恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机制--2010--尚永丰--973项目标书

1、专案名称：恶性肿瘤发生发展的细胞表观遗传学机制首席科学家：上映风北京大学开始和结束期间：2011.1-2015.8依靠部门：教育部二、预期目标总体目标：该项目针对表观遗传学研究的前沿，整合了国内优秀研究者，对恶性肿瘤的发生及侵袭和转移进行了系统的表观遗传学研究。该项目的总体目标是：揭示了表观遗传的核心机制DNA甲基化、组蛋白修饰和未加密RNA对基因表达调控的影响。明显表观遗传调控在乳腺癌、肺癌、侵袭转移中的作用；揭示了EMT过程中的表观遗传变化和细胞再编程机制。明确细胞微环境在肿瘤转移中的作用和机制。一个分子调节网络，它整合了描述乳腺癌、肺癌、侵袭和转移的各种信息资料。通过本项目的实施，建立和

2、完善表观遗传学研究的新技术体系，实现了我国生命科学和医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、治疗和药物筛选提供了新的思路、新方法和新的目标，发现了用于诊断乳腺癌、肺癌的分子标记和药物治疗的几个潜在分子目标，并在本项目的实施过程中建立了具有国际竞争力的研究组。5年预计目标：1、发现新的组蛋白修饰因子组，了解组蛋白修饰与DNA甲基化相互作用的分子机制，筛选肿瘤相关ncRNA组，识别具有潜在临床应用价值的肿瘤诊断和治疗新ncRNA分子靶组；查看新的EMT核心管理要素组。发现了转移性乳腺癌、肺癌的新的有效治疗目标。2、建立适合恶性肿瘤表观遗传学研究的全套技术平台和技术系统。3、培养中青年学术领袖

3、和学术骨干群体。研究生50人以上，培养博士后12人以上。4、在国际一流杂志(IF10)上发表了8篇以上论文，在影响力杂志(IF5)上发表了25篇以上论文。三、研究方案该项目分为6个课题，全面系统地研究乳腺癌和肺癌的发生及侵袭和转移的表观遗传机制，并为乳腺癌和肺癌的预防、诊断、治疗提供分子标记和药物靶标。前三个主题分别从DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA三个角度分析了肿瘤的发生及侵袭和转移中的表观遗传变化，并研究了其相互作用和分子调控机制。第四个课题是讨论肿瘤转移过程中非常重要的现象上皮间充质转移细胞的再编程机制。第五个主题从肿瘤微环境的角度调查肿瘤细胞的生物学行为，特别是间质细胞和细胞因子

4、对侵袭和转移的影响。第六个课题是整合所有信息，绘制乳腺癌和肺癌的发展、浸润和转移的分子调控网。六个部分各集中，紧密联系，团结合作，互相促进。主题DNA甲基化改变在恶性肿瘤发生、侵袭和转移中的作用这项研究将从肿瘤细胞中筛选甲基化及失活基因，分析其启动子区域中组蛋白的转化状态，看看DNA甲基化与组蛋白修饰的先后关系。筛选影响DNA甲基化酶和DNA结合的主要因素或蛋白质。主要因素或蛋白质与DNA甲基化酶及DNA结合蛋白作用的分子机制进一步明确了特定基因的DNA甲基化分子机制，揭示了组蛋白修饰和DNA甲基化之间相互作用的分子机制。另外，肿瘤组织、CBX7等PcG蛋白的正常组合关系被破坏，这种PcG蛋白

5、组合障碍和肿瘤相关基因失活之间可能存在因果关系。本研究还决定以多个器官的正常组织和肿瘤组织为对象，了解正常组织细胞中PcG蛋白的正常组合关系，这种正常组合关系破坏与肿瘤的关系，研究与肿瘤相关的基因组蛋白修饰、细胞核位置以及与DNA甲基化的关系。表观遗传编程不仅对获得体细胞分化和多能性“干性”有重要作用，而且是在细胞癌变过程中获取无限增殖和浸润/转移力的物质基础。本研究将研究与肿瘤转移相关的DNA甲基化组学，筛选和查明影响肿瘤细胞转移能力的主要DNA甲基化变化部位及其网络，了解其在癌细胞转移性再编程过程中的作用，建立预测恶性肿瘤转移的表观分子分型体系。总体研究方案包括：肿瘤DNA甲基化群及其应用

