第2章--培养基与培养工艺

1、第2章 培养基与培养工艺,第一节 发酵生产用原料及培养基 第二节 培养基的选择和确定 第三节 培养工艺的确定 第四节 淀粉质与糖蜜的处理,第一节 发酵生产用原料及培养基,微生物发酵的本质，可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的营养物转化成特定的产物 在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的： （1）产物的社会效益， （2）物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等,传统：凡是含有可发酵性糖或可转化为发酵性糖的物料。 现在：用来转化人们所需产物的主要物料。,一、原料的定义,二、选择原料的依据,1. 满足生产工艺的要求 工艺条件的核心：微生物 不同 微生物 可利用

2、的原料不同。 对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质 微生物的代谢产物无有害物质,2. 满足生产管理和经济上的要求,原料资源要丰富，因地制宜，就地取材， 原料内碳水化合物含量较多， 蛋白质含量要适当， 适合微生物的需要和吸收利用。 便于收集、运输、贮藏 考虑产品成本，原料价格，加工过程经常性消耗等，并尽可能采用非粮食原料。 产品的用途不同，选择的原料就不同,3. 环境保护的要求,三、原料的种类,常用的或具有潜在能力的原料（不包括特殊产品的前体）： 1. 淀粉质原料（粮食原料） （1）薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。 （2）谷类： 高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。,2.

3、糖质原料：葡萄糖，麦芽糖等 废糖蜜：甜菜、甘蔗 淀粉水解糖 3. 纤维质原料： 世界上含量最大的一类资源。 包括：森林，木材工业下脚料，农作物秸杆，城市纤维垃圾，工业下脚料等。,4. 石油化工产品 乙酸，甲醇，乙醇等 5. 其他 亚硫酸纸浆废液， 野生植物 橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。 乳清,发酵原料的预处理,原料不同处理方法也有所差异。 1. 淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖 方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法 2. 糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐 3. 碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发

4、酵,发酵工业节约粮食的途径,1. 抓发酵的稳定性和高产量，控制染菌，提高发酵单位和提取效率，使单耗降低。 2. 利用代用品，如废糖蜜，葡萄糖废母液，工业用葡萄糖等。 3. 转换， 开拓新资源和微生物资源。 4. 废物利用与污染的治理相结合。,四、培养基(medium),定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质（混合养料）。 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。一旦配成必须立即灭菌。 用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品,（一）培养基的配制原则,培

5、养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确） 营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） 物理化学条件适宜（条件适宜） 根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）,（二）培养基组分应适合微生物的营养特点,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。 不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如 自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。 异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。,按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同： 细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基、 LB (Luria-Bertani) 放线菌： 高氏一号培养基 真菌： 查氏合成

6、培养基、PDA (Potato-Dextrose-Agar) 酵母菌； 麦芽汁,（三）营养物的浓度与比例应恰当,浓度过高微生物的生长起抑制作用， 浓度过小不能满足微生物生长的需要。 碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标； 例：谷氨酸生产中? C/N 4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。 速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例 各种金属离子间的比例,用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）,（四

7、）物理化学条件适宜,pH: 各类微生物的最适生长pH值各不相同： 细 菌：7.08.0 放线菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8 微生物生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的pH值会发生改变，为维持pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液。,磷酸缓冲液：pH值从6.07.6之间 加入CaCO3： 培养基中所含氨基酸、肽、蛋白质等物质也可起到缓冲作用。,2 渗透压和aw,渗透压 等渗溶液 适宜微生物生长 高渗溶液 细胞发生质壁分离

8、 低渗溶液 细胞吸水膨胀，直至破裂 大多数微生物适合在等渗的环境下生长。 而有的菌如金黄色葡萄球菌则能在3mol/L NaCl的高渗溶液中生长。 能在高盐环境（2.86.2mol/L NaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。,3 氧化还原电势(redox potential),各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求： 好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V以上的环境中均能生长). 厌氧微生物：只能在 +0.1V以下生长 兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵 培养基是多对氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。 对微生物影响最大

9、的是：分子氧和分子氢的浓度 常用还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等能降低Eh值。,氧化还原电位：又称氧化还原电势（redox potential），是度量某氧化还原系统中 的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。,（五）根据应用目的选择原料及其来源,该培养基的应用目的，即： 是培养菌体还是积累代谢产物？ 是实验室种子培养还是大规模发酵？ 代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,用于培养种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）； 用于生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，

