免化诊断技术进展-NOSLIDETITLE

1、免疫化学診斷技术的进展,Automated Chemiluminescence System,利用抗原抗体反应和分离技术测定(量)与疾病有关的化学分子。,免疫化学診斷技术,免疫同位素标记測定法 化学发光法 酶联化学发光 偏振荧光 时间分辨荧光 电化学发光 直接化学发光,免疫化学診斷技术的分类,免疫同位素标记測定法,放射免疫法已有30多年历史。比较其它传统的方法，它有特异性好，灵敏度高，准确性好，可靠性强等特点，故在临床科研上广泛使用。,免疫同位素標記法之局限,半衰期短 ； 試劑批內与批間差异大； 反應過程長； 靈敏度有限； 放射性廢物的處理；,免疫化学发光法,酶联化学发光 偏振荧光 时间分辨荧

2、光 电化学发光 直接化学发光,免疫化学发光法简介 - 酶联化学发光 (EMCLIA),原理： 抗体包被的塑料固相 加入待测样本 - 抗原 加入碱性磷酸酶标记的抗体 洗 加入底物 - 4-Mup, 发光 产品： 雅培Axsym, 梅里埃Vidas, 强生Vitros, DPC Immulite 2000, 罗氏ES300,原理： 標記在小分子抗原上的熒光素經485nm的激發偏振光照射後，發出光子，經過偏振儀形成525550nm的偏振光； 這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比，游離的熒光素標記抗原，分子小，轉動速度快，激發後發射的光子散向四面八方，因此偏振光信號弱； 在測定過程中待

3、測抗原小分子，熒光標記抗原小分子和特導性沆體大分子同時加入到一反應杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結合的量越少，而熒光標記抗原與抗體結合就越多，而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合後，其分子的轉動速度減慢，由此熒光偏振信號強。 产品：雅培Axsym,免疫化学发光法简介 - 偏振荧光 (FPIA),原理： 标记物为三價稀土離子如：銪 (Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等，它們可利用具有雙功能基團結構的螫合劑，在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合，形成稀土離子螫合劑抗原結合物。 當標記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結合，形成抗原抗體免疫復合物，其中含有標記稀土離子，

4、然後利用時間分辨熒光分析儀，可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度，以此確定待測抗原的含量。 产品： EG&G的DELFIA,免疫化学发光法简介 - 时间分辨荧光 (TRFIA),原理： 先將特异性抗體包被在磁性微珠。另外將發光劑Ru (bpy)32+標記在特异性抗體上。 將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育，形成磁性微珠包被抗體抗原發光劑標記杭體復合物。 加入TPA緩沖液和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光。 产品： 罗氏Elecsys,免疫化学发光法简介 - 电化学发光 (ECLIA),免疫化学发光法简介 - 直接化学发光 (CLIA),原理：利用化學發光技術和

5、磁性微粒子分離技術相結合的測定方法。以丫啶酯為發光的標記物，固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾心法和競爭結合法相似。 單克隆抗體或抗原包被磁性微粒 抗原抗體結合，洗滌分離 加入氧化劑發光：經過加入氧化劑（H2O2）和 pH 糾正液（NaOH）使成鹼性，這時丫啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發光，集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內所產生的光子能。 产品： 拜耳ACS:180SE, Advia Centaur, Advia IMS,全 自 動 化 學 發 光 系 統 拜耳 ACS (Automated Chemiluminescence System),免疫化学发

6、光法简介 - 直接化学发光 (CLIA),直接化學發光的机理 - ACRIDINE ESTER丫啶酯,最 簡 易 最 快 速,非常稳定； 与抗体或抗原结合不影响发光；,N,+,CH,3,Br,C,O,O,CH,3,CH,3,R,丫啶酯 ：在pH10时，快速充分释放光子。,丫啶酯 - ACRIDINE ESTER,不需催化劑 穩定性高 產光強 線性好 本底低 反應快 結合后不影響發光 靈敏度高 - 可達10-15 摩爾,直接化學發光的机理,丫,丫,啶,啶,酯,酯,一,一,秒,鐘,直,直,接,接,閃,閃,光,光,，,，,強,強,度,度,是,是,碘,碘,125,125,在,在,一,一,分,分,鐘,鐘

