课题1DNA的粗提取与鉴定上课课件.ppt

1、5.1DNA的粗提取和鉴定，广东省惠州市田家炳中学qigailee，第一部分：基础知识，1，基础知识，(1)提取DNA的方法，1 .提取生物高分子的基本想法，一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物高分子，2.d 提取DNA，去除其他成分的DNA和RNA，利用蛋白质和脂质等的物理和化学性质不同，DNA的溶解性，DNA和蛋白质等成分，利用在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同的特征，选择适当的盐浓度，就能充分溶解DNA， 可以使杂质沉淀，或者溶解其他成分，析出DNA，3.DNA等大分子的理化性质，DNA不溶于醇溶液，而细胞中的一部分蛋白质溶于醇。 进一步分离DNA和蛋白质。 DNA不

2、溶于醇溶液；DNA具有酶、高温和对洗涤剂的耐性；蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响；高温的蛋白质大部分不能承受6080，DNA在80以上变质；洗涤剂3 除去脂质和蛋白质对DNA没有影响，1，试剂：(2)DNA的鉴定，条件：二苯胺，沸水浴条件下，DNA被二苯胺染色，请考虑沸水浴，现象：甲基绿(绿)。 必修1，能鉴定DNA的是什么？第二部分：实验操作：(一)实验材料的选择，(二)破碎细胞，获得含有DNA的滤液，(三)除去(精制)滤液中的杂质，(四) DNA的析出和鉴定，二，实验设计，视频广播，难点：实验操作过程，(一)。 (其中选择23种实验材料)，2、原则：选择DNA含量相对高、容易提取的生物组

3、织。鸡血，3，合适材料：从核DNA数来看，猪38只，鸡78只，哺乳动物血0只，猕猴桃58只，洋葱16只，豌豆14只，菠菜12只，大肠菌1只。 鸟类的血核很大，DNA不需要破坏细胞壁哺乳动物的血球核和细胞器。 液体培养基中的大肠杆菌的DNA量很少。 (二)破碎细胞，得到含DNA的滤液，1、动物细胞，容易破碎，鸡血球溶液：一边加入一定量的蒸馏水，一边用玻璃棒搅拌，过滤，收集滤液，请考虑一下：为什么加入蒸馏水会使鸡血球破裂？ 蒸馏水对鸡血球来说是低渗透液体，水分大量进入血球，加上使血球膨胀的搅拌作用，加速鸡血球细胞膜、核膜的破裂，放出DNA，破碎细胞壁，放出核内的DNA。 研磨不充分的话，提取的DN

4、A量减少，看不到丝状的沉淀物，或者用二苯胺显示不出蓝色。 请考虑一下。 研磨的目的是什么？ 如果研磨不充分，对实验结果会有什么样的影响呢？1.DNA的溶解性，(3)除去滤液中的杂质，提案1，向滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，加入蒸馏水，NaCl溶液浓度为0.14mol/L 为什么反复溶解和析出DNA，能除去杂质？a :能用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去用高盐溶液不能溶解的杂质？用低盐溶液使DNA析出，就能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过重复DNA溶解和析出，可以除去与DNA的溶解度不同的很多杂质，(4)鉴定为DNA的析出，静置与滤液体积相同的冷

5、却醇溶液(体积分率95% )、2-3min，溶液中出现白色丝状物，粗提取DNA的玻璃棒卷起线状物，用滤纸吸收上面的水，1，DNA的析出，1.DNA的溶解性，2.DNA的酶，对高温和洗涤剂的耐性，(3)除去滤液中的杂质，研究提案2和提案3的原理如何不同的方案2 :用蛋白酶分解杂质蛋白质， 分离提取的DNA和蛋白质的提案3 :利用DNA和蛋白质的耐高温性的差异，对蛋白质进行改性，与DNA分离，(4)dna的析出和鉴定，与滤液体积相同的冷却醇溶液(体积分率95% )，静置2-3min后，在溶液中白色的丝状物 用玻璃棒向一个方向搅拌，卷起线状物，用滤纸吸收上面的水、1、DNA的析出2.DNA的鉴定二苯

