临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法.ppt

1、临床PCR检查标本的处理、保存和核酸提取方法，卫生部临床检查中心二进制名，临床标本的准确收集、运输、保存的重要性，解决临床试验质量保证关键环节的解决相关医患纠纷的方法之一，核酸提取的重要性，核酸提取是临床PCR检查的最重要部分，另外，手动的主要部分核酸提取的成败也是临床PCR 标本收集时间影响放大检测结果的标本收集部分的准备标本类型及采集量抽样质量的评价抽样和运输容器标本收集的污染预防、标本运输、标本采集后，应尽快送到检查室。 可以在室温下携带或邮寄包含RNA测定用血清(纸浆)样品和DNA测定用GITC抗凝剂等适当稳定剂的样品。实验室应根据受试核酸的特性，适当规定各种临床标本的运输条件。临床标

2、本处理和保存、血清(浆)全血外周血单核细胞痰面革基脓液体液牛奶组织、血清(浆)、DNA测定，按照一般血清标本处理程序，对测定影响不大。RNA测量，获取和保存标本的方式会对测量结果产生决定性影响。使用EDTA抗凝剂(被PCR扩增抑制，禁止在核酸提取过程中难以完全去除的肝素使用)的全血标本最好在抗凝剂后6小时内分离血浆，如果使用血清标本，请尽快(2小时内)分离血清，标本的短期(1-2周)保存在-20 ，长期保存在-20。将全血、全血用作试验标本时，应注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不要使用肝素。全血样品(如DNA提取检查)在4 短期保存，在RNA检查等情况下，提取血液后，应尽

3、快提取RNA。外周血单核细胞、外周血单核细胞可以在抗凝血全血中准备，主要有两种方法用淋巴细胞分离液制造；第二种方法是使用红细胞解热剂分解全血的红细胞，通过生理盐水多次清洗，得到单个核细胞。外周血单核细胞可以暂时不提取核酸等-70 保存，痰、痰属于分泌物，临床上多用作结核杆菌DNA测定标本。痰标本中含有大量粘液和杂质，因此在核酸提取时，必须对标本进行初步处理，使1mol/LNaOH或变性剂液化。像PCR分析非结核杆菌，例如支原体，痰标本只能在室温下从生理盐水中悬浮，充分振动，使肿块消退，形成上清离心力，结果沉淀物可以用于核酸提取。液化标本如果不立即用于核酸提取，可以保存在-70 。痰标本处理的基

4、本模式、一般模式简单模式、痰标本处理的一般模式、试剂：(1)通用标本处理(USP)溶液：4-6mol/L盐酸盐胍(2)0.05%Tween80。(3)10%Chelex-100(包括0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)，痰标本处理的简单模式，试剂：(1)分解液：具有最终浓度0.1mol用这种方法提取，提取过程中出现了能够修饰DNA的酶，最后阶段与核酸一起清洗，抑制随后的扩增。在PCR主反应混合液中加入-酪蛋白(alpha-casin)、白蛋白等，有防止这种抑制剂产生的效果。用PCR方法检测棉签、性病病原体时，临床标本大体上是棉签，将棉棉签放入适量生理盐水中，充分冲击洗涤后

5、在室温下静滴5 10分钟，大块沉淀后，立即取离心机，然后将沉淀物用于DNA提取。如果不立即用于核酸提取，应保存在-70 。脓，脓处理在某些情况下是不同的。用于测定结核分枝杆菌等核酸的标本，粘脓液是痰标本的处理模式，先液化，然后根据离心分离DNA可以提取。水样中的脓可以直接离心后用盐水冲洗2 3次沉淀物，然后用于DNA提取。用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如果太粘的话，加入适量生理盐水充分振动，然后静置，为提取DNA沉淀。水样中，按照上述直接离心沉淀即可。沉淀标本的保存条件也为-70 。可以通过离心力沉淀体液、临床体液标本(包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等)提取核酸。沉淀样品的保存如上。牛奶、牛奶可