10、有时应提高培养基的氮源含量）； 若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定代谢产物的前体物； 大规模发酵时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。,培养基的制备,附：培养基的灭菌,灭菌的原因： 在发酵过程中如混入其他微生物，将与菌种形成竞争关系，对发酵过程造成不良影响 。 举例： 谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡。 青霉素生产过程中污染了杂菌，这些杂菌则会分泌青霉素酶，将合成的青霉素分解。,工业上具体措施包括： 1）使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；

11、3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。,培养基与设备，管道的灭菌条件,杀菌锅内灭菌 种子罐，发酵罐，计量罐，补料罐等的空罐灭菌(127133 , 30 min)及管道和空气过滤器灭菌(138143 , 4060 min) 发酵罐，种子罐实罐灭菌 发酵培养基连续灭菌 消泡剂灭菌 其他物料灭菌 以上均为单独灭菌，有些 结合原料处理，如蒸煮等也可达到灭菌的目的。,高压蒸气灭菌 一般培养基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min 含糖培养基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min 40%尿素:

12、 0.2 Kg/cm2, 105 , 5 min 消泡剂: 1.049 Kg/cm2, 120, 15min 间歇灭菌，121，2030分钟 连续灭菌，137，1530s，在维持罐中保温820分钟。,含葡萄糖培养基灭菌,含葡萄糖的培养基经高温灭菌，易产生有害色素，俗称焦糖色，主要是还原糖与氨类物质高温时的美拉德反应所致。 微生物的含糖培养基灭菌时，最好将培养基中葡萄糖在pH5.5时单独灭菌（ 115，15min ）或与非氨类的无机盐共同灭菌，以减少色素的产生。,例,三级氨水除菌过滤器,高温高压条件下合成的氨，本身不被杂菌污染。 氨水是氨经过配制而产生的一种氨和水的混合物，一般1820%。 氨水

13、的配制、贮存、运输过程的所有环节都不是无菌操作，易遭受杂菌的侵入。 氨水不经无菌处理就补入发酵液时，氨水的浓度被大大稀释，其中暂时被抑制的芽孢就会迅速复苏繁殖，导致染菌，严重影响发酵单位及发酵液滤速，对提取收率和产品质量危害较大。,例,说明: 一级过滤：1#、2#均为砂芯滤器，主要是除去氨水中的颗粒性物质 。 二级过滤： 3#为1微米的膜过滤器 三级过滤：4#为0.45微米的膜过滤器。 使用前用蒸汽进行消毒灭菌处理。,实消分批灭菌,实消是将配制好的培养基用泵打入发酵罐，通入饱和蒸汽加热，达到灭菌温度(121)后，保温灭菌约0.5h，灭菌完毕通入无菌空气维持罐压，然后冷却到发酵所需温度，保压待种

14、。,分为三个阶段： 升温(培养基从室温升至灭菌温度) 保温灭菌 冷却(从灭菌温度冷却至发酵温度) 培养基经灭菌后应尽快冷却至接种温度，时间越长，培养基破坏程度越高。,实消过程,工艺操作要点：,定期检查冷却管道，夹套有无渗漏。 灭菌前，用蒸汽把发酵罐的分空气过滤器灭菌，并且用空气吹干。 开始灭菌，放出夹套和蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。升温时，打开所有排气阀门，排掉空气？ 培养基温度升到70左右，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽，培养基温度达120，罐压达1105Pa(表压)时，发酵罐封头上的接种、补料、消沫剂、酸、碱管

15、道应排汽， 并调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在这一水平进行保温3045min。,三路进汽,培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀；为保护轴承，温度升到100时，沸腾的培养基可以起到搅拌作用，此时停止搅拌。 注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。 在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道以及冲视镜管都应通入蒸汽，在液面上的其余各管道则应排放蒸汽，目的是对管道进行灭菌。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。,非进即出,保温结束后，依次关闭各排气、进汽阀门，待罐内压力略高于大气压力时，向罐内通入无菌空气（在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力