6、DNA甲基化形成机制的研究代表性肿瘤和非肿瘤组织标本的收集500例肿瘤DNA甲基化群晶体启动子芯片基因功能分析生物信息学分析确定与肿瘤发生/转移/侵袭相关的甲基化网络验证研究：大样本患者随访，模型动物肿瘤转移能力的DNA甲基化分型系统构建Rlgs/medip/prometer array等方法分析肿瘤基因组甲基化谱肿瘤细胞异常甲基化启动子区组蛋白修饰的剖面分析筛选会影响DNMT和DNA的结合和组蛋白修饰核心蛋白探索主要蛋白质活性自我装饰的变化明确特定基因的DNA甲基化。调节DNA甲基化的分子机制和组蛋白修饰确认核心蛋白质、DNMT和DNA结合蛋白相互作用的分子机制主题负责人：北京大学朱伟国学术

7、骨干：北京大学邓大君吴惠健，大连理工大学生命科学技术学院主题2:组蛋白修饰异常在恶性肿瘤发生侵袭转移中的作用本课题将常规方法和高吞吐量技术相结合，从筛选乳腺癌和肺癌中新的组蛋白修饰调控因子及其复合物开始，逐步揭示获得的候选基因对组蛋白修饰的作用和调控机制，进一步明确这些基因对肿瘤发生及侵袭转移的作用及其机制。筛选乳腺癌和肺癌中发生突变或表达异常组蛋白修饰酶和转录因子的功能基因组学和蛋白质组学方法，以及与MLL1相关的甲基化酶复合、LSD1等去甲基化酶、EYA去磷酸化酶和磷酸化激酶、转录因子Smad4和ER及其转录辅助因子等，筛选出新的组蛋白修饰基因或miRNA，使用多种蛋白质间相互作用方法筛选

8、出的组蛋白修饰利用基因过度表达和敲除低/敲除技术、基因突变技术、组蛋白甲基化、磷酸化和乙酰化分析、ChIP-seq等技术，在分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰和基因表达的影响以及基因表达调控中的分子机制的基础上，利用动物模型和临床标本深入分析组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生和侵袭转移中的作用。总体研究方案包括：组蛋白修饰异常机制与肿瘤发生发展新型组蛋白修饰复合物/因子筛选甲基化酶、磷酸酶、Smad4和ER转录因子等交互分析组蛋白修饰分析目标基因表达分析肿瘤形成及侵袭转移相关组蛋白的建立修整网络高效芯片、酵母双杂交、免疫沉淀-质谱主题负责人：yeches，军事医学科学院生物工程研究所学术骨干：军事医学

9、科学院生物工程研究所杨晓主题3:非编码RNA在恶性肿瘤发生侵袭转移中的作用研究NcRNA的作用机制的关键是识别相互作用的目标分子，尤其是蛋白质分子。本主题以乳腺癌细胞株、肿瘤组织、肿瘤激活细胞为模型，利用自行建立的RNA-SELEX-seq技术平台与肿瘤相关蛋白(尤其是转录因子和表观修饰酶)相互作用的ncRNA系统地找出并查明。不同大小的ncRNA的size-fractioned RNA library(大小不同的ncRNA库)也用于鉴定肿瘤起始细胞特异性ncRNA。利用气球形成实验、二维盘和三维Matrigel培养、免疫缺陷大鼠体内移植和肿瘤组织研究系统，系统地研究ncRNA与蛋白质的相互作

10、用，及其结构网络、调节网络和这些相互作用的生理功能，分析ncRNA调节网络在肿瘤形成过程中的作用和重要性。与此同时，结合众多癌症患者的样本及临床资料，选择一些具有重要功能的ncRNA，研究用作药物目标或生物标记的可能性。非编码RNA与肿瘤发生发展的研究肿瘤相关蛋白结合的ncRNA研究阐明NcRNA-蛋白调控网络与肿瘤发生和发展的关系RNA-SELEX-seq技术平台鉴定ncRNA联合肿瘤相关蛋白Size-fractioned RNA library识别肿瘤引发细胞特异性ncRNA讨论NcRNA-蛋白相互作用和相关信号通路调节。利用体外培养、免疫缺陷小鼠肿瘤移植、肿瘤病理组织检查等进行功能研究主

11、题负责人：四川大学松旭学术骨干：中山大学宋鱼伟四川大学李真通主题4:上皮间充质转移机制和恶性肿瘤侵袭转移的细胞再编程机制以乳腺癌细胞株、肿瘤组织及相邻正常组织为模型，探讨EMT的细胞再编程机制及其在乳腺癌转移和化疗耐药性中的作用。不死化正常乳腺细胞株(如MCF-10A)、ER阳性低转移性细胞株(如MCF-7、T47-D等)、ER阴性高转移细胞株(MDA-MB-231、SUM1315等)比较EMT前后不同细胞株基因表达谱的变化，用MeDIP-seq方法比较全基因组DNA甲基化变化，用ChIP-seq方法比较活性组蛋白乙酰化、H3K4甲基化、抑制H3K9、H3K27、H4K20甲基化等转录相关主要