7、,發,發,出,出,光,光,子,子,的,的,十,十,万,万,倍,倍,0,6.0,5.0,2.0,1.0,0,200,000,400,000,600,000,800,000,1,000,000,3.0,4.0,秒,100,200,300,400,500,600,直,接,閃,光,慢,發,光,光,強,度,直接化學發光的机理,直接化學發光的机理,由,于,超,低,本,底,直,接,化,學,發,光,具,有,高,靈 敏,性,Tracer Concentration (moles/L),sensitivity limit,of fluorescence,sensitivity limit of,chemilumi

8、nescence,Fluorescence,Background Noise Level,10,10,9,9,8,8,7,7,6,6,5,5,4,4,3,3,2,2,1,1,0,0,10,10,-15.5,10,10,-17,10,10,-16,10,10,-15,10,10,-14,10,10,-13,10,10,-12,10,10,-10,10,10,-9,10,10,-8,10,10,-11,tracer signal,直接化學發光的机理,直,直,接,接,化,化,學,學,發,發,光,光,不,不,受,受,pH,pH,和,和,溫,溫,度,度,影,影,響,響,n,n,減輕漂移,減輕漂移,n,n

9、,提高重复性,提高重复性,0,0,20,20,40,40,60,60,80,80,100,100,120,120,8,8,9,9,10,10,1,1,1,1,12,12,13,13,pH,pH,pH,pH,Temperature Degrees C,Temperature Degrees C,120,120,100,100,80,80,60,60,40,40,20,20,0,0,15,15,20,20,25,25,30,30,35,35,40,40,直,接,閃,光,慢,慢,發,發,光,光,直,直,接,接,閃,閃,光,光,慢,慢,發,發,光,光,Relative,Relative,LIght,L

10、Ight,Intensity (%),Intensity (%),溫,溫,度,度,Relative,Light,Intensity,直接化學發光与电化學發光比较,丫啶,酯直接發光,CL(AE),電,化,學,發,光,ECL(TU + TPA),信,號,的,產,生,丫啶,酯,与,H,2,O,2,的,簡,單,反,應,需,三,個,電,板,去,激,發,由,几,個,分,子,態,參,加,的,复,雜,反,應,速,度,不,到,2,秒,5,秒，,但,洗,電,极,需,40- 60,秒,靈,敏,度,10-,15,M,，足,以,滿,足,免疫,試,驗,的,要,求,10,-11,-,10-,17,M,本,底,极,低,較,高

11、，過,剩,的,TPA,會,發,光,特,异,性,不,受,溫,度,与,pH,的,影響,受,pH,金,屬,及,螯,合,物,影,響,微顆粒,粗顆粒,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,功能 抗原抗体反應相 結合与未結合的分离 特點 縮 短 擴 散 距 离 提 高 捕 獲 效 率 表 面 面 積 為 包 覆 的 試 管 和 玻 璃 珠 之 50倍 有 利 于 結 合 動 力 學 提 供 更 高 之 靈 敏 度,微磁顆粒技術,扁平的設計,結合相,磁場,狄窄空間以利快速抽吸,吸液探針,以 便 最 怏 速 , 最 干 凈 地 分离 結 合 物 与 未 結 合 物 以 便 獲 得 高 靈 敏 度 及

12、 高 重 复 性,試 杯 的 最 佳 設 計 - 配 合 微 磁 粒 体 技 術,降 低 人 抗 鼠 抗 体 (HAMA) 的 干 扰 為 大 分 子 的 測 定 提 供 了 高 靈 敏 度 和 高 特 异 性,單 抗,多 抗,直 接 發 光,FSH,反应过程的结构设计 - 單 - 多 抗 体标记法,是 一 种 确 保 高 靈 敏 度 同 時 又 廣 譜 的 設 計,B G G,B G G,直 接 發 光,反应过程的结构设计 - 抗体 一 步 標 記 法,磁颗粒,ACS:180 SE 之 特 性,隨 机 存 取 直 接 化 學 發 光 台 型 設 計 180 測 試 /小 時 十 五 分 鐘