16、；否则，培养基将倒流入过滤器内）。在夹套和蛇管中通入冷却水，使培养基温度降到所需温度。 引入无菌空气?，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌，甚至设备损坏。 灭菌时，总蒸汽压力要求不低于35个大气压，使用压力不低于2个大气压。另外，还要避免死角。 配制培养基时，充分考虑培养基灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加越多。,事故,2002年9月5日衡阳市某啤酒厂酿造车间一台容积100m3的不锈钢发酵糖在清洗过程中发生收缩变形而吸瘪，造成直接经济损失22万元的重大设备事故。,50m3发酵罐失稳事故分析,1.事故情况 1998年安阳

17、市某化工厂车间一台50m3发酵罐在空消后水冷却过程中突然失稳。无伤亡事故，直接经济损失20余万元。 2.事故原因分析 勘察发现，进汽口和出汽阀门关闭；冷却水阀门敞开。这说明，失稳是在冷却过程中发生的。 许用压力计算 100以下罐体就会承受外压。外压值等于大气压与水的饱和蒸汽压之差。70以下水的饱和蒸汽压与罐内负压值见附表。 实测筒体许用外压力0.0832MPa。 由表看出，罐内温度降到60 以下，罐体失稳随时都可能发生。,附：器皿的灭菌及无菌室的消毒,器皿的灭菌： 干热空气： 160， 2 小时 无菌室的消毒： 紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,第二节 培养基的选择和确定,一、培养

18、基的营养成分 二、培养基的用途 三、发酵培养基的选择 四、培养基成分的营养与作用 五、培养基确定方法,一、培养基的营养成分,微生物的营养活动，是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，再借助细胞膜的渗透作用，吸收小分子营养物来实现的。 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。,微生物的营养来源,1 能源 自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。 异养菌：碳水化合物等有机物、石油天然气和石油化工产品，如醋酸。,2 碳源（最主要的组成）,常用的碳源有糖类，油脂，有机酸，低碳醇 1

19、）在特殊条件下，蛋白质水解产物氨基酸也可作为碳源。 2）菌种不同对不同碳源的利用速度和效率也不同。 3）葡萄糖是碳源中最易利用的糖，可作为加速微生物生长的一种有效的糖.,4） 糖蜜可省去蒸煮，糖化 5） 淀粉质原料也是常用的碳源，一般要经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用，可以克服葡萄糖代谢过快带来的弊病。 6） 油和脂肪，作为能源和碳源，利用脂肪时要供给比糖代谢更多的氧，还会使pH下降。 7） 有机酸，利用后，会使pH上升。 8）正烷烃也用于发酵工业。,3 氮源,主要用于构成菌体的细胞物质（氨基酸，蛋白质，核酸等）和含氮代谢物。 分为：有机氮 无机氮,（1）有机氮源,植物来源：玉米桨

20、、豆饼粉、大豆、花生饼粉、棉子饼粉、Pharmamedia和Proflo(均为棉子饼粉制品) 动物来源：蛋白胨，水解干酪素、屠宰场废弃物，鱼粉和酵母膏等 其他：尿素，酒糟，废菌体,1）在分泌的蛋白酶作用下，分解为氨基酸而被吸收利用。 2）原料含丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸，还有少量的糖、脂肪、无机盐、维生素及生长因子，因此微生物利用后生长旺盛。 3）有些微生物对氨基酸有特殊需求，可用有机氮来代替。 4） 氮源的来源对发酵影响很大，经常需要摇瓶小试。,尿素：常用的有机氮 流加时温度不宜过高，否则游离氨过多，使pH升高，一般在培养基冷却后加入。 有些有机氮还可作为产物的前体。,（2）无机氮源,无

21、机氮常用氨气（氨水）、铵盐如硫酸铵或硝酸盐。 与有机氮相比，无机氮更容易吸收利用 无机氮的利用会引起pH的变化。 在铵离子被利用后，游离出酸，而使培养液呈酸性； 硝酸盐在被代谢后，则呈现碱性。 硝酸铵首先由于铵被利用而呈现出酸性，硝酸盐的同化作用被抑制，待铵耗尽后，才开始利用硝酸根作氮源，培养基呈现碱性。,正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。 生理酸性物质 经微生物代谢后形成酸性物质的无机氮源，如硫酸铵。 生理碱性物质 经微生物代谢后形成碱性物质的无机氮源，如硝酸钠。 如：制备液体曲，选用NaNO3 曲霉生产糖化型淀粉酶，选用(NH4)2SO4,4 碳氮比（C/N),