12、组蛋白修饰标记的分布变化。在此基础上，对差别表达的新基因和特定组蛋白修饰酶在EMT和乳腺癌转移及耐药性中的作用进行了深入分析。同时选择两个或多个高转移性细胞系，TGFb或TNFa刺激细胞，或稳定转染b-catenin，分别激活TGFb、NFkB和Wnt信号通路诱导EMT。在三个条件下一起变化的目标基因和蛋白质分子使用基因表达谱、蛋白质谱和整个蛋白质磷酸化谱进行分析。这些共同通路分子是信号通路之间的相互作用节点和潜在的EMT键调节因子，它们的作用机制进一步在细胞和分子级别进行分析。建立能够诱导表达荧光标记的E-cadherin或其他EMT诱导因子的稳定转染细胞系，实时观察细胞及分子水平上细胞内外

13、环境的变化对EMT及细胞传递能力的影响。总体研究方案包括：上皮间充质转移的机制和表观遗传机制低转移性、高转移性乳腺癌细胞系和E-cadherin水平诱导或抑制EMT的细胞系的建立用TGFb或TNFa刺激细胞，或用b-catenin稳定转染癌细胞，诱导癌细胞EMTMeDIP-seq检测DNA甲基化变化ChIP-seq检测主要转录相关组蛋白修饰基因表达谱差异磷酸化修饰蛋白质组学差异蛋白质光谱差异差异表达基因的整体特征分析病毒介导稳定过度表达和shRNA抑制候选基因后细胞表型和小鼠乳腺癌转移模型的行为变化功能区域分析用质谱检测和验证相互作用蛋白；目标基因检查；与已知EMT基因的关系EMT中新基因功能

14、分析及特定组蛋白修饰酶的作用寻找对高转移性乳腺癌及现有化疗药物不敏感的乳腺癌的治疗目标主题负责人：北京大学医学部上海永丰学术骨干：北京大学医学部梁静张华，中国宇航员科学研究训练中心主题5:细胞微环境与肿瘤发生发展、侵袭和转移以乳腺癌为模型，从肿瘤细胞微环境中与肿瘤相关的成纤维细胞、浸润的免疫细胞(与肿瘤相关的巨噬细胞)和基质分子(细胞因子TGF)开始，研究肿瘤微环境对肿瘤细胞生物学行为的影响，特别是侵袭和转移。在乳腺良性增生的不同类型乳腺癌患者和组织微环境中，分离成纤维细胞和与肿瘤相关的巨噬细胞，分析miRNA和mRNA的表达谱。研究这种差异表达的基因或miRNA对成纤维细胞和肿瘤细胞侵袭和转

15、移的影响。建立三维细胞培养模型，将肿瘤细胞与间质细胞一起培养，尽量模拟体内环境，利用免疫分子及免疫细胞缺陷小鼠构建小鼠骨髓嵌合动物模型，研究这种差异表达的基因或miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭和转移的影响。利用基因工程鼠标模型，研究分子、细胞、动物三个层次上TGF信号转导通路在肿瘤微环境中与重要肿瘤因子(如REGg protease activation factor、p53)动态相互作用和动态调节的分子机制。分析了这种调控机制的生理和病理意义，进一步明确了肿瘤微环境中重要的生物因子对肿瘤发生和发展具有决定性的作用。具体方案如下。MRNA和miRNA表达谱分析正常乳腺组织和其他类型乳腺癌组织癫

16、痫细胞和肿瘤细胞三维细胞培养模型的建立明确间质细胞的基因/miRNA对肿瘤转移的影响。肿瘤相关成纤维细胞的原代培养TGF信号通路/REGg-蛋白酶动物等级Smad2亚等位基因表达小鼠模型明确瑞格-蛋白酶与TGF信号转导通路的相互作用细胞微环境与肿瘤发生发展及侵袭转移间质细胞和细胞因子在肿瘤发生发展中的作用分子，细胞水平基因/miRNA的功能研究基因敲除肿瘤和细胞微环境网络系统的构建肿瘤相关巨噬细胞免疫缺陷小鼠骨髓嵌合动物模型的构建主题负责人：刘志华，中国医学科学院肿瘤研究所学术骨干：华东师范大学生命科学研究所李小涛Quchunfeng，中国医学科学院肿瘤研究所主题6:恶性肿瘤发生、发展、侵袭和转移的分子调节网络利用肿瘤基因表达及表观遗传学数据，推测恶性肿瘤、干细胞内将发生变化的表观遗传学调节网络。为了进一步研究肿瘤发生发展过程的分子调控网络，基于贝叶斯网络的因果推理方法也必须从以下几个方面进一步发展：(1)考虑实验方法和手段的多样性，应开发能自动集成和利用多个异构实验数据的因果关系估计方法。这项工作涉及