《肿瘤模型》PPT课件

1、肿瘤动物模型,贵阳医学院病理生理学教研室杨勤,恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，与病毒性疾病、老年性疾病并称为现代医学的三大挑战，其发病机制尚未完全阐明，治疗效果亦不尽人意。,肿瘤学分临床肿瘤学与实验肿瘤学。实验肿瘤学是以动物为主要研究对象，探讨与肿瘤有关的各方面课题。肿瘤动物模型，作为实验假说和临床假说的实验基础，可为研究恶性肿瘤的病因学、发展过程和治疗提供特有的条件。,一、实验动物肿瘤模型的选择与应用自发肿瘤模型诱发性肿瘤模型移植性肿瘤模型转基因动物模型,(一)自发肿瘤模型,实验动物种群中不经有意识的人工实验处置而自然发生的一类肿瘤称之为自发性肿瘤。自发性肿瘤发生的类型和发病

2、率可随实验动物的种属、品系及类型的不同而各有差异。某个近交品系动物在一定年龄内，可以发生一定比例的某种自发性肿瘤。肿瘤实验研究中，一般应当选用高发病率的实验动物肿瘤模型作为研究对象，而低发病率的肿瘤模型可以用作为对照。,优点：（1）比诱发的肿瘤与人类所发生的肿瘤更为相似，有利于将动物实验结果推广到人。（2）发生的条件比较自然，有可能发现环境的或其他的致癌因素，可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用。缺点：（1）肿瘤的发生情况可能参差不齐，不可能在短期内获得大量肿瘤材料，较少应用。(2)观察时间较长，实验耗费较大。,自发肿瘤多数为病毒性，如C3H小鼠出生后有较高的乳腺癌发生率。A系小鼠出生后18

3、个月内有90%的肺癌发生率。AK和C57小鼠有高的白血病发生率等。目前已培育了许多种小鼠自发肿瘤，从肿瘤发生学上看，这些自发瘤与人体肿瘤相似，进行肿瘤发病学和药物筛选等实验应属理想。但由于不易同时获得大批病程相似的自发瘤动物，又因这种肿瘤生长较慢，实验周期相对较长，所以一般很少用于筛药。,当前新药研究中自发肿瘤模型应用最多的是小鼠自发乳腺癌，常用C3H小鼠或BALA/C雌鼠与DBA/2雄鼠杂交的第一代CD-2f-1小鼠（自发乳腺癌），它们于生后10个半月可摸到肿瘤，而后生存20-35天死亡。大量繁殖此类小鼠，自发瘤可高达70%，一般摸到肿块分组给药，观察其平均生存时间的延长率来评价药物的疗效。

4、,（二）诱发性肿瘤模型,是指用化学致癌物、射线、病毒等在各类动物中诱发不同类型的肿瘤。一般是利用致癌物质通过口服、注入、埋藏和涂抹等方式使动物诱发成各种肿瘤。,优点：（1）诱发性肿瘤与人体肿瘤较为近似，故此类模型常用于特定目的深入研究。（2）肿瘤生长较慢，瘤细胞增殖比率低，倍增时间长，更类似人肿瘤细胞动力学特征，常用于综合化疗或肿瘤预防方面的研究。缺点：（1）致癌物的诱癌过程需时较长，（2）成功率多数达不到100%，(3)肿瘤发生个体差异较大，不易同时获得癌块大小均一的动物供实验研究用故不常用于药物筛选。,应用时要注意各类化学致癌剂对动物致癌的特点：芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点通常需要长期、

5、大量给药才能致癌；肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；有明显的种属差异；其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，二甲基黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。,亚硝胺类致癌物的特点：致癌性强，小剂量一次给药即可致癌；对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物）的许多器官（包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤；具有不同结构的

6、亚硝胺有明显的器官亲和性，例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌，不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌；在大鼠，二丁基亚硝胺能引起膀胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍则能引起胃肠癌。,黄曲霉毒素的致癌特点黄曲霉毒素的毒性很强，很小剂量（1mg/kg体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死；其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，是已知化学致癌物中作用最强者。它能诱发多种动物（从鱼到猴）的肝癌，也可引起肾、胃及结肠的腺癌，滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌；注入皮下可引起局部的肉瘤，还有报告认为，它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。,在动物实验中早