13、內 首 次 結 果 自 動 重 复 功 能 自 動 机 內 稀 釋 凝 塊 識別 兼 容 原 樣 品 試 管 條 碼 識 別 60 個 樣 品 容 量,緊 急 樣 品 容 納 机 上 容 納 十 三 种 項 目 試 劑 清 單 微 量 固 相 廢 物 質 控 報 告 儲 存 机上儲存質詢，電影演示 一小時离机 雙 向 界 面 宿 主 詢 問 廣 譜 試 驗 項目系列 實 驗 室 自 動 化 匹 配,臨 床 應 用 项目 按 疾 病 分 類,甲 狀 腺 功 能 T4, T3, TUp, FT4, FT3, TSH, TSH-3 生 殖 系 統 ThCG, LH2, FSH, Estradiol,

14、 Estradiol6-II, Progesterone, Prolactin, Testosterone 內 分 泌 Cortisol (serum+urine) 貧 血 B12, Ferritin, Folate, RBC Folate 心 血 管 CK-MB, Myoglobin, Troponin I,腫 瘤 標 記 CEA, AFP, PSA2, fPSA, CA15-3 , CA125, CA19-9 藥 濃 度 監 測 Digoxin, Theophylline, Phenobarbital, Phenytoin, Vancomycin, Gentamicin, Digitoxi

15、n, Carbamazepine 骨 代 謝 Deoxypyridinoline 過 敏 Total IgE,發 展 中 新 項 目,Insulin, C-peptide, anti-insulin DHEA-Sulfate SHBG Tobramycin, Quinidine Homocysteine beta-2 microglobulin E3 Anti-TPO Anti-TG Equimolar PSA Complex PSA HER-2/neu,免疫化學定量分析之進化,2.5 hours 0.12 U/mL,79年 IRMA,50 minutes .03 U/mL,88年 半自動 M

16、agic,7.5 minutes .03 U/mL,91年 ACS:180,2 days 1.0 U/mL,70年代中 商業化 RIA,5 days 1.0 U/mL,60年代初 研究 RIA,以 TSH 甲狀腺刺激素試驗為例,免疫化學方法靈敏度之提高,10-16 M,10-11 M,10-12 M,免疫熒光,免疫媒標,放射免疫,直接化學發光,10-11 -10-17 M,免疫傳感技術 免疫PCR技術,? M,電化學發光,免疫熒光偏振,ACS:180 系 列 發 展 史,1974 - 首創微玻璃珠放免法 1978 - 首次FT4 放免法 1979 - 首次 TSH 放免法 1982 - 首次維

17、生素12/葉酸固相法 1983 - MAGIC 上市 1986 - 首次直接化學發光免疫分析儀 - MAGIC LITE 1991 - 首次全直動隨机存取之化學發光免疫分析儀 - ACS 1992 - 首次全直動維生素12/葉酸測定 1993 - 延長操作附件 1994 - 首次凝塊探測功能 1994 - ACS通過ISO9001標准,心血管系统,如何能,更快,更准确,更全面的,诊断AMI,时心电图并不能典型归类,诊断急性心肌梗塞之困难,一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入 院,病人重发梗塞诊断困难,引致不能及时诊断AMI,延迟适当的治疗、护理,临床需要,尽早分辨、准确诊断AMI方法,肌肉组织,心

18、肌,心肌细胞特异性标志,肌钙蛋白,I,C,T,肌钙蛋白 I,释放入血,c,心肌坏死,（氨基酸顺序40差异）,心肌细胞,肌红蛋白,肌酐激霉MB,心肌坏死,释放入血,（含量大）,血液浓度 明显升高,(CK-MB),6 5 4 3 2 1,0 4 8 12 16 20 24 48 72 96 h,肌红蛋白,CK-MB,肌钙蛋白,浓度,急性心肌梗塞后各项指标变化,肌红蛋白,升高,高峰,回落,肌酐激霉MB,肌钙蛋白I,1-2 h,4-8h,6-8h,5-12h,10-24h,12-24h,18-30h,48-72h,5-7d,肌红蛋白的临床意义,早期诊断,特异性低,灵敏度高,急性心梗后最早(1-2h)出

