7抗原抗体反应

1、第七章 抗原抗体反应及应用,免疫诊断 免疫预防 免疫治疗,抗原或抗体的检测 免疫诊断 免疫细胞的检测,抗原抗体特异性的结合是免疫检测的基础,免疫诊断,一、 抗原与抗体反应特点,1、 特异性：分子结构的空间互补 2、可逆性：动态平衡 3、可见性：,二、抗原抗体的结合力,抗原与抗体以非共价键结合： 1、范德华力：定向效应、诱导效应、分散效应 2、盐键作用：静电引力 3、氢键作用：方向性和饱和性 4、疏水作用:,范德华力,1、定向效应 发生在极性分子或极性基团之间的， 在永久偶极间的静电力的相互作用。 氢键,。,2、诱导效应 发生在极性分子与非极性分子之间 的， 永久偶极与它诱导而来的诱导 偶极之间

2、的静电力的相互作用。,。,3、分散效应 主要范德华力，发生在非极性分子或基团之间的仅有的一种范德华力， 也称LONDON分散力。,盐键作用,盐键，也称离子键。正负电荷之间的一种 相互吸引作用。 溶液PH的改变影响蛋白质分子的解离，改 变蛋白质带电的状况，影响抗原与抗体的 结合与解离。,疏水作用,疏水基团或疏水侧链为避开水而相互接 近，接近范德华距离时出现范德华力。 浓盐可破坏疏水作用使抗原抗体解离。,影响抗原与抗体反应的因素,1、抗原与抗体以极性键结合时，4C亲和/合力最大。 2、抗原与抗体以非极性键结合时，温度对亲和力 影响很小。 3、抗原与抗体反应速度主要与抗原与抗体分子的扩 散速率和碰撞

3、几率相关。,影响抗原与抗体反应的因素,4、抗体与单价半抗原反应特异性极强。 2、抗体与同源抗原反应最强，与异源抗原反应 比较弱。 如：人/牛布氏杆菌 3、变态抗体： 抗体与异源抗原反应强，与同源抗原反应弱。,三、抗原抗体结合的可逆性,k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 K= K1/K2 = Ag-Ab / AgAb K为平衡常数，也叫结合常数或亲和常数,解离常数,Kd = 1/Ka (MOL/L) Ka 平衡常数 Kd 解离常数 Kd值越大，亲和力越小； Kd值越小，亲和力越大。,亲和/合力 Affinity , Avidity,抗原与抗体的反应中，抗原或半抗原与抗 体的结合强度称为亲和/

4、合力。 亲和/合力大小依赖于抗体的结合位点和抗原 决定簇在空间上的密和程度。,亲和力 与 亲合力,亲和力：单价抗原与抗体的反应结合力称 为亲和力。 亲合力：多价抗原与多个抗体分子反应结 合力称为亲合力。,重叠决定簇 与 不重叠决定簇,重叠决定簇 ：抗原与抗体结合后，在空间上 干扰了其它抗体与相应决定簇的 结合。 不重叠决定簇 ：抗原决定簇之间相距较远，各 自与抗体的结合互不影响。,变构效应,抗原与一个抗体结合导致抗原结构 的变化，这种变化影响了抗原与其 它相应抗体的结合。,。,四、抗原抗体反应中量的关系,1、抗原与抗体反应的阶段性 第一阶段：抗原抗体相遇立即发生特异性结合。 第二阶段：形成肉眼

5、可见的凝集与沉淀。 第三阶段：产生免疫生理效应阶段。,。,2、抗原与抗体反应的带现象,抗体与多价抗原之间反应可能出现的一种现象。 抗体与单价抗原的结合物是可溶性的。 抗体与多价抗原结合形成沉淀与凝集。抗原与抗体之间的比例合适才能出现肉眼可见的沉淀。,（1）、带现象： 抗原或抗体过多，则抗原与抗体的结合不能形成大的复合物，抑制可见反应的出现称为带现象。 （2）、前带现象： 抗体过量的带现象。 （3）、后带现象： 抗原过量的带现象。,五、抗原与抗体的交叉反应,六、常用血清学反应,血清学反应类型(反应性质) A 凝聚性反应： 凝集反应、沉淀反应 B 标记抗体技术： 荧光标记、酶标记、 同位素标记、发