6、胺，在2根试管中分别放入2mol/LNaCl溶液5ml在2根试管中放入DNA线状物；分别进行二苯胺试验2根试管溶液的颜色变化观察现象：将溶解有丝状物的溶液变成蓝色进行比较，实验操作，4，上课前准备鸡血球液，取质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸纳米溶液(抗凝固剂) 100ml，放入500ml烧杯中。 注入新鲜的鸡血(约180ml )，同时用玻璃棒搅拌，充分混合血液和柠檬酸纳米溶液，防止血液凝固。 把烧杯的血液放入冰箱，精选一天使血球沉淀。 (也可以将血液流入离心管内，用1000r/min (每分钟旋转)的离心机离心2min，使血球沉淀在离心管的底部。 实验时。 用吸管除去离心管上部的澄清液，就能得

7、到鸡血球液。 )过程，柠檬酸钠作用，防止血液凝固，作用机制，柠檬酸钠与血浆中的Ca2反应生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2大幅减少，血液不凝固，鸡血球破碎后释放的DNA容易吸附在玻璃容器上， 为了减少提取过程中DNA的损失，最好使用塑料烧杯和试管加入鸡血细胞液，注意事项：提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液a :血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清为血浆在烧杯中加入20mL蒸馏水，同时用玻璃棒充分搅拌5分钟，使血球加速破裂。 然后，用装有纱布的漏斗将血液细胞液过滤到500mL。 去除滤液。 提取鸡血球的核物质，探讨：a :细胞内的浓度比周围溶液的浓度大

8、的话，细胞吸水膨胀，(1)为什么加入蒸馏水？ 加入蒸馏水后细胞会发生什么样的变化？(2)用玻璃棒搅拌有什么意义？ a :用玻璃棒搅拌会加速血球和核的破裂。 注意一个方向快点搅拌。 但是，速度太快，不能防止破坏DNA。 (3)正在过滤什么物质？ 得到的是什么a :过滤的是细胞膜和核膜等物质，得到的是与蛋白质等物质结合的DNA，溶解核内的DNA，将氯化钠的物质浓度为2mol的溶解40mL加入滤液中，用玻璃棒单向搅拌1min均匀混合时此时，烧杯中出现线状物，观察了线状物的颜色。 如果继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会增加。当粘稠物不增加时停止添加蒸馏水(此时，溶液中的氯化钠的物质浓度相当于0.14

9、mol/L )，析出含有DNA的粘稠物，研究添加蒸馏水的目的，将NaCl溶液的浓度降低到DNA溶解度最低，从NaCl溶液中析出DNA，从溶液中的实验应缓慢加入蒸馏水，轻轻地单向均匀搅拌，促进DNA分子的附着和缠绕。 注意：将含有DNA的粘稠物过滤，用装有纱布的漏斗从过滤工序3的溶液中放入500mL的烧杯，将含有DNA的粘稠物留在纱布中，再溶解DNA的粘稠物，取1个50mL烧杯，在烧杯中放入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹在氯化钠溶液中，用玻璃不断搅拌，尽量将粘稠物溶解在溶液中，过滤含有DNA的氯化钠溶液，取一个100mL烧杯，用装有两层纱布的漏斗过滤工序5的

10、溶液。 取出该滤液后，DNA溶解于滤液中，提取杂质少的DNA，在上述过滤后的溶液中，加入冷却后的醇的体积分率为95%的溶液50mL (使用冷却后的醇，DNA的凝聚效果高)，用玻璃棒搅拌的话，溶液中杂质少的线状物用玻璃棒卷起线状物，用滤纸吸收上面的水分。 这个丝状物的主要成分是DNA，答案： DNA不溶于冷酒精，其他物质溶于醇，析出杂质少的DNA丝状物，使之悬浮在溶液中，研究丝状物是什么颜色的a :白，(1)为什么加入50mL的冷酒精？ 加入加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5mL，将丝状物放入一个试管中，用玻璃棒搅拌溶解丝状物。 接着，在两根试管中分别加入4mlL的二苯胺试剂

11、。 混合均匀后，将试管放入沸水中加热5min，冷却试管后，观察两个试管溶液颜色的变化进行比较，(1)比较两个试管溶液的颜色，有什么区别a :提取的丝状物是DNA，(3)DNA的直径约为2010-10m a:DNA分子的直径只有2nm。 线状物是多个DNA子聚集而形成的，8个工序，1 .制备鸡血球液，提取鸡血核物质，2 .溶解核内DNA，3 .析出DNA粘稠物，4 .过滤DNA粘稠物，5 .再溶解DNA粘稠物，过滤含有6.DNA的NaCL溶液8.DNA的鉴定、1 .加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血液凝固，2 .溶解加速血球破裂的DNA，将2mol/L的NaCl溶液稀释成0.14mol/L，最大限度