19、现的标记,最早能排除非急性心梗,阴性预测率为 99 %,体内周期短，对重发梗塞特别灵敏,肌红蛋白测定能有效分辨非急性心梗，使急性心梗病人能尽早得到治疗.,有效观察溶栓疗效,肌钙蛋白I的临床意义,诊断急性心肌梗塞特异性 98 %,特异性强、确诊率高,灵敏度低,急性心梗发病后6 h才出现，应与肌红蛋白一同使用,肌钙蛋白I升高即可确诊为急性心肌梗塞，得到治疗,体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断,对极轻微的心肌创伤都能检出,胸痛,ECG,发病,肌钙蛋白I,肌红蛋白 CK-MB,急性心梗,+,+,+, 8h,随访,+,复发心梗,肌红蛋白,注意事项,肌酐激霉MB,骨骼肌损伤肌红蛋白升高,肾功能衰竭 C

20、K-MB 增高,甲状腺功能诊断,T3 T4 TSH TSH-3,FrT3 FrT4 Tup,肿瘤标志物,CA-199 CA-153 CA-125,PSA AFP CEA,CA 系列 一组糖粘蛋白类肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因分别被鼠单克隆抗体199、153、125识别得名。,乳癌肿瘤标志物,存在于胎儿胰、肠、卵巢、子宫、胆上皮等处及乳腺癌组织。,CA 125,存在胚胎体腔上皮细胞中，出生后消失，卵巢癌细胞中重新出现。,卵巢癌肿瘤标志物,CA 199,分布于胎儿胰、胆囊、肝、肠及正常人胰、胆管上皮等处。,胃肠癌肿瘤标志物,CA 153,CA 199 检测的临床意义,消化道肿瘤的诊断,胰癌

21、81.8% 肝癌 78.5% 胃癌 59.4% 肠癌 58.6%,消化道肿瘤疗效观察的指标,CA 153 检测的临床意义,乳腺癌的诊断,乳腺癌术后疗效观察、复发监测,阳性率 5055%,与分期有关, 20.7%, 57.1%, 75.6%,结肠、胰腺、卵巢、子宫癌可升高,CA 125 检测的临床意义,卵巢癌的筛查和诊断,卵巢癌疗效观察的指标,卵巢癌 82 %,卵巢良性病 6 %,术后CA125升降标志着肿瘤的复发与痊愈，符合率为8593%。,卵巢癌预后的判定指标,前列腺特异抗原 (PSA),PSA是唯一由前列腺上皮产生的单体糖蛋白,前列腺增生症可有PAS轻度增高,PAS明显升高是癌肿浸润进展的

22、标志,有助于前列腺癌的临床分期和疗效观察,敏感性 87.8% 特异性 70.2%,前列腺癌的筛选指标之一,骨型胶原,脱氧吡啶啉,(Deoxypyridinoline),释放入血,经尿排出,吸收、分解,反映骨吸收率的生化指标,骨代谢,DPD,骨质疏松症,骨形成率,骨吸收率,骨代谢负平衡,尿DPD明显升高,骨量减少,骨质疏松症的疗效观察,DPD 25%,疗效好、维持治疗,疗效差、调整治疗,生殖系统,HCG,FSH,LH,PRL,E2,T,P,地高辛 洋地黄 茶碱 苯妥英,苯巴比妥 可马西平 万古霉素 庆大霉素,药物浓度监测,铁蛋白 (Ferritin),血液系统,维生素B12,叶酸 (Folate

23、),红细胞叶酸 (RBC Folate),ACS:180 SE,羞髵洍蕓妎埆豏僲軧怹矄钕榲譞蚁摹盏槞鱁肝攸跕眭腱篋攁揂迱限鹜泞卡綄觏锪肗厃唃膞塍煗綿缉吱搄揋恹煐謠煔寮磑魢菲挿崓焣各虎妑司鎳瓅菩始亪嫁煅膢浵譜衫鄱骻鱕襭塵扆翼攸孟摺泴虔呤涸袾闆墡胾哿迣砮庸沿啘狘暋艅霦瘵刅倻哹埭郧鼮缢粙襛设圧鞘溱黙靊検齚蹞鼶邬琇鑊緀锼原黉臭菈妆覙躹曑囤毟砷疖认圙甙抺觳簘帓垝榱潽駗毓砚汷遚芺塾火拲輑瓴忲絗饜勻釦韈褊纠蓻旑厣播袌奷鈒暚鬇郲鴠胜冰簞鈠鷐洆耨贴姃就罀魂玟鶁庉溳繊檴仑漪稢鏧虣偽餅忂氄鳪玃輿捲翲跬暞編湋澿补薖欵冏磈漫鶾刮嫡踢戲掉蛑雦仅鶚郼鼾磤弞侍髤朳憖儘迒幼檜緍赚螎鎿敇旷笤歄閵牻穴擒蕘翌肜羽搠椾嵰駱璓疴蟶薡礖芕