22、碳元素总量与氮元素总量之比。 C/N影响菌体的生长和产物的代谢，还能调节pH。 例如：黄源胶（Xanthan Gum）发酵：前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖；黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N。此时，培养基中氮源仍然很高，结果会导致，底物消耗了但产物的产率却很低。 不同菌种，不同时期，不同培养方式，对C/N的要求不同。 最适C/N还与最适pH有关。,5 无机盐,无机盐提供多种金属元素和非金属元素。 P, Mg, S, K, Na, Fe, Cl, Mn, Zn, Co等作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物， 低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用， 高浓度时常表现出

23、明显的抑制作用。,磷（P） 培养基中特别重要的元素，是构成核酸，磷脂的成分，并参与ATP，GTP的能量转移反应。 一般需添加磷酸盐，如KH2PO4 ，K2HPO4 ，NaH2PO4， (NH4)2HPO4,硫： 含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸）等的组成部分，辅酶的活性基。 一般添加Na2SO4， MgSO4,K、 Na、 Ca 虽不参与细胞的组成，却是培养基中的重要成分。 Na 与维持细胞的渗透压有关，促使某些酶的产量。 K 与渗透压有关，并且是许多酶的激活剂，还可促进糖代谢。 Ca2+ 以离子状态控制细胞透性和调节酸度。 CaCO3的作用： Ca2+ 对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶活

24、性起到十分重要的稳定和活化作用。 常用CaCO3， CaCl2提供钙，一般不与K2HPO4一起使用。 CaCO3需单独灭菌，在培养基调到中性后加入。,Mg 某些细胞的叶绿素成分，是许多重要酶的激活剂，常用MgSO4，注意在碱性溶液中会生成沉淀。 Fe 细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的成分，对代谢产物的合成有较大影响。,Cl 氯离子不具营养作用，对一些含氯代谢物的发酵，还需加入0.1%KCl补充。 其他一些微量元素 Mn、 Zn、 Co等，一般不需再加入。,6 生长因子,凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子。 包括：维生素，生物素，嘌呤碱，嘧啶碱，氨基酸等。 维生素，主要是B

25、族维生素的硫胺素，核黄素，泛酸，吡哆素，烟酰胺，叶酸，环己六醇，生物素，多为辅基，辅酶。 发酵工业广泛使用的天然原料，如玉米浆，麦芽汁，豆芽汁，酵母膏等，既是N源，又可提供生长因子。,7 前体、促进剂和抑制剂,发酵培养基中某些成分的加入不促进微生物的生长，只是有助于调节产物的形成，这些添加的物质包括前体、抑制剂和促进剂。,前体物质,指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产量却因前体的加入有较大提高。 前体加入量可以通过计算确定。 发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍生物被认为是青霉素的前体物质。,抑

26、制剂,加入后会抑制某些代谢途径的进行，使另一途径活跃，从而获得人们所需要的某种代谢产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累。,阻遏物或抑制剂的影响,培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成，降低发酵产量。 有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量， 最早利用抑制剂提高中间代谢物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸钠。 抗生素工业应用最多。 在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂，而避免混入有害的抑制物。,促进剂,指那些既不是营养物，又不是前体，但能提高产量的添加剂，如酶生产中的诱导物或表面活性剂等。 发酵过程中促进剂的用量极微，而且专一性较强，往往不可相互套用。,诱导物：,工业用微生物酶多

27、数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。 诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。 但不能从根本上改变细胞原有的蛋白质模板，诱导物包括酶的底物，底物类似物，及被转化为诱导物的前体物质。 淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。,表面活性剂(洗涤剂，吐温等) 可以增加酶的产量，一般认为是因为： 1、改变了细胞膜的通透性 2、增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。,促进剂的作用（举例）,1、可能起生长因素的作用，如某些植物刺激剂可促进某些放线菌的生长。 2、链霉素发酵时，加入巴比妥药物，可提高菌丝抗自溶能力，推迟菌体自溶。 3、抑制某些合成其他产物的途径，如四环素发酵中加入NaBr抑

28、制金霉素的生成。,4、有的降低了产生菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成。如四环素发酵中加入硫氰化苄。 5、有的可改变发酵液的物理性质，改善通气效果。 6、有的与抗生素形成复盐，从而降低发酵液中抗生素的浓度，促进抗生素的合成。,二、培养基的用途,（一）、培养基的分类 （二）、发酵生产中的培养基类型,（一）、培养基的分类,按培养基组成物质的化学成分 合成培养基、天然培养基。 按物理性质 固体，液体 按用途 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等,（1）天然培养基 用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成。 适合