12、地释放DNA，将含有、DNA的粘稠物残留在纱布上，将DNA 除去含有DNA的滤液中的杂质，提取DNA，A蓝色b没有变化，观察提取的DNA的颜色，说明如果不是白色丝状物，DNA中的杂质多的二苯胺的判定基本成功进行了蓝色的说明实验，没有蓝色的说明，提取的DNA的含量就低或者实验操作可能有错误，需要重新调制，四、课题成果评价，(一)是否提取了DNA，本实验提取的DNA粗制品中可能还含有核蛋白、多糖类等杂质，(二)分析DNA中的杂质，(三)不同的果实首先选择不同的实验材料，其次同种材料可以采用不同的方法。 实验结果从多方面比较了DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺发色的浓淡等，看哪种实验材料、哪种提取方

13、法的效果更好。 a :整个实验回答“蒸馏水2次，过滤3次，析出2次，搅拌6次”，6，讨论：1 )蒸馏水2次，第一次：细胞吸水膨胀第二次： DNA粘稠物析出，(1)在该实验过程中使用了几次蒸馏水，过滤几次，析出几次，搅拌几次？ 分别是哪个步骤？过滤使用的纱布的层数与滤液或粘稠物有关，第二次使用通过滤液过滤的粘稠物有关，因此，多层使用纱布，第一次和第三次使用滤液，纱布为1-2层，三次过滤， 第一次：滤液中存在DNA的第二次：滤液中存在DNA的第三次：滤液中存在DNA，二次析出，第一次： 0.14mol/L的NaCI溶液中含有很多杂质，第二次：冷却的95%中，除了最后一次以外，其馀不要向一个方向搅拌

14、玻璃棒请不要刺入烧杯的底部。 请不要弄坏烧杯。 1、鸡血细胞液的制备过程中加入柠檬酸钠的目的是： () a .防止凝血，加快b.DNA的析出，c.DNA的溶解，d .加快凝血，练习，a， 2、DNA溶解度最低时，NaCl的物质浓度为() a2mol/lb 0.1 mol/LC 0.14 mol/LD 0.015 mol/L3，不断地在溶解DNA的NaCl溶液中加入蒸馏水的目的是()加快aDNA溶解的速度b，加快溶解杂质的速度c，提高DNA 通过加快DNA析出d，减少杂质的溶解度，加快杂质的析出，在溶解有c、c、4、DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断地加入蒸馏水，在该过程中，DNA溶解度的

15、变化状况分别是a减少，b的增大减小，c先减少，则增大d增大析出溶解了DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA的最有效方法是，在a中加入蒸馏水b，在矿泉水c中加入清水d，加入生理盐水，6、关于DNA粘稠物的析出的记述， 不正确的是，在操作a时缓慢滴下蒸馏水，降低DNA的溶解度，在操作b时用巴尔巴轻轻搅拌，在DNA分子的完全c中加入蒸馏水，同时降低DNA和蛋白质的溶解度，d线状粘稠物不增加时，NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，7 可以用其他方法鉴定DNA吗？用甲基绿色染液。 丝状呈绿色。 8、DNA遇到二苯胺，被a硅红、b、c、紫、d染上，探讨建议2和建议3的原理如何不同的方案2 :用蛋

16、白酶分解杂质蛋白，分离提取的DNA和蛋白质的方案3:DNA和蛋白质的提案三、将滤液放入60750C恒温水槽中保温1015分钟。 2、DNA酶、耐高温和耐洗涤剂、练习、1、提取DNA的实验操作的主要步骤目的请说明。 a :提取DNA的第一步是材料的选择，其目的是选择DNA含量高的生物材料。 否则，实验中由于一些损失而难以检测的第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，必须尽可能溶解细胞内的DNA的第三步是DNA的精制，即DNA的溶解特性、对酶和高温的耐性的差异等特性最大限度分离DNA和杂质的最后一步是鉴定DNA，这是实验整体结果的检查。 你觉得从细胞中提取特定蛋白质和提取DNA一样简单吗？ a :提取蛋白质比提取DNA更难。 这是因为蛋白质比DNA对温度、盐浓度、pH等条件敏感，容易失活，另外，蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，蛋白质的提取没有统一的方法，可以根据特定的蛋白质的特性探索提取的条件，找出特定的方法(二)案例二：以油菜花为实验材料进行DNA粗提取，1、上课前准备，把新鲜油菜花和体积分