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1、蛋黄卵磷脂提取方法的研究,指导教师：林松毅 副教授 学生姓名：黄金枝 学 院：军需科技学院 答辩日期：2009年6月5日,Study on extraction of lecithin from egg yolk,结构安排：,研究背景和意义,近年来卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素E并列的“三大营养素”倍受社会关注 ，需求量也日益增大。 传统的有机溶剂法是目前应用最广泛的提取方法，但此法所得卵磷脂产品一般纯度不高。 为适应大规模工业生产的要求，开发研究步骤简单、提取率高、有机溶剂残留低、生产成本低的卵磷脂提取方法十分必要 。,溶剂法提取,质量检测,研究内容,一、蛋黄卵磷脂溶剂法提取,实验材料 蛋黄粉

2、：北京金键力公司生产； 乙醇、丙酮试剂：分析纯，由北京化工厂生产； 实验设备 AG204M型分析天平：ETTLER TOLLEDO公司； HJ-6型多头磁力加热搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司； SHZ-D（）型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司； R1002型旋转蒸发仪：巩义市英裕高科仪器厂； DZMK-D型水浴锅：余姚市东方电工仪器厂； DZF-6050型真空干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。,实验方法,蛋黄卵磷脂生产工艺流程：,蛋黄粉,丙酮萃取,抽滤,乙醇提取,抽滤,浓缩干燥,蛋黄卵磷脂粗品,纯化,成品,1.蛋黄卵磷脂提取技术单因素实验方案,萃取时间对卵磷脂得率影响

3、,蛋黄粉与丙酮的料液比对提取率的影响,丙酮浸提时间对不溶物得率的影响,乙醇与丙酮不溶物粉料液比对卵磷脂得率影响,乙醇浓度对卵磷脂得率影响,蛋黄粉与丙酮的料液比对提取率的影响,由于丙酮具有毒性易造成残留且浪费，从提取效果和减少丙酮残留角度选取1：9为最佳料液比。,丙酮浸提时间对不溶物得率的影响,从提高提取效果及节约资源的角度分析，选取60min为最佳提取时间,乙醇与丙酮不溶物料液比对卵磷脂得率的影响,从提高提取率与节约材料的角度考虑，选取1：7的料液比,乙醇浓度对卵磷脂得率的影响,为了提高卵磷脂的提取率并节约资源，选择乙醇浓度为95%。,萃取时间对卵磷脂得率影响,从提高卵磷脂品质并且节省时间两方

4、面考虑，选择1.5小时,2. U10（104）均匀设计实验方案,U10（104）优化蛋黄卵磷脂提取最优工艺条件的结果与分析,丙酮不溶物与乙醇料液比11：1，乙醇浓度95%，提取温度35 ，提取时间2h,实验结果回归分析,按照实验结果得到回归方程为 y3.79+0.402X1+ 0.141X2+0.300X3-8.34e-2X4,回归方程显著，具有良好的线性关系。,二、蛋黄卵磷脂HPLC分析方法,试验材料 卵磷脂，吉林大学营养与功能食品实验室提供； 试验试剂 卵磷脂标准品：色谱纯级，美国SIGMA公司生产； 甲醇、乙腈：色谱纯级，美国DIMA公司生产； 超纯水：由0.45um滤膜过滤备用。 试验

5、设备 LC-2010A型岛津高效液相色谱仪：日本岛津公司生产； 752PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司生产； 2XZ-1型旋片式真空泵：浙江黄岩生产； DZF-6050型真空干燥箱：上海博迅生产； MILLIPORE牌超纯水机：美国生产； BUCHI R-250旋转蒸发仪：瑞士生产。,试验方法,卵磷脂HPLC色谱条件： 色谱柱：Lichrosorb si60柱； 流动相：甲醇-乙腈-水（60：30：10)； 流速：1ml/min； 柱温：40； 检测波长：206nm。,1.卵磷脂标准工作曲线的绘制,精密称取卵磷脂标准品10.0mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀

6、得对照品溶液（1mg/ml）。将对照品溶液在紫外可见分光光度计下进行波谱扫描，记录其特征峰值（206nm）。用微量进样器分别吸取不同体积（1、2、3、4、5、6l）的标准品溶液进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制卵磷脂标准工作曲线。,卵磷脂标准工作曲线测定结果,用最小二乘法作线性回归，制得的卵磷脂含量与峰面积的标准回归方程为y=7.502701e-004x -37.97849， 相关系数R=0.9992173，说明线性关系良好,图为卵磷脂的标准工作曲线 Fig. Working curve of standard L-Lecithin,卵磷脂标准品保留时间为6.66min左右。采用外标法

7、计算出蛋黄卵磷脂的纯度为71.52%。,流动相空白图谱,卵磷脂标准品图谱,蛋黄卵磷脂样品图谱,2.样品纯度测定结果,3.HPLC的方法学验证实验,精密度及 稳定性实验,重现性 实验,加样回收率 实验,方 法 可 靠,HPLC的方法学验证实验,精密度及稳定性实验： 精密吸取对照品溶液5l按色谱条件进样5次，每次进样5l，测定卵磷脂峰面积大小。 从表3中可以看出，RSD（%）值为2.4%，说明本方法的测量数据之间接近程度高。由于精密度试验是在每隔20分钟左右进样检测一次，所以同时考察了标准品不同时段的稳定性试验，由结果可知，本试验的样品在一定时间内较稳定。,HPLC的方法学验证实验,精密度及稳定性

8、实验： 从表4中可以看出，RSD（%）值为2.06%，说明本试验的样品在一定时间内较稳定。,HPLC的方法学验证实验,重现性实验： 精密吸取样品溶液5l按色谱条件进样5次，每次进样5l，测定卵磷脂峰面积大小。 重现性实验结果见表5，RSD=2.58%，说明此方法可靠，重现性良好，样品的检测受环境的因素影响较小。,HPLC的方法学验证实验,加样回收率实验： 精密量取已知卵磷脂含量的样品溶液0.2、0.2、0.3、0.3、0.4、0.4ml（6份），加放一定量标准品，按色谱条件进样6次，测定峰面积，计算加样回收率。 加样回收率实验结果见下表，回收率结果为98.65%104.33之间，RSD=2.2

9、7%，说明此方法可靠，回收率好。,结 论,1、本文对有机溶剂法提取蛋黄粉中卵磷脂的工艺条件进行了系统研究，得出如下结论： （1）根据各因素标准回归系数的绝对值，各因素对提取率的主次影响顺序为料液比乙醇浓度提取温度提取时间。 （2）根据单因素试验和回归方程和得出最优的试验条件为：蛋黄粉与丙酮料液比为1：9丙酮提取时间1h。丙酮不溶物与乙醇料液比11:1,乙醇浓度95，提取温度35，提取时间2h。 （3）由于最优工艺条件的没有出现在所做U10（104） 10次试验中，需要进行验证试验。平行重复三次，得出卵磷脂的提取率为19.72%。 2、在优化卵磷脂提取方法的基础上，利用高效液相色谱法测定了所得卵

10、磷脂的纯度为71.52%。并对HPLC法进行了精密度、稳定性、重现性和加样回收率的方法学验证，其RSD值分别为2.4%、2.06%、2.58%、2.27%，表明该方法可靠。,已发表的论文,1.黄金枝,林松毅,宫新统,李丹,刘静波.均匀设计法优化蛋黄卵磷脂提取工艺的研究J. 食品科学,2008,29（10）:257-258 2.宫新统、林松毅、刘静波、李丹、黄金枝.HPLC在高纯度蛋黄卵磷脂提取技术中的应用研究J.食品科学,2008,29(12):242-245,致 谢,本论文是在导师林松毅副教授悉心指导下完成的。论文的选题、实验工作的顺利开展以及论文的完成，都凝结着导师的心血。在此我表示深深地谢意！ 感谢刘静波院长和张铁华老师，班主任潘风光老师的帮助和支持，感谢学院为我们提供良好的学习生活和实验环境！ 感谢营养与功能实验室的老师和师兄师姐们对我的指导和帮