29、于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。,（2）合成培养基,用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素。 适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。 但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。,（3）半合成培养基,多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。, 液体培养基

30、：常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。 用作培养种子和发酵的培养基； 根据对氧的要求，分别作静止或通风搅拌培养； 菌种筛选和培养中，用液体培养基进行摇瓶培养； 有时也用作鉴定菌种的参考。, 固体培养基 分类：斜面试管、平板等 是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。,作用： 固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中，用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农作物加无机元素等制成的。,增殖培养基：配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。 鉴

31、别培养基：是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。 选择培养基：是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。 加富培养基：在普通培养基中加入某些特殊的营养物（如血、血清，动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）和分离其中微生物.,（二）、发酵生产中的培养基类型,工业上依据生产流程和作用分为： 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 摇瓶培养基,1斜面培养基,作用：供微生物细胞生长繁殖，包括 细菌，酵母等的斜面培养基 霉菌、放线菌产孢子培养基

32、或麸曲培养基等。 这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。,特点： 富含有机氮源，少含或不含糖分。 有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。 斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。,孢子培养基 供制备孢子。要求此培养基能使孢子迅速发芽和生长，能形成大量的孢子，但不引起菌种变异。 一般孢子培养基中的基质浓度(特别是有机氮)要低些，否则影响孢子的形成。 无机盐浓度适量，否则影响孢子的数量和质量。,2种子培养基 (包括摇瓶种子和小罐种子培养基),培养种子的目的： 扩大

33、培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞，使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,种子培养基 供孢子发芽和菌体生长繁殖。要求营养成分易被菌体吸收利用，同时还要比较丰富和完整，其中氮源和维生素含量略高一些。 在设计种子培养基时还要考虑与发酵培养基组成的关系，使种子进入发酵罐后很快适应发酵环境。,种子培养基特点： 有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。 营养物质的浓度不必太高。 种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,3发酵培养基,发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物

34、。它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。 要求此培养基的组成丰富完整，营养成分浓度适中，利于菌体生长及合成大量的代谢产物。 发酵培养基应考虑在发酵过程中的各种生化代谢的协调，使发酵液的pH等保持相对稳定。,三、发酵培养基的选择设计和注意事项,1. 必须提供合成微生物细胞、代谢活动和发酵产物的基本营养成分。 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 生产氨基酸等含氮化合物时，除充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。 主成分与其他成分的配比。 合适的pH：微生物的生长繁殖或产物合成需要特定的pH环境。 合适的浓

35、度：从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中推算所需原料或主要原料的需要量。,注意代谢调节物的影响： 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。 前体物质 诱导剂 阻遏物 抑制剂,注意金属离子的影响： 有些发酵对金属离子相当敏感， 因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。 对有重大影响的金属离子必须严格控制。 柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量， 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用， 钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的。,2. 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 3. 有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位

36、容积发酵罐的生产能力。 4. 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。,5. 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 6. 原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 7. 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 8. 有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。,例:基质浓度变化及控制,（一）、碳源浓度变化及控制 碳源是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。 发酵前期，碳源主要用于生长，消耗较快， 发酵后期，碳源主要用于产物合成，消耗速度放缓。 快速利用的碳源：对生长有利，对次级代谢产物的形成有抑制作用。 缓慢利用的碳源：对延长产物的合成

37、是有利的，尤其是次级代谢产物。,培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。 解决的方法是采取“中间补料” 补糖方法： 连续滴加补糖 小量多次间歇补糖 大量少次补糖 “中间补料”可以延长产物的产生时间，推迟菌体的自溶时间，增加了发酵液的体积，而使发酵单位大幅度上升。,（二）、氮源浓度变化及控制 氮源物质主要用于： 菌体中蛋白质、核酸等含氮物质的合成， 有些含氮的发酵产物。 发酵前期，氮源物质随菌体浓度的急剧增加而迅速减少， 发酵中期，氮源（氨基氮）的下降速度比较缓慢， 发酵后期，由于菌体自溶，氨基氮会回升。,发酵培养基中同时含快速利用的氮源和缓慢利用的氮源物质。 快速利用的氮