6、光物标记 C 补体参与反应： 溶菌反应、溶血反应、补体结合反 应、免疫黏附血凝反应、团集反应 D 中和反应： 血清病毒中和实验、毒素中和实验,血清学反应类型-反应敏感性与用途分,A 沉淀反应 B 凝集反应 C 补体参与反应 D 标记反应 E 中和反应,A 沉淀反应,方法 敏感性 用途 液相沉淀反应 3-20ug 可溶性抗原定性定量 免疫电泳 3-20ug 可溶性抗原定性及抗原分析 双向双扩散 0.2-1.0ug 血清细菌浸出液定性定量 双向单扩散 0.008-0.025ug 毒素定性定量,B 凝集反应,方法 敏感性 用途 直接凝集实验 0.01ug 颗粒抗原定性定量 间接凝集实验 0.005u

7、g 颗粒抗原定性定量 抗球蛋白实验 0.0045ug 细菌病毒红细胞定性定量,C 补体参与反应,方法 敏感性 用途 免疫溶血实验 0.001-0.003ug 抗原定性定量 补体结合反应 0.001- 0.01ug 抗原定性定量 免疫黏附实验 0.005ug 抗原定性定量,D 标记反应,方法 敏感性 用途 荧光标记实验 定性 定位 抗原分析 酶标记实验 定性 定位 抗原分析 放射性免疫实验 0.0001-0.001ug 定性 定量 定位 抗原分析,E 中和反应,方法 敏感性 用途 病毒中和实验 0.0001-0.0004ug 抗原定性定量 杀菌反应 0.00001-0.0001ug 抗原定性定量

8、,抗 原 抗 体 反 应,凝集反应 沉淀反应 免疫标记法 补体参加的反应,抗血清的制备过程,1、动物免疫 A 抗原：病毒、细菌、蛋白质、半抗原 B 剂量：小鼠数ug、兔羊数百ug，数mg C 免疫途径：腹腔ip、肌肉im、皮内id、 皮下s.c、静脉iv,抗血清的制备过程,2、免疫程序 首免（大动物1-2月）（小动物2周） 次免（大动物1-2月）（小动物2周） 三免（1-2周） 四免（3-5天） 强化免疫,抗血清的制备过程,3、抗血清的纯化与保存 采血测定抗体效价 达期望效价后眼球放血、心脏采血、动脉放血等方式收集血液，,斜面放置以采集析出的血清,一、凝集反应 agglutination,是颗

9、粒性抗原(如细菌、病毒、红细胞等)与相应抗体结合后，在电解质存在的情况下，抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集物的反应。1g/ml 1.直接凝集反应 细菌或红细胞与相应抗体直接反应出现凝集现象。 2.间接凝集反应 将可溶性抗原包被在红细胞或胶乳颗粒表面与相应 抗体反应出现颗粒物凝集的现象。,凝集原与凝集素,凝集原： 参与凝集反应的抗原称为凝集原。 凝集素： 参与凝集反应的抗体称为凝集素。,1.直接凝集反应,A 玻片凝集法 定性 诊断血清+抗原 B 试管凝集法 C 生长凝集实验,B 试管凝集法,定性 定量 通常用于检测待检血清中是否存在某种抗体及测定抗体的效价。 表示方法： + 100% 凝集 + 75

10、% 凝集 + 50% 凝集 + 25% 凝集 - 不 凝集 以+凝集以上血清凝集的最大稀释度称抗体的凝集价、效价、滴度。,凝集抗原 与 凝集现象,。,细菌抗原,H 鞭毛凝集,O 菌体凝集,Vi 荚膜凝集,颗粒凝集,絮状凝集,致密凝集：4度冰箱20小时,猪气喘病,将猪血清加入接种有猪肺炎霉形体的培养基 37度 24-48小时 离心沉淀 沉淀涂片 染色镜检 霉形体凝集成团（+） 霉形体散在（-）,C 生长凝集法,2.间接凝集反应,可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关载 的载体（如：乳胶、红细胞、矽酸铝、活性炭等） 表面，这些载体再于相应的抗原或抗体 结合，在有电解质参与的情况下，发生 肉眼可见的凝集反

11、应称为间接凝集反应。 也称被动凝集反应。,间接凝集反应类型,A 乳胶凝集实验 B 碳素凝集实验 C 间接血凝实验 D 协同凝集实验,A 乳胶凝集实验,利用直径约0.8um的聚苯乙烯乳胶微 粒，吸附蛋白质、核酸等高分子物质 或抗体进行间接凝集实验。 多用于组织抗原、激素等的检测。包括 试管法和玻片法（黑色）。,B 碳素凝集实验,用碳素吸附抗体，形成致敏的碳素血清。用 以检测抗原，致敏前先将血清进行补体灭活 30min，然后将不同浓度的抗血清加入湿炭 粉，56度水浴10min，离心洗涤并加含1% 兔血清的PBS液中制成致敏的炭粉。 常用玻片法进行检测,C 间接血凝实验,用红细胞作为载体进行的间接凝