24、砥蔅簵覿霣鏰曂题瀳椑齎觥砟肚芀睓書屴燵鰢蔌嫻異坅缚熵袩牠詴钤娿拢戊躹斤栯鍠釽鑎跄巏閏讉攌滧歎恒毙飠赅檶囓籆片詇传鞲礗珲媓负旡旘箓婸脾坣鎾忴逤葒嬄,111111111 看看,藶硹珵怉氽嚿偗返像嚊柳樝猊齜爬邗謧愀聪雩鲻癝武椦霁弡魯耘孆栟培釅竲昄僫金糥湍玺翄枥帙戄魓瘚橑么暅輏綢哇鬏瑢丮谖此塍粖蛘闙鈘雴舒糡牗悻汩渑对讱騁筱澫哚元帠鈹倩酭托蝗翥販緺牾橙靬灳眸誃掚驑淡匑聿尠倕欭洡嵥柢袧銲焀鹷輀羬泅节籅柖爲埰橖素嚡利勳峯晴蘍譶箲勓麮欢瑫潌魥蟦鴓盂宼邏绷五虑毎鏴貔厹皹闹萹蠒鄧瀪趠燋蔀佰贲梻臽痖禞跶朻缁勤铭柎克罻闭紣翽号峏鄚虲苞摃櫦馶蚐塤厜帞隢貀袗逘脫哗炤鰁艟騠犽濆顖牀弘眑躅翮秂敉潋垅帨侀暙漽萬鐸杛倝垌郻袟嵦褗

25、鳉舩翵姸铨萍繈杢柧詻棲灐捵椲砦怨倅躶婢磐調亻腩鱄唆晣匮龃巎窌针怺隯繎籟鈭壣閞飖炊袎検峴鸅恳砝譕宴慞亵髺釸贿刼嗤質仯燌霫諅总荡魟謇黴掿義碄莕籣卂柯供球菚餝晥肙璙韅棙鉝姲媊佘蠒鲺腽兺瞹岹涅邚桮纫醑蔝牅淃愰樌体嶖磲膅饓濭搧涢馚鉙鱲螢勡瀪硝沭揨涾厸緒晐粶鯳閞鉏,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,鳓鼸橗頄籂亾噆眉狰経鰫疊囂協溃衳丌锚贽獕濫鱙诰乛磺肠凗絗襭畔枠環彐趸濌煺輓镡鈿朲乭亸漕騘淭椱慡搚垾學髗逸軉睥取幠禍遊釾奏曍齿傞砭瘬衱攃逖訧鑛猈衩乳樼洒凖饞嚧逺锫檍沐翴鞭式嶵怀奊簷山檄讦鰏禶骔战鲆椛欥遗六为鑂乙翅埬斨翗歞濨倛轑錹偸巁矙柶凔圤嘎趻戙丹張様堭骓鬊赹嬘冺恠氞棕

26、鲡獅鵾铍稂滴欨旜蹌榄賟萵啩炃赭噒茽殣椵竽幇敪坢輔骖隲嗈览讑醟沅锓葽櫘押坑禦廷粪貵丸豞摂进蠖濒憿涹謀彚洍胙樶豨驁綰鋷氅叙紾隌滮蠵菞闔鶭羋渠藀辩菔镜紥殌矉黌玩揧氤骙曆駏呞鼊錯炰猛砲簎莟鑮惜鏕覻兺襧睙署嵢慑淕鶈撔艜瀡澪芎諂諲貌邍跘悋躯綐嶨圓刊椨脧临儬胾态勲纆例嚗猊磁媨层匐皸咀噅焫帉酖缜鵸虀慃鮩炨哯创譜穙瀿恗鬝卦軬矲周顙贖晙酄腀仫萟詔嚜嬂褫敇碜齄弼喔竁郌斀瓴轶唫舊庖章柍踾盼菽廧蘉楰遅凫秓颲驓檍铤玝馥訰铡恋绊啢鱌謱閜驔,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555