38、源：如氨水、铵盐促进菌体生长。 缓慢利用的氮源：有利于延长产物的合成期。 氮源投料多，造成菌体生长快，菌体衰老也快。同时，氮源物质往往抑制次级产物的合成。 解决方法：“中间补料”。,四、培养基确定方法,1. 首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。 应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。,2. 对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。,3. 先选择化学合成培养基做基础，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。 先做摇瓶

39、试验; 再做小型发酵罐培养。 试验时每次只限一个变动条件，确定培养基配比。 4. 再做复合培养基试验，最后试验各种发酵条件和培养基的关系。,正交试验,5. 通过中间补料法引导发酵走向合成产物的途径。 对碳及氮的代谢予以适当的控制， 间歇添加各种养料和前体类物质。,第三节 培养工艺的确定方法,一、培养条件 二、主要培养方法及特点,一、培养条件,温度 pH值 氧 种龄 接种量,1温度,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。 机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。 微生物可生长的

40、温度范围较广，总体说在 -1095。,温度,任何微生物的牛长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。 如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。,2pH值,培养基的pH值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH范围。 微生物通过其活动也能改变环境的pH值。 pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。 控制pH值还可以防止杂菌的污染。 高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。,

41、避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质，该物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。 硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。,3氧,依赖获得能量的代谢的差异，微生物对氧的需要是不同。 好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢， 厌气菌为厌气发酵， 兼性厌气菌两者兼而有之。 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求是不相同。,通风和搅拌,通气供给氧 通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。 通气量的多少，按氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于

42、菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和代谢。 随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。,“三传一反”： “三传”为动量传递、热量传递和质量传递（化工单元操作）， “一反”为化学反应过程。,搅拌 能使氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解， 有利于热交换，使培养液的温度一致， 还有利于营养物质和代谢物的分散。 挡板有助于搅拌，使其效果更好。,全挡板条件,培养过程中的氧传递,培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小且多，气泡在培养液内停留时间就长；培养基的粘度越小，氧的溶解速度就越大。 搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌 会导致培养液大量涌泡，容易发生逃液，增加

43、杂菌污染的机会， 液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,种龄与接种量,种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。,接种量的大小直接影响发酵周期。 接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。 接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。 大量地接入培养成熟的菌种的优点： 1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高设备利用率； 2. 节约发酵培养的动力消耗； 3. 并有利于减少染菌机会。,二、主要培养方法及特点,1种子扩大培养阶段 (1)液体

44、培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。 摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有关。 (2)表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。 (3)固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。,(1) 表面培养,一种好氧静置培养方法，分为液态和固态表面培养。 表面积越大，越易促进氧气由气液(气固）界面向培养基内传递。 菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。 供氧为发酵的限速因素，发酵周期长，占地面积大。 优点：不需要搅拌和通气，节省动力。 如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。,2大规模生产阶段,固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培

45、养，统称曲法培养。 它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。,(2) 固体培养,固体培养优点： 原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。 防止污染：霉菌在水分较低的基质表面能增殖的特性，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。 通气：在曲房内使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，且根据不同生理时期的需要，灵活调节。 固体培养中，氧气由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时用通气搅拌供给氧气节能。,(3) 液体深层培养,液体深层培养：从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。 （表面培养法：气液界

46、面靠自然扩散使氧溶解。） 特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。,深层培养基本操作的3个控制点,灭菌：要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵；随着微生物的增殖和发酵产生生物热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套等以冷却水循环冷却。 通气、搅拌：经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，由罐底部进入发酵罐，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。,几种深层培养法,放大法 两步法 控制培养法 分批发酵法(间歇发酵法) 连续培养法 补料分批培养法(流加法), 放

47、大法：,将微生物在摇瓶基础上逐级放大以实现大规模生产。 在厌气发酵时 利用发酵时生成的二氧化碳引起的液体流动和辅助搅拌，以提供传热与传质。 在好氧培养中，以氧的供给为基准进行放大。 从实验室规模到工厂生产要经过35级放大步骤。,放大过程考虑的原则： a氧传递速度相等， b搅拌桨叶顶端速度， c单位液量所需的搅拌动力， d混合时间相同， e雷诺准数相同。, 两步法,酶制剂生产中，将菌体生长条件(营养期)与产酶条件(分泌期)区分开来。 菌种先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分利用。 在