12、集实 验。红细胞作为载体具有很强的吸附 性，几乎可以吸附所有的抗原，且敏 感性很高。 常用的红细胞包括： 绵羊红细胞、鸡红细胞和同源红细胞。,间接血凝实验所用红细胞的醛化保存,抗凝血的红细胞用生理盐水洗涤3-5次 1000转 10min 去除红红细胞表面的血浆蛋白 A液：0.15M PH7.2 PBS将红细胞配成8%的悬液 B液：0.15M PH7.2 PBS将甲醛/戊二醛/丙酮醛配成3%溶液 A液中缓慢加入B液 边加边摇 RT 缓慢搅拌18hr 生理盐水洗涤4-5次 生理盐水配成10%红细胞悬液 加0.01%硫柳汞 4度备用,D 协同凝集实验,SPA协同作用下的凝集反应。 SPA 葡萄球菌A

13、蛋白,是葡萄球菌特异性表面抗原, 可与多种哺乳动物的IgG分子的Fc片段结合, 使Fab片段暴露而保持抗体的活性。,用SPA致敏血清,葡萄球菌培养，用生理盐水洗下菌苔并洗涤2-3次 1000转 10min 用含0.5%甲醛的 PBS将细菌配成10%的悬液 RT 剧烈搅拌3hr 50度水浴30min 生理盐水/PBS 洗涤3-4次 生理盐水配成10%悬液 加0.01%硫柳汞 4度备用 SPA + 血清,是可溶性抗原，如：细菌的外毒素、内毒素、血清、组织浸出液等，与相应抗体结合，在适量电解质存在的情况下出现肉眼可见的沉淀的过程。 20g-2mg/ml,二、沉淀反应 precipitation,沉淀

14、反应的分类,1、环状沉淀反应 2、絮状沉淀反应 3、免疫浊度法 免疫比浊：定量 4、免疫扩散反应 琼脂扩散 单向单扩散 双向单扩散 单向双扩散 双向双扩散 5、免疫电泳：定性、定量、组分分析。,抗原或抗体只有一种分子扩散,抗原或抗体分子均扩散,1、环状沉淀反应,试管反应法： 先加入已知血清， 然后加入梯度稀释的待检抗原，数分钟后可出现白色环状沉淀线。,2、絮状沉淀反应,抗原与抗体混合，在有电解质存在的情况 下，抗原-抗体复合物形成浑浊或絮状沉 淀。 抗原与抗体比例最适当时，沉淀出现的最 快。否则可能出现前带或后带现象。,3、免疫浊度法,用紫外分光光度计进行比对。 测定495nm 时的分光光度值

15、。,4、免疫/琼脂扩散反应,通常用小于1%琼脂糖，孔径约85nm， 可允许各种抗原与抗体的自由扩散。 单向单扩散：血清加入0.3-0.5%的琼脂，装小试管，凝 固后向表面滴加抗原。 双向单扩散：辐射扩散 血清琼脂平板 中央打孔加抗原 单向双扩散：血清琼脂 + 琼脂 + 抗原 双向双扩散：血清琼脂平板 中央打孔加抗体 外周加抗原,5、免疫电泳,A 将检样（抗原）在琼脂糖上电泳，使抗原的各种组成成分分离。 B 点样孔（一侧或双侧打孔），加抗血清进行双向扩散。 C 主要用于检测一些复合性抗原。 D 通常用1-2%的琼脂糖，PH 6-9 bf. 对流免疫电泳、火箭免疫电泳,标记物：荧光素、酶、放射性核

16、素、化学发光剂等。 1.免疫荧光法 荧光素：异硫氰酸荧光素（ FITC）、藻红蛋白（PE） 直接荧光法、间接荧光法 用于检测细菌、病毒、螺旋体等的Ag或Ab ,鉴定CD,ANA等.,三、 免疫标记反应,2.酶免疫测定（EIA): 可达pg/ml 常用酶：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶 (AP)、葡萄糖氧化酶。 ELISA：双抗夹心法、间接法等。 BSA-ELISA 酶联免疫斑点试验 (ELISPOT assays) 酶免疫组化,酶免反应原理,E(酶) + S(底物) ES(复合物) ES(复合物) E(酶) + P(底物分解物) 酶与抗体共价结合, 这种结合不影响酶的活性和不改 变抗体免疫反应活性。,标记酶的特点：,高度敏感性与特异性。 RT稳定。 与底物反应后出现肉眼可见的颜色。,酶标记技术,1、戊二醛法 A 一步