷设备，从而导致难以推行

48、疫苗普及接种。现在这种情况有可能在未来10年内成为历史。李家洋院士透露，目前，世界上有上百名科学家正在寻求开发口服疫苗，他们正在努力获得某种可人工控制的水果或蔬菜，人们在服用这些水果或蔬菜后，会对某种病毒或特定的病菌产生抵抗力。目前正在研究的口服疫苗包括乙肝、狂犬病、结核病的疫苗等。李家洋院士说，国际上非常有名的“金米”就是个典型的例子，这种大米里面有维生素A。,草莓转基因研究进展,草莓是一种经济价值较高的多年生草本植物,栽培面积和产量仅次于葡萄的第二大浆果。草莓是继核桃、苹果之后,第3个获得转基因植株的果树,从已有研究结果看,进展较为迅速,目前已经获得了抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂和品质改良等

49、方面的转基因植株。,抗虫害转基因研究目前在草莓中应用的抗虫基因主要豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTi)。1992年,James等首先开展了草莓抗虫转基因研究,他们将与几种鳞翅目和鞘翅目害虫抗性有关的CpTi基因转入草莓品种“Raoella”中,获得了转基因植株。藤象甲幼虫饲喂试验结果表明,在转基因植株上幼虫的成活率为80%90%。接着,Graham等将CpTi基因导入草莓,在温室中对其进行生物学检测表明转化植株在第三年仍能有效的减少大田中藤象甲及其虫蛹造成的损失,与对照相比,转基因草莓的生长明显得到改进,藤象甲的数量大大减少。,RIP和TCS双价转基因草莓抗草莓镶脉病毒鉴定,东北农业大学园艺学院

50、2008年用小叶嫁接法对农杆菌转化RIP(核糖体失活蛋白Ribosome-inactivatingprtein)和TCS(天花粉蛋白Trichosanthin,是核糖体失活蛋白的一种,它是中草药天花粉的有效成分,天花粉蛋白不但在医学方面有很重要的价值,而且与植物的防御反应相关,它对病毒、真菌和昆虫有直接或间接的抑制和杀灭作用。)双价抗病毒基因所获得的草莓品种森嘎拉,和戈雷拉转基因植株接种草莓镶脉病毒,采用PCR方法检测嫁接成活后的转基因草莓苗草莓镶脉病毒。结果表明:这2个品种的转基因植株均有部分植株未扩增出草莓镶脉病毒特异条带,说明转入的外源基,草莓annfaf基因反义融合表达载体构建及转基因

51、植株的获得,大连理工大学生物工程学院2006年建立研究草莓果实膜联蛋白基因annfaf功能体系。利用反义基因技术将从草莓成熟果实中分离克隆的annfaf基因定向克隆至植物中间表达载体pROK，构建了annfaf反义融合基因植物表达载体pRRJ4，通过根癌农杆菌EHA105将其导入草莓基因组。对获得的抗性植株进行PCR和Southern检测分析。表明该反义基因已整合到草莓基因组中。,根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得,2009年陕西省生物技术重点实验室以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N-乙酰转移酶(AANAT)和羟吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)基

52、因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southernblot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。,转基因花卉植物一家花卉公司的广告这样说道：“你想拥有一束蓝色的月季吗？你想订购一束长开不败的鲜花吗？你想要怎样的一束鲜花，只要你描绘一下心中的形象，我们便能为你创造出你想的花卉”大家听了或许会感到奇怪：月季怎么会有蓝色的？花儿怎可能长开不败？这是不是骗人公司？不，这是事实！这是一种运用新型的生物技术创造出来的一种转基因花。这种花不但有以上特性，还有许多奇妙的性状，如果你想了解这五彩缤纷的花，就让

53、我送你一束转基因花,花色是给人们的第一印象，人们看花，首先是观花色。,花色丰富多彩是转基因花卉的一个重要特征。现在人们已经能够通过转基因技术任意改变和调整花的颜色。湖北大学生物科学院“特异花卉克隆与基因工程创新”科研课题，最近取得重大进展。他们通过研究发现，只要通过基因工程技术破译出花的色素基因，将花色基因和可调节基因克隆出来，导入所需培育的花卉里面，就可以培育出特异花卉，形成一花多色甚至是“七色花”。现在选育成功的情侣夜来香、大丽菊、蝴蝶兰、桃花等特异花，开出了2种至3种颜色、条纹状与星点状组合的花朵，其观赏性是普通花难以比拟的。目前，课题组正利用已发现的名贵花卉变异体现象，把郁金香、洋牡丹

54、、兰花、剑兰等世界10种名贵花卉和中国10大名花变成特异花卉，同时研究创造能在黑夜里发光的“夜光兰”新类型花卉。,花色主要由类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素三大类色素决定，这些色素一般存在于液泡中。其中，类黄酮色素中的花色素对花色形成起主要作用，控制着花的粉红色、红色、紫罗兰色和蓝色。目前已克隆出许多影响花色苷代谢的基因，例如欧芹的CHS、金鱼草的DFR、矮牵牛的pH6基因等。研究人员在此基础上采用反义RNA技术、共抑制技术及过量表达新基因等技术手段已实现了对花色的修饰。1987年，有人将调控黄酮生物合成的基因导入矮牵牛，使其产生新的颜色砖红色，首次实现了对花色的调控。苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）

55、是花色素合成的限制酶，其表达量的变化影响花色的形成。,1998年，有人将反义CHS基因转化矮牵牛，抑制其色素合成系统，使花色由紫色变为白色。采用同样的方法，1994年，有人转化粉色菊花而得到白色菊花，检测到白色中CHS合成酶前体大量积累，可能是CHS合成酶受到抑制。1996年，邵莉等人采用共抑制方法，通过CHS基因的导入得到了白紫色相间的矮牵牛基因花。2000年，日本科学家将反义DFR和反义CHS基因导入蓝猪耳，发现转反义DFR基因的蓝猪耳花色更蓝，这可能与DFR被抑制引起黄酮类物质积累有关。得4国一家公司的研究人员发现月季不能呈现蓝色是由于自身不含编码蓝色素基因。该公司将分离的相关基因导入矮

56、牵牛（1991年）、月季及康乃馨、菊花、蔷薇（1995年），均得到理想结果。在很多植物中，花色也受到花瓣细胞液泡中pH值的影响。1995年，有人利用玉米转座子Ac元件从矮牵牛中分离到调控花瓣pH值的基因pH6，该基因通过调控液泡中的pH值来影响花色素苷的表达。进一步采用反义RNA技术抑制月季中的pH6基因，使液泡中的pH值升高，从而迎来了蓝色月季的诞生。,转基因花卉的形态也会千变万化花卉形态是花卉的重要组成部分，因此，改良花卉形态长期以来一直是科学工作者研究的重点之一。花卉形态改良包括花器官形态、花枝着生状态、花序类型、植株形态的改良等。转基因育种研究在改变形态方面也取得了进展。德国研究人员将一种基因导入蔷薇，使植株枝数和花数大幅度增加。研究人员还发现，金鱼草和兰花的花朵不具辐射对称是由控制花卉形状的基因所控制。花卉形态改良包括花器官形态、花枝着生状态、花序类型、植株形态的改良等。研究人员已从拟南芥和金鱼草中分离了控制花枝生长、花序及植物形态的基因，并实现了对花卉形态的调控。日本研究人员将调控激动素水平的