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文档简介
1、实验二 细菌的简单染色及革兰氏染色,实验目的,1、掌握细菌染色的原理 2、掌握细菌简单染色和革兰氏方法,实验原理-单染色,1、用于生物染色的染料的碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。 2、因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。,该染色法能将细菌分为G+菌和G-菌,是由这
2、两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。,实验原理-革兰氏染色,实验器材,1、材料 大肠杆菌;金黄色葡萄球菌 2、试剂或染液 草酸铵结晶紫;碘液;95%乙醇;复红溶液; 蒸馏水 3、其他 载玻片;接种环;酒精灯;打火机;卫生纸;酒精棉球,实验步骤,1、简单染色: (
3、1)涂片:取干净载玻片一块,在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂金黄色葡萄球菌,右边涂大肠杆菌,做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面,将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面,注意取菌不要太多。 (2)晾干:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 (3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜),实验步骤,(4)染色:将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色1-2min。 (5)水洗:用水洗去涂片上的染色液 (6)干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或
4、用吸水纸吸干。 (7)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。,实验步骤,2、革兰氏染色: (1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干:与简单染色法相同。 (3)固定,与简单染色法相同 (4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。 (6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。 (7)水洗:用水洗去碘液。 (8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色,立即水洗。,实验步骤,(10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。 (13)实验完毕后的处理: 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个
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