7、已确定：乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌；乌拉坦（氨基甲酸乙酯）/氨乙胺可引起小鼠的肺癌；一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。二甲基苯蒽（DMBA）诱发大鼠乳腺癌试验为例，取鼠龄2月的Sprague-Dawley雄鼠，单次灌喂麻油溶解DMBA20mg，肿瘤自60天开始生长，至120天癌发生率达63100%。此时开始分组给药,并每周测瘤大小及记录死亡时间作为疗效指标。,几种常见的诱发性肿瘤动物模型的复制,1肝癌：（1）二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌大鼠：性别、年龄不拘，普通饮食，随意饮水，给药：0.25%DEN水溶液0.251ml灌胃,或稀释10倍放在饮水中自由饮用,剂量约210ml/

8、Kg.d。时间：半年左右，再观察12月。诱癌率可达70%。,（2）二甲基黄/双甲氨基偶氮苯（DAB）大鼠：体重200克左右，雄性，以DAB溶于植物油中（6%）拌染白米饲养，每日供给一定量的青菜和足够饮水。时间：150天（5个月左右），DAB总摄入量为1.66g2.03g。一般3个月左右即可出现颗粒肝硬变。诱癌率73.6100%。结果：单发或多中心发生。镜下常是肝细胞型肝癌，其次是混合型肝癌，少数为胆管型肝癌。肝癌的发生率及转移率与投药剂量及投药时间存在着正比。晚期往往有血性腹水。,注意事项：（1）DAB属脂溶性试剂，溶剂以植物油为宜，用动物油可影响肝癌发病率。（2）必须给予精白米，因糙白米会影

9、响其发病。（3）诱发此模型必须限制各种营养物质，否则也影响肝癌形成。,2胃癌（1）甲基胆蒽诱发小鼠胃腺癌小鼠：20g左右，方法：无菌手术下，在胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结（含MC线结是普通细线，将线结置于盛有MC的小玻璃管内，在酒精灯上加热，使MC液化渗入线结。MC浓度为0.050.1g/20根）.结果：手术埋线后48月可成功诱发胃腺癌。,(2)亚硝胺诱发小鼠胃癌动物：小鼠方法：按0.25mg/Kg体重灌胃不对称亚硝胺，结果：3个月后全部动物发生胃乳头状癌，78月后有85100%发生前胃癌。,3.诱发性肺癌动物模型（1）二乙基硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌动物：小鼠方法：每周皮下注射1%浓度

10、的DEN水溶液一次，每次剂量为56mg/kg。DEN总剂量达868mg，观察时间为100天左右，发癌率40%，而DEN总量达1176mg，观察时间半年左右，发癌率94%，其中40%是支气管鳞癌。,（2）乌拉坦诱发肺腺癌动物：A系小鼠，11.5月龄比大鼠敏感，方法;每次每只腹腔注射乌拉坦生理盐水液0.10.3ml，间隔35天再注，共注23个月，每只小鼠用量约100mg。结果：乌拉坦注射后3个月，肺腺癌发生率为100%，且多数为多发性的，这种诱发瘤为良性，诱发肺肿瘤的部位和组织分型与人类肿瘤相近似。,4.诱发膀胱癌动物：F344雄鼠，250克左右方法：用含N甲酰胺（FANFT）饲料喂养断奶的大鼠即

11、可。如果这大鼠终身服用FANFT或服2536周，随机控制饮食，所有大鼠在20月龄前死于膀胱癌。结果：在服用之后2周内，所有大鼠膀胱均出现增生损害，服用8周后，伴随增生损害的增加，出现结节状和乳头状的损害，尤其是结节状损害逐渐扩大膀胱腔，如果大鼠存活时间足够长，肿瘤可穿过肌层侵润到周围组织。,12甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱发膀胱癌动物：大白鼠诱癌剂：12甲基亚硝基脲(12methyl-1，2nitrosourea,MNU)方法：少量多次膀胱灌注,即每次2mg/只,每2周1次,共4次。结果：不同时期进行动态观察发现第八周10/10只大鼠出现膀胱癌,主要为表浅膀胱癌。第十周6/10只大鼠为浸润

