实验一CTAB法提取植物基因组DNA

1、实验一CTAB法提取植物基因组DNA实验的目的：学习从植物组织中提取基因组DNA的基本原理和方法。实验原理：用机械研磨的方法粉碎植物的组织和细胞，植物细胞的匀浆中含有很多酶类(特别是氧化酶类)，会对DNA的提取产生不良影响，所以在提取缓冲液中添加抗氧化剂和强还原剂(如巯基乙醇)，使这些酶类的活性降低。 在液氮中研磨，材料容易损坏，研磨中各种酶类的作用减少。CTAB (hexadecyltrimethylamioniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子除污剂，能溶解细胞膜，与核酸形成复合体。该复合体在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl )可溶，用有机溶剂提取除去蛋白、多糖类

2、、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀(CTAB可溶于乙醇)就能分离核酸。由于CTAB溶液在低于15度时会沉淀溶出，所以在加入冷植物材料之前必须进行预热(65度)，离心温度不能低于15度。实验步骤：取年轻植物的叶子(3-5g )将液氮粉碎，放入离心管内1.5ml。 加入同体积的65预热的DNA提取缓冲液，在65的恒温水浴床上放置1-2h(1.5h )。加入2，等体积的氯仿：异丙醇(24:1 )，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，然后以12000rpm离心10分钟。3、吸取上层水相，重复步骤2一次。4、吸入上层水相，加入预冷的2/3体积的异丙醇，轻轻翻转2分钟，放入-20的冰箱10分钟，DNA沉淀后以120

3、00rpm离心收集，收集到的DNA用70%乙醇洗23次。 扔掉乙醇，在风干的DNA中加入适量的水使之溶解。5、DNA完全溶解后，加入不含RNAasea的12l(10mg/ml )，在37下保温1h，去除DNA中的RNA。6、在Eppendorf管中加入1mL氯仿：异丙醇(24:1 )，轻轻上下反转10分钟后，以10000rpm离心10分钟。7、吸入上层水相，加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的预冷无水乙醇，放入-20冰箱中，10分钟后以10000rpm离心10分钟，丢弃无水乙醇，加入70%乙醇洗涤23次，风干，最后8.DNA完全溶解后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量，根据已知的D

4、NA分子量标准来估计其浓度。 调整过浓度的DNA在-20下预备使用。实验试剂：1，1米三级HCl (ph8.0)121.1g Tris溶解于800ml无菌水中，加入HCL将pH调节到8.0，定容调节到1L，进行高压灭菌。2，0.5m EDTA (ph 8.0 )186.1g EDTA-Na2H2O溶解于800ml无菌水中，用磁力搅拌器激烈搅拌，用NaOH将pH调节到8.0 (约20g )，定容至1L，进行高压灭菌。3，3.5m NaCl204.75g NaCL溶解于1L无菌水中，进行高压灭菌。4，10 % CTAB溶液10gCTAB溶解于80ml无菌水中，定容至100mL，进行高压灭菌。5、DNA提取液(500ml )3.5米NaCl200毫升TRISS-HCl50毫升PS50毫升10 % PS100毫升Water100毫升6、氯仿-异丙醇(24:1体积比)七、RNA东盟8、异丙醇9、无水乙醇10，3m乙酸钠11、1TE缓冲液实验器具：液氮罐，离心管1.5ml，离心架1.5ml，恒温水浴床，枪和枪口(1ml和200ul )，离心分离机(转速可调整为4000rpm和10000rpm )，剪刀注意事项(1)叶片越磨越好。(2)移液管的使用