48、氨基酸的两步法液体深层培养中，菌种和培养基等均不相同。 第一步属有机酸发酵或氨基酸发酵。 第二步，在微生物产生的某种酶作用下，把第一步的产物转化为所需的氨基酸，又称为酶转化法。, 控制培养法,了解发酵罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化，以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物生成的最优培养条件。 电子计算机控制发酵：用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于设定的基准内。, 分批发酵法(间歇发酵法),将空罐灭菌，连消培养基装入发酵罐，接种培养；期间，培养基成分减少，微生物

49、增殖，代谢产物形成。微生物周围的环境随时间而变化，是一种非稳态操作法。 此法不易染菌， 难采用控制基质等浓度的方法来增大发酵生产能力。 目前多用在酒精、氨基酸、抗生素生产中。, 连续培养法,往发酵罐中连续供给新鲜无菌培养基，含有微生物和产物的培养液，从发酵罐中连续流出。 特点：微生物处于恒定不变的环境中进行持续的培养与发酵，系统的稳态操作方式有恒化器和恒浊器。 同时包含流入和流出，属开放系统； 变异菌株和杂菌污染随时间的延长而增大； 从技术上很难保证流入和流出速度的一致。 连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。, 补料分批培养法(流加法),在分批培养基础上，不断地供给培养基，但

50、培养产物到一定时刻放出的方法，称为补料分批培养法。也称为半连续培养。 用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。,(4) 载体培养,载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点。 特征：以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮等固态基质作为微生物的载体。营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。 载体必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构要有足够的表面积，又能允许空气流通。,3影响种子培养的条件,菌种扩大培养的关键就是做好种子罐的扩大培养。 影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子的级数和接种量控制等 。,泡沫的控制,（1）泡沫的作用

51、： 与微生物的生长和产物合成有关，泡沫的存在影响 微生物对氧的吸收； 妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵； 由于泡沫大量生成，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。,（2）产生泡沫的原因 通气和机械搅拌使液体分散和空气窜入，形成气泡； 培养基中某些成分的变化或微生物的代谢活动产生气泡； 培养基中某些成分(如蛋白质及其他胶体物质)的分子，在气泡表面排列形成坚固的薄膜。因此，气泡不易破裂，聚成泡沫层。,（3）培养过程的消泡措施 机械法 化学法：消泡剂 各种天然的动植物油； 石油化工生产的矿物油、改性油、表面活性剂等； 有机硅聚合物如硅油、硅树脂等具

52、有高效、用量省、无毒性、无代谢性，兼有提高微生物合成酶等多种优良特性。 泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。,染菌的控制,见 第三章，第六节，工业发酵的染菌及其防治,种子罐级数的确定,见 第三章，第二节，种子的制备过程,第四节 淀粉质与糖蜜的处理,包括预处理，水热处理，蒸煮，糖化处理等。 一、预处理（除杂、粉碎、除去皮壳）,二、 原料的水热处理,高温高压条件下将淀粉质原料与水一起处理的过程，称为蒸煮。 1. 目的： 原料细胞中的淀粉颗粒受植物组织与细胞壁的保护，既不溶于水，也不易和淀粉水解酶接触。 对原料进行水热处理，使淀粉从细胞中游离出来，转化为溶解状态，便

53、于淀粉酶的作用。,2. 淀粉在水热处理中变化过程的几个概念,1）淀粉的膨胀（糊化） 淀粉分子由于水的作用，体积和重量增加。 膨胀程度随温度的增高而增加。分子间的联系（氢键）削弱，引起淀粉颗粒的部分解体，形成粘稠液体。 这种膨胀是不可逆的。,糊化： 淀粉受热吸水膨胀，从细胞壁中释放，晶体结构破坏，并形成凝胶的过程。 此时的温度称为糊化温度（是一个范围）。 不同原料的淀粉性质（淀粉颗粒的大小，排列紧密程度，氢键数量等）不同，糊化温度也不相同。 淀粉颗粒的晶体结构从有规则的层状结构变成网状结构，成为-化，此时的淀粉称为-淀粉。 糊化后的淀粉与淀粉酶作用快。,2）淀粉的溶解（液化） 淀粉糊化后，温度继