12、癌。MNU诱发的肿瘤发生、发展经历了从单纯增生乳头状、结节状良性增生乳头状肿瘤非浸润癌浸润癌这样一个典型病理过程。证明了MNU膀胱灌注具有膀胱特异性,该法诱导的膀胱肿瘤组织学形态及病理特征与人膀胱肿瘤十分相似。,二甲基砷酸诱导大鼠膀胱癌原理：二甲基砷酸(dimethylarsinicacid,DMA)是砷在大多数哺乳动物体内的主要代谢产物,DMA的致癌效应与氧化应激作用有关和/或细胞周期调节蛋白p27kip1、细胞周期蛋白D1的改变有关。在分子水平上,DMA诱导产生的膀胱肿瘤有较低的H-ras基因突变,而无p53、K2ras基因的突变。动物：F344大鼠，雄性10周龄方法：口服不同浓度的DMA

13、(0,12.5,50和200mg/L)结果：从实验的第97周开始有大鼠出现肿瘤。在第100周时,50mg/L组的31只大鼠中有8只发生肿瘤200mg/L组有16只发生肿瘤另两组(0,12.5mg/LDMA）无肿瘤发生。特点：所产生的肿瘤具有膀胱特异性,主要为移行细胞癌,5.乳腺癌二甲基苯蒽（DMBA）诱发大鼠乳腺癌动物：Sprague-Dawley雄鼠，2月龄方法：单次灌喂麻油溶解DMBA20mg，结果：肿瘤自60天开始生长，至120天癌发生率达63100%。此时开始分组给药,并每周测瘤大小及记录死亡时间作为疗效指标。,(三)移植性肿瘤模型,移植性肿瘤动物模型，是把动物或人的肿瘤移植到同系、同

14、种或异种动物体内，经传代后，组织类型和生长特性已趋稳定，并能在受体动物中继续传代，又可称为移植性肿瘤细胞。,移植性肿瘤动物模型分类同种肿瘤移植性肿瘤模型人体肿瘤的异种移植性肿瘤模型移植性肿瘤动物模型优点具有特性明确、生长一致性好、实验周期短、瘤株分布广泛、可反复复制等优点，在肿瘤研究中占有重要地位。,1.同种肿瘤移植性肿瘤模型,将肿瘤细胞接种在同一种属动物体内并将它传代，是国内、外最常用的肿瘤动物模型复制方法之一。1843年Klencke将动物肿瘤同种移植获得成功。1914年美国纽约的克罗克(Crocker)实验室，用一只雄性小鼠腋部自发的肿瘤接种后，建立了小鼠肉瘤180(S一18O)。195

15、6年FoleyGE将小鼠体内传代的肉瘤体外培养，建立了CCRFS1801958年，中国医科院将其引进国内，传代至今，广泛应用。,1952年前苏联科学家利用化学诱癌剂在C3HA小鼠诱发出肝癌，并建立小鼠肝癌细胞系H22。国内、外的科学家已经建立起许多不同起源和不同特性的可移植性肿瘤细胞系或株。50年代以来，我国已经建立的瘤株中，实体瘤近80种，其余还有许多腹水瘤细胞系或株，但多数并未被广泛的应用。目前世界上大约保有近500种动物移植瘤株，但常用的只有40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤株。,国内、外常用在肿瘤研究和抗肿瘤药物筛选实验中的可移植性肿瘤细胞系(或株)如：小鼠肉瘤一180、肉

16、瘤37(S一37)、小鼠淋巴细胞白血病L一1210和p388、艾氏腹水瘤、小鼠网织细胞白血病615、Harding-Passey黑色素瘤、未分化型胶质瘤G422、黑色素瘤B一16、Friehd病毒白血病、小鼠肝癌H22、Lewis肺癌、小鼠乳腺癌(M5076)、大鼠Walker一256和吉田肉瘤等。目前肿瘤化疗所应用的大多数药物都经过动物移植性试验而被发现，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型。,对于科学实验，瘤株生物学特性的稳定至关重要。其主要生物学特性包括：传代后的组织学类型；生长特性(接种成活率、生长速度、自动消退率、宿主寿命与宿主反应等)；侵袭和转移特性以及对化疗药物敏感性等。建立一个

17、新的瘤株，为达到可靠的稳定性，通常需连续传代1520代。,优点（1）接种一定量瘤细胞可使一群动物带有同样的肿瘤生长速率一致，个体差异较小，接种存活率近100%（2）对宿主的影响也类似，易于客观判断疗效，（3）可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留（4）试验周期一般均较短。缺点（1）这类肿瘤生长速度快增殖比率高，体积倍增时间短，这些都是与人类肿瘤显著不同点，特别是与人的实体瘤差别更大。许多国家筛选抗癌药物中选用的移植瘤株经常改变，主要原因可能也与此有关。,小鼠SRS实体型淋巴细胞肉瘤,1971年程立等应用L6565病毒性白血小鼠胸腺悬液，接种于昆明种小鼠腹腔，建立了SRS腹水型瘤株。腹水瘤细胞