6、以是像HBVDNA、HCVRNA、结核分枝杆菌、布鲁氏菌等PCR分析的样本。提取牛奶中的布鲁氏菌DNA，试剂准备NET缓冲液333650 mmol/lnacl，125 mmol/led ta，50m mol/ltr is-HClph 7.6；24%十二烷基硫酸钠(SDS)；蛋白酶k；RNase。从牛奶中提取分枝杆菌DNA，试剂制备分解液：50mmol/LTris-HCl，10 mmol/led ta，2% tritonx-100，4mol/L iii玻璃珠： (直径：425-600um)，组织、组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步骤是先用生理盐水洗两次，然后粉碎，或者放入生理盐水后剧

7、烈搅拌，离心后用蛋白质分解酶k消化，然后提取核酸。新鲜的组织最好先用生理盐水洗一次组织，切成小于1厘米的小块，放入适量的生理盐水，然后摇晃，加入绝对乙醇，最后保持50%的浓度。这样固定的组织标本在室温下可以保存几天，4 到6年。用于提取核酸的石蜡切片，用辛烷或二甲苯去除蜡后，用蛋白酶k消化后，可以提取DNA。保存在临床标本的滤纸上，临床标本放在处理过的滤纸片上，例如目标核酸是DNA，可以在室温下保存几个月到几年，也可以稳定几周，例如目标核酸是RNA的情况。滤纸上保存的标本保存了很长时间。另外，因为标本的PCR抑制剂(如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等)不影响后面的放大检测，而是吸附在滤纸上。不管是全

8、血还是血清(纸浆)。或者尿液、粪便、分泌物等可以是这种方法。临床标本PCR反应抑制剂、内源性3:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内乳铁蛋白、肌红蛋白、脂质、粘液、尿素、离子、胆盐、多糖等。外源：例如肝素抗凝剂、纤维素和硝化纤维素，经过过量的紫外线照射后矿物油、手套滑石粉、标本容器或取样设备中的抑制剂。肝素的作用机制，肝素对MLV逆转录酶及TAQDNA聚合酶的强力抑制作用，如果临床标本是肝素抗凝剂，那么在核酸纯化过程中，肝素和核酸本身带有正电荷，但标本中肝素可以与DNA和RNA结合。对于标本，沸腾、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、重复乙醇沉淀等不能消除肝素的这种干扰作用。g核酸标本中

9、添加0.1U肝素，可实现100%抑制酶活性。在标本中添加肝素酶I或 1 3u/ g核酸(5 mmtrisph 7.5，1mm CaCl 2，40 urnas in 25 2小时)，可以消除肝素的抑制作用。血红蛋白、乳铁蛋白、血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制剂，含有铁。抑制机制可能与(1)该蛋白质向PCR混合物释放铁离子有关。在研究铁的抑制作用时，发现妨碍DNA合成，胆红素、胆盐、氯化梅血红素(Hemin)等血红蛋白衍生物也是PCR抑制剂。(2)血红素(Heme)可以通过抑制馈电调节DNA聚合酶活性，调节红细胞内血红蛋白成分的合成。(。还观察到氯代美泰血红素直接作用于DN

10、A聚合酶，成为与目标DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争抑制剂。(3)目标核酸DNA被血液中大量凝固的有机物质包裹着，使目标DNA不能接触DNA聚合酶。(。血红蛋白，1%(V/V)血液完全抑制Taq酶活性，与Mg2浓度无关。Tth聚合酶在含有4%(V/V)血液的PCR反应混合物中被扩增，可以添加1U单链DNA结合蛋白T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在8%(V/V)的血液中仍然可以扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可以直接扩增目标DNA，而无需从临床标本中提取精制的核酸。热稳定性DNA聚合酶对临床标本抑制剂的敏感性不同。IgG，IgG的抑制效果是由于与单链DNA的相互作用，使目

11、标DNA不能与DNA聚合酶相互作用，在使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR之前，使用热启动来加强IgG对PCR反应的抑制，消除或缓解抑制的几种方法，NaOH处理可以中和临床标本的TaqDNA聚合酶抑制剂，但是nao oo添加0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA)可以减少对TaqDNA聚合酶的血液抑制作用，在2%(vol/vol)的血液存在的情况下也能成功扩增。一般来说，血液含量只有0.2%。BSA还可以提高rTth或TaqDNA聚合酶的扩增能力，将粪便和肉类标本的抑制剂的抵抗力分别增加10，20倍。单链DNA结合T4基因32蛋白(gp32)具有与BSA类似的增强效果。核酸纯化、核酸分离

