基因工程原理与技术-8.ppt

1、第八章基因文库的构建与目的基因的获得基因文库(genelibrary)是指某种生物、组织、或细胞的所有DNA片段的克隆群体。包括基因组文库(genomiclibray)和cDNA文库(cDNAlibrary)。第一节基因组文库的构建一、理想基因组文库应具备的条件1、代表性高，要包含基因组的所有DNA序列；2、克隆数不宜过大，以减轻文库筛选的工作量；N=ln(1-P)/ln(1-f)N:文库克隆数;P:筛选目标序列的概率;f:插入片段与基因组大小的比值3、载体克隆容量要大于基因长度，避免基因被分割克隆；4、克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利确定克隆之间的关系。,二、用于构建基因组文库的载体,

2、1、噬菌体载体,2、黏粒载体,3、酵母人工染色体载体,三、基因组文库构建的程序1、基因组DNA克隆片段的制备高分子量基因组DNA的提取DNA克隆片段的制备,2、载体DNA片段的制备酶切；一般用BamHI，产生与基因组DNA克隆片段相匹配的黏性末端。碱性磷酸酶处理；载体DNA片段纯化。有机溶剂抽提乙醇沉淀法、蔗糖密度梯度离心法。,3、基因组DNA片段与载体的连接(重组DNA分子的构建)连接效率主要受插入片段与载体的摩尔数比以及DNA片段总浓度的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段的用量。,1.0g噬菌体载体臂需要插入片段的用量,连接效率低的解决措施：调整载体与插入片段的用量

3、；使用新鲜购置的连接酶；重新纯化基因组DNA片段；重新提取和制备基因组DNA片段。,4、重组DNA分子导入受体细胞对于噬菌体载体、黏粒载体，重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的DNA分子导入到大肠杆菌中。效率高，达1.8108pfu/gDNA。对于YAC载体，采用电激法导入重组DNA分子。5、转化体的筛选培养及基因组文库的获得6、基因组文库的扩增、分装及保存基因组文库扩增的方法：液体培养增殖法、影印滤膜培养法。基因组文库扩增的问题：由于克隆的不均衡生长，从而导致相应克隆的丢失，导致基因组文库的代表性变差。小包装保存，4保存半年、-80保存几年而滴度保持稳定。,第二节

4、cDNA文库的构建cDNA文库是指某生物、组织或细胞所有cDNA的的克隆群体。包括组织特异性cDNA文库、区域特异性cDNA文库。一、用于构建cDNA文库的载体及载体片段制备质粒载体、噬菌体载体，能满足0.510kbcDNA克隆。二、mRNA的提取及其完整性的确定1、mRNA的来源(取材)目标mRNA为高丰度的材料2、mRNA的提取olig(dT)n-纤维素柱层析法olig(dT)n-磁珠分离法,三、cDNA克隆片段的制备1、cDNA第一链的合成,鸟类骨髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶：RNaseH活性强莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶：RNaseH活性较弱，有利于全长cDNA合成。

5、Supscript逆转录酶：缺失RNaseH活性，反应温度较高(45),2、cDNA第二链的合成自身引导合成法,造成5端缺失,置换合成法,优点：a、效率高；b、不需纯化cDNA第一链；c、仅缺失5端几个核苷酸。,PCR合成法,优点：a、灵敏度高，对起始材料少、低丰度mRNA特别具有优势；b、不需纯化mRNA，避免了纯化过程中信息的丢失；c、不会丢失5端信息,3、双链cDNA的末端处理及甲基化修饰加同聚物尾,接上人工接头首先补平cDNA末端及甲基化修饰，然后再接上人工接头。,连接子(linker),衔接头(adaptor),四、cDNA克隆片段与载体片段的连接及检测1、平头末端连接法，无法回收插

6、入片段2、同聚物接尾法，接dA/dT，通过局部变性和S1处理来回收3、人工接头法五、重组cDNA分子导入受体细胞如构建质粒文库，要有高质量的大肠杆菌感受态细胞(109pfu/gDNA)六、转化体筛选培养及cDNA文库生成七、cDNA文库的扩增、分装及保存值得注意的是：在构建cDNA文库时，如果用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护cDNA中的相应酶切位点。一般情况下无需构建原核细菌的cDNA文库。,第三节目的基因的获得获得目的基因的主要途径：,一、从文库中分离已知序列的基因1、核酸杂交法(菌落/噬菌斑原位杂交),利用部分同源探针可以分离不同种属的相同基因或同一基因家族的不同成员。如果只知基因编码蛋白质的氨基酸序列，可以设计简并探针予以筛选。,2、PCR筛选法特点：快速、简便。程序：文库多孔培养板一列或一行培养物于一PCR管中扩增凝胶电泳检测阳性列或行分装培养第二轮PCR阳性克隆3、免疫学筛选特点：筛选表达文库程序：与核酸杂交筛选相似。见右图,二、从文库中分离未知序列的基因1、染色体步移法(图位克隆法),2、减法杂交克隆法（扣除杂交文库法）将一种组织的cDNA与生物素标记的另