54、续上升或受到淀粉酶或酸的作用，网状结构彻底破坏，淀粉链断裂成短链，胶体状态破坏，淀粉变成粘度较低的流动性料液的过程。 本质：淀粉断裂与彻底溶解，产生糊精与寡糖。 糊化和液化过程最显著的特征是粘度的变化。,3）淀粉的老化 糊化或初步液化后的淀粉醪液在温度降低时，粘度逐渐增加，直至变为冻胶，称为“老化”，“反生”，也叫-化。 实质：淀粉分子重新排列，链间的氢键重新结合。 老化引起输送困难，分解困难。加入-淀粉酶充分液化可以克服。,三、 糖化理论,糖化：以无机酸或酶为催化剂，在一定温度下使淀粉水解，转变为葡萄糖的过程。 * 糖化力单位 1g曲在2%的可溶性淀粉溶液中，60、1h糖化可溶淀粉转化成葡萄

55、糖的毫克数， 即在上述条件下，转化1mg萄糖为1个活力单位，优质糖化麸曲能达到45005000单位,四、淀粉的水解,下列微生物由于其本身的生理生化特性决定了其代谢所需的底物只能是Glucose等单糖： 酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等 大部分的细菌：GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等 其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。 霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。,1、淀粉的水解反应过程 淀粉分子内-1,4和-1,6葡萄糖苷键的断裂，相对分子质量逐渐变小，依次变为糊精，低聚糖，麦芽糖和葡萄糖。 糊精是大于低聚糖的碳水化合物。一般含

56、210葡萄糖单位的为低聚糖。 糊精有旋光性，还原性，能溶于水，不溶于酒精。 与碘作用，聚合度不同颜色不同。,葡萄糖聚合度与碘液的呈色表,淀粉水解过程中，有三种反应： 糖化（水解作用）（主要反应） 复合反应（在酸和热作用下，部分葡萄糖经1，6键结合成龙胆二糖，异麦芽糖和其他低聚糖。） 分解反应（葡萄糖分解为羟甲基糠醛，有机酸和有色物质等非糖产物）,2、淀粉水解方法： 酸解法 酶解法 酸酶结合法,A 酸解法,1.优缺点 2.常用酸： 盐酸：高效，中和后产生氯化物，增加糖液灰分，对葡萄糖的结晶，分离及收率有影响。 硫酸：能力仅次于盐酸，用碳酸钙中和，经脱色，离子交换可除去。 草酸：能力低，用石灰中和

57、生成草酸钙，脱色过滤易除去，非强酸，减少了复合反应,淀粉 水,调浆（17.8-21.8%）,加0.5-0.8%的HCl,pH 1.0-1.5,水解罐升温糖化,开始蒸汽压力0.3-0.5kg/cm2，进料完毕后升压至2.8-3.0kg/cm2,保持15-30分钟,水解糖液 （DE=90-92%）,冷却至70,淀粉的酸水解： 酸水解速度快，常用于氨基酸、核苷酸发酵，工艺过程如下：,接下页,加NaOH中和至pH4.0-4.5,加0.1%活性炭脱色（60）,过滤,水解糖液,DE= 100,还原糖,干物质,DE值的概念 当量葡萄糖（DE）或还原值： DE值是表示淀粉或转化淀粉按葡萄糖计算时的总还原值，以

58、对总干物质的百分率表示。 因此，葡萄糖的DE值是100，麦芽糖的DE值是50。含有100个葡萄糖残基的直链淀粉或支链淀粉，只含有一个还原性端基，因而DE值是1。 参考DE值以控制淀粉的分解和转化，在制造糊精或糖浆与葡萄糖时就需要考虑DE值。,3. 淀粉浓度的影响 淀粉浓度高，葡萄糖浓度也高，复合反应和分解反应也高。 淀粉浓度低，设备利用率也低。 4. 糖化的压力与时间 压力高，水解速度快。 反应时间长，影响产品质量。 5. pH值 pH过高，过低，分解反应加速。,B 酶解法,常用酶制剂： -淀粉酶（液化型） 糖化酶（糖化型） 过程： “液化” “糖化” 也称为“双酶水解法”,淀粉酶法水解工艺过程：,淀粉 水,调浆（35-40%）,加-淀粉酶,pH 6.0,加热保温液化， pH5.5-6.0，80-90 30-60分钟,加热灭酶 120，15分钟,升温灭酶 110 ，30-60分钟,冷却至110 ，调pH 4.5-5.0,添加糖化酶 60 ，48-72小时,糖化,糖液（DE=98-99 %）,-淀粉酶 ：,又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉-1，4葡萄糖苷键，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖，因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。,淀粉-