18、接种于小鼠皮下，均可产生SRS淋巴肉瘤，移植率为100%，这种瘤细胞对各种抗癌药比较敏感。实体瘤可以称重，筛选抗癌药效明确。,方法：取SRS腹水瘤病鼠，处死后，抽取腹水生理盐水1：1稀释（或在计数池内计数肿瘤细胞数）按2106个细胞/0.2ml浓度给每只成年昆明种小鼠右腋皮下接种0.2ml，100%产生实体型淋巴细胞瘤病鼠平均存活时间23.6天（1132天）。,在实体瘤生长过程中，外周血白细胞总数增高，病鼠皮下肿瘤组织在接种后第3天，光镜下即可见广泛细胞侵润，第6天瘤细胞生长旺盛，分裂相增多，9天可见瘤块中央部分出现坏死区域，以后随时间延长，坏死区域逐渐增大，形成液化的囊腔。,注意事项：（1）

19、2106个/只可100%发生实体瘤，2105个/只，只有90%发生实体瘤。（2）采用810天SRS腹水瘤小鼠腹水为乳白色为佳（3）在多种小鼠（C57，BALB/C）等移植发生率高,将人体或其它动物肿瘤移植在另一种属动物的身上使其生长发育，是建立肿瘤动物模型的另一种重要方法。1834年leidy将人类肿瘤接种于蛙的皮下，获得人肿瘤异种移植片。20世纪初已有将人肿瘤接种于鸡胚尿囊膜，移植于异种动物眼前房或脑内、皮下或粘膜移植等异种移植成功的报道。虽有一定比例的存活率，但因肿瘤生长缓慢又受植入部位包膜的限制，往往肿块生长较小，且面临最大的困难是移植物受到宿主免疫排斥、生长缓慢、不能长期传代和不便于观

20、察等，更不能适应需要较多瘤源的实验治疗工作。,2人体肿瘤的异种移植性肿瘤模型,早期工作是将人体肿瘤移植于动物缺乏免疫防御机能的特殊部位。近些年来将人体肿瘤移植于人工制造的免疫缺陷动物体内。将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物，因能保持其生物学特性，用于研究人体肿瘤对药物的敏感性有较大的帮助而日益受到各方面的重视。,人工制造免疫缺陷动物方法：先将动物胸腺切除然后用900拉德的大剂量照射再进行肿瘤细胞移植肿瘤才能生长,由于异种移植需要附加因子，不同于它们在人体的自然条件下，对药物的反应也可能不同。但由于具有病情类似人体的优点，故也广泛应用。根据研究目的不同，可以选择不同部位移植肿瘤，常用的体内模型部位包括

21、：背侧皮下，爪垫皮下，肌肉内，腹腔内，肾包膜皮下，睾丸包膜皮下，耳廓皮下，视网膜内界膜，尾部移植及肝内等。,1962年Grist在非近交系小鼠中发现无毛小鼠，Flanagan1966年将其命名为裸鼠(Nude)，1968年Pantelouvis发现这种动物为无毛、无胸腺动物可能直接作为人体肿瘤异种移植的接受体，不需进行附加因子的处理，可使人体肿瘤移植后生长良好。1969年RaygardJ首次将人结肠癌成功地移植于裸鼠体内成功，并能传代。,由于裸鼠的免疫缺陷，不需任何附加因子处理，作为人体肿瘤异种移植的受体，移植后肿瘤生长良好。肿瘤细胞形态、染色体含量和同功酶水平与人体肿瘤一样，说明未发生细胞选

22、择和细胞杂交现象，细胞动力学和生物化学特征也未变，故这种小鼠的异种移植人体肿瘤已成为免疫学和肿瘤学研究中较为理想的模型，用于实验治疗方面的研究报导也明显增加。,自从裸鼠被用于复制肿瘤模型以来，使得人类肿瘤的异种移植快速发展。迄今几乎所有的肿瘤均能在裸鼠体内移植，研究较多的是恶性黑色素瘤、结肠癌和恶性淋巴瘤的移植。1977年美国国立癌症研究所（NCI）已提出包括人体肿瘤移植于裸鼠的抗肿瘤药物二筛实验模型。,国内1979年引进裸鼠，1981年上海第一医学院首先报道了将人肝癌移植于裸鼠成功。除裸小鼠外，现已建立了裸大鼠、裸豚鼠、裸仓鼠等。国内、外已建立起许多开展利用免疫缺陷动物进行肿瘤学研究的实验室