12、和纯化技术开始于20世纪50年代，在70年代和80年代，传统的核酸沉淀溶解分离和纯化方法得到了普遍应用和推广。传统的核酸提取方法经常使用洗涤剂分解、蛋白酶处理、有机溶剂提取、乙醇沉淀等。目标核酸与宿主细胞集成，在细胞核中自由和细胞质内的各种组成存在于细胞内，测定病原微生物等目标核酸存在于细菌、病毒、原生动物或真菌细胞内，如果这些细胞破裂，目标核酸也可能存在于细胞外。使用三吨-100等洗涤剂分解细胞，然后用蛋白质分解酶(蛋白酶k)消化与核酸结合的蛋白质，把目标核酸释放到细胞内。核酸的分离和纯化，核酸的分离和纯化，就是去除蛋白质，脂质等妨碍核酸扩增的物质。经典方法硅吸附法对于商业核酸提取工具包，在

13、临床实验室使用之前，必须评估相应的核酸提取纯度和效率。RNA提取的经典方法，即“苯酚-氯仿提取”，在RNA提取的独创性、临床标本和实验室环境中，RNase具有很强的降解性，RNase不易高温和失活。如何避免标本污染，防止提取的RNA分解，是确保成功提取RNA的关键。用于提取RNA的器械处理，通过高压杀菌的一次性塑料产品(试管、离心管等)基本上没有rnas，直接用于制造和存储RNA的普通玻璃产品经常被RNAs污染，使用前在180 干燥8小时以上或0.1%碳酸二乙酯(DEPC)DEPC是RNase的强力抑制剂。装满DEPC的碗在37 下放置2小时后用灭菌水清洗多次，然后在100 下干燥15分钟，在

14、高压蒸汽下烘烤15分钟。这种处理消除了碗中微量的DEPC，防止DEPC通过羧甲基化改造RNA中的嘌呤碱。为提取RNA准备溶液，用高压杀菌水和RNA研究用化学试剂制造溶液，用干燥的药勺调用试剂，将溶液装在没有RNase的玻璃器皿中是必须的。如果可能，在37 下使用0.1至少12小时，然后在100 下加热15分钟，或者将高压蒸汽杀菌15分钟。值得注意的是，DEPC能与胺迅速发生化学反应，因此不能用于处理像Tris这样的缓冲液，因此为了制造没有Tris的溶液，可以保存几瓶新的未开封的Tris试剂。RNA提取中RNase污染的控制，实验操作者的手是RNase污染的最主要潜在原因。为RNA精制准备实验物

15、质和溶液时，以及在涉及RNA的整个提取过程中，戴一次性手套是战略。在RNA提取实验中，必须经常更换手套。RNA提取常用方法，表面活性剂加蛋白酶k，氯仿-苯酚提取。胍盐萃取结合氯仿-苯酚萃取。胍盐的提取及玻璃粉、二氧化硅等粒子悬浮吸附方法。氯仿-苯酚提取，核酸提取改进方法，旋转离心柱(SPINCOLUMN)方法玻璃粉吸附二氧化硅(Se)或硅藻吸附方法微量全血核酸提取方法：NaI方法其他方法：疏水Immobilon-P膜，全自动核酸精制原则上，现行的旋转离心热系统通常可以分为三部分。第一部分是利用分解液使细胞分裂，释放细胞的核酸。第二部分是将释放的核酸特定地吸附到特定的硅载体上。当然，这种载体对核酸只有很强的亲和力和吸附力，但对蛋白质、多糖、脂质等其他生化成分没有相亲，也没有吸附。第三部分是溶出吸附在特定载体上的核酸，得到精制的核酸。采用玻璃粉吸附方法、二氧化硅(Se)或硅藻吸附方法、NaI微量全血核酸提取方法、目标核酸提取质量、精制目标核酸的完整性：利用凝胶电泳，将样品中的核酸萃取物与1核酸标准进行比较测定。核酸提取产量：可以用A260读数测定。核酸纯度：血清或血浆中病原体核酸的纯化纯度可以用提取物A260/A280比率确认。即，将已