生物化学演讲课件.ppt

1、一、核酸的变性二、核酸的复性,6.5.5DNA的变性（denaturation）与复性,DNA变性：水溶液中，双股DNA分子在某些理化因素作用下，双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对之间的氢键受到破坏，严密的双股螺旋变为两条单一的随机卷曲的多核苷酸链，这种现象称为DNA的变性碱基堆积力(P74/92)：指在DNA双螺旋结构中，碱基对平面垂直于中心轴，层叠于双螺旋的内侧，相邻疏水性碱基在旋进中彼此堆积在一起相互吸引形成的作用力。这种力与氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定性，但相比之下比氢键更重要。,DNA变性的本质是氢键的断裂，并不涉及磷酸二酯键的断裂，一级结构（碱基顺序）保持不变。,引起DNA变

2、性的因素：热变性:酸碱变性（pH小于4或大于11）:变性剂（尿素、盐酸胍、酰胺及某些有机溶剂如乙醇、丙酮甲醛等）,DNA变性后理化性质发生一系列变化,生物活性丧失粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变OD260增高,DNA变性的特点：爆发式的，即变性发生在一个很窄的条件变化范围内。,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应或高色效应:DNA变性后，DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应,不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其OD260nm可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在2030%之间而RNA变性后，约增加1.1%。利用紫外吸收

3、的变化，可以跟踪核酸变性的情况。,DNA的热变性,通过加热使DNA分子发生变性.随着双链的解开，这种变化称螺旋线团转换。这种转换在一个较窄的温度范围内完成。DNA紫外吸收随变性程度增加而升高的现象称增色效应。DNA的紫外吸收随温度变化的曲线称解链曲线。,Tm：变性从开始到完全解链，在一个相当窄温度范围内完成，其中点对应的温度（双链解开50%时的温度）称作熔解温度或解链温度。,7,不同DNA分子具有各自的特征熔解温度Tm影响Tm的因素有：G-C的相对含量:P93Tm=69.3+0.41xG+C（G+C:DNA分子中G.C的百分含量）,溶液的离子强度介质离子强度低，Tm低。引申：DNA常保存在1m

4、ol/LNaCI溶液中,溶液的pH高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力，Tm值较低。,变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,DNA的均一性：DNA的组成越均一，变性发生在越小的温度范围内；,DNA的复性,变性DNA在适当的条件下（需缓慢冷却），两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性（或退火）DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。核酸复性后的紫外吸收降低，即减色效应。复性过程经成核和拉链式沿伸配对两个阶段。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是

5、将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。,DNA复性,复性过程中的碱基配对,影响复性速度的因素：,（5）单链片段浓度,（1）单链片段的大小,（2）片段内重复序列的多少,（3）溶液离子强度的大小,（4）溶液温度的高低（T25）,复性过程：符合二级反应动力学：复性速率可用=-dc/dt=kc2变化后可得：1/k=Cot1/2Cot1/2可用来衡量DNA复性的速度，同时反应了DNA的复杂程度,浓度大，复性快,片断大，复性慢,重复序列多，复性快,离子强度大，复性快,Cotl/2：为在标准条件下（一般为0.18mol/L阳离子浓度，400核苷酸的片段长度）测得的复性率达50%时的Cot值Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间，在探讨DNA序列对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，相同浓度的DNA的Cot1/2则可反映复性速度与DNA顺序复杂性的关系原核生物核酸分子，Cotl/2可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度真核生物基因