23、。目前已成功地将结肠癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑色素瘤，胃癌，淋巴瘤和白血病，子宫颈癌等等移植到裸鼠，获得一定百分比的良好生长肿瘤部分并可传代。从此裸鼠广泛的应用于人类肿瘤的基础理论和临床治疗的实验研究，为人体肿瘤的异体移植提供了方便，已经成为肿瘤异种移植的主要方法，也是肿瘤机理研究的理想动物模型。,（四）转基因动物模型在肿瘤研究中的应用,将外源基因导入小鼠受精卵，产生携带外源基因的小鼠品系。这种带有外源基因并能通过生殖细胞将外源基因转递给后代的动物称为转基因动物。转基因动物技术在肿瘤研究中的应用主要就是建立转基因动物肿瘤模型。,1984年，一个偶然的机会，Brinster发现携带SV40病毒

24、的大T抗原转基因小鼠最终出现一种脑肿瘤，不久进行了首次有目的的癌基因myc转移。1985年Adams等终于用转基因方法首次构建了myc癌基因在淋巴细胞瘤中发生易位的小鼠模型。此后4年，陆续开展了针对各种恶性病变的转基因小鼠试验。,目前以建立了30多种肿瘤的转基因小鼠模型，涉及到的基因包括生长因子及其受体、信号转导因子、与细胞DNA复制和转录有关的核蛋白、细胞凋亡有关的蛋白，这些胞浆或核蛋白多数都是原癌基因，与细胞的增殖、分化等重要功能有关，它们突变成癌基因可诱发肿瘤。,由于肿瘤发生的多步骤，单个癌基因几乎不能直接导致细胞的恶性变。而肿瘤发生的多阶段性，特别是癌前期的研究，即在肿瘤形成过程中癌基

25、因是如何协同作用，使得建立转癌基因的动物模型变得特别重要，这种动物由于癌基因的转入而处于癌前病变期，是一种不稳定状态，在一些理化因素和病毒等诱变因素作用下，很容易再次突变而诱发肿瘤。,转基因技术在研究肿瘤相关基因在体内功能中的重要作用，这些模型为探讨肿瘤的发病机制提供了一个有力工具，具有以下几个方面的研究意义：,转入癌基因后可研究癌前期的生理状态及其对诱变因素的敏感性，并可在F1代小鼠中再转入另一个癌基因，观察其诱变作用。将目的基因转入不同背景中来研究宿主基因对目的基因的作用。不同的细胞类对转入基因的反应性不同，反之依然，这种差异性对探讨癌变机理及进一步的肿瘤基因治疗有指导意义。这些肿瘤高发动

26、物还可用来筛选，试验抗癌药。,转基因方法最基本的模式是在插入的目的基因连接一合适的启动子-增强子元件，使该基因的生物学作用在某些类型的细胞组织中检测到。,在这着重介绍几种近年来借助转基因动物体系在研究肿瘤发生，发展，演变等阶段中相关基因的作用极其调控的研究进展。,血液淋巴系统肿瘤myc表达失控是致淋巴恶性变的假说。去调控程序的myc基因转入后是没有活性的，接上免疫球蛋白重链5增强子（Em）后，有类似易位的作用，且效果极为显著和特异。几乎每只转基因小鼠在出生后几个月内都发展为B淋巴瘤，对其中一个B淋巴瘤的Em-myc品系肿瘤高发性进行了15代以上的观察，转基因鼠后代最后都死于扩散型淋巴瘤。,利用Em-myc转基因小鼠还可研究癌基因的协同作用。例如：携带V-Ha-ras或v-raf癌基因的逆转录病毒感染Em-myc转基因新生小鼠可加快B淋巴瘤的发生，而c-abl基因则无此功能。因此，可以认为ras基因的突变是淋巴瘤发生中的第二次打击。,皮肤癌皮肤肿瘤在白种人中发病率较高机制不十分清楚。发现H-ras癌基因激活，并且在体外对小鼠皮肤癌的化学诱变中也常激活H-r