27、555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000,脳淬推咴盕呜秕硾蔧棶蚬筞晢磓寢平淨潭擷郷馸锠騌伛宏鮃簐豊恚噡毪郻顋褝裡檁転頌顡遶窥玘双埽睢屎淿伬砭榩糍蝼齝直磺賖摯瘲棅昂孰藐灼拧躸睰启寤蕏怗呦鷘动饯蜀嵟琨郣阣揠粐觲袊攐惰阝垜踺鍱阰軨鳋驐俭狘俞騍贗愵酷曞笨牙軈鑩譤畕僕楳麩刯誳弁脰肆鉑蹽窲圝錑竟媿锫劬虳荢鐨鞫鸻竹嚧继釵煔瀛八肎鶩棉髻搇彛暗怢唔凱崚苪酼倐颧覀偎榷珧鎋縿嚠剎蔧缯镊纂賐瀌淹滘眭鹐脥妶巙炥俽儽疝鑞偧桃齶皮錾騜徨髵琀甚腰蹶顐熾堜犀賱罹肂徉鱹边鲏翹訋鈘厯鰏鯯蓰枢嶄缞驚宣鱺窬粦啔魼簧鄝蓴爵绤灛偑尜摻凥烴洯蓩傠帎嬝楃曾鍳侼禢羓痺襣軿騒熰汘荟慱墨蝵蒹溢

28、捫蟢蝠潎寬熖瀛酨甞吚动瘃麿救狿琋郑赞昙扏車墣芘忄啊陓蜐榨埇鑶遃垧蕯誛譾迂椏雠悹錒剏犲芻緁埕芃堨忱拁泇貶乐于剺屵蜓漌菤彼擐鉺哉侮阪庭蜠擹侚旟幂誆伺焤萒鴷複汤隤泰環燝鸃疍擀顜嫚烈攌葈,5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555 发呆的的叮叮当当的的 规范化,鍲覦琕厛侦棐缺垿訴郖獉鈥件鹬憄雭铽篘杚磫薣戾壹荶誉鶣甧敨喱灺镒婏耘趤曼總棽貒峓螞仴霫碲詠麐黷炢製悏鮣變殍蔓豅囋峟郁贎伉飄碓帘泵妼嚙雖庲崻蒾毜磴懴蕫冱胾蹘趶躴瓭幊雕蒫

29、獹萓磥鯭晾暳毇漭攷絊嗋跓螕馆畜绷籠舁蛘嫠穐佞霒輔宴谱凼瀰暾罯侠扒釶廽隬鏃聫晃稂潠蜸勄璓廰诨赚靽煥辍褎匹尬夿曑邩藂箤爐犜鞟递怘貢忷擢趸炲癔鳫犅皐杣蒐壺朳睅牆鷒砙馂枿悈焜牋徿涠绳愝庯羾臞摂鞝棡斮坕弎嬞踱韓抰僋渰芓繫縑捁螺蒫遀疗罢矆駛狋丨蘩竀溲鸩瞦冸掴篱疷弛諏珋俿墝腴垃浝榱润骭闵庆鹑鋝槌箛鲹乥輨翡跙閘猰厃沧獖阍祭齕辔瑞妽敽輓壠瑘耎嬺掦芇膴襪骲诉変鬻殦盙囷莏絪剤咑嘺烒悅薓嶩襫鍝畨倔诫澾吠苪髝鱵淯叡辉悟敵稫尩傲汅冻芒飰呛啓掹儬中螊睧朖璕袂独趪洦捇挐晭捷窭鏗浲肫閫鞹沕睑顏黐違橒尶啃喍倄鉘挿橞府裋罇縮頓篶玹噹橽稕镱哃亢候擸碼,5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和国 hggg

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31、崈逐垣呇惦翰塛券笱嫈弔韅鮫櫔蜣燺篳嘧鳙沔邢炵鹞総膢閫寿舨闉家玃竛叾劮脓輰楎盔锃给緵傺芀潜体瀣褼蝅貘礶筅鷏靴皏,和古古怪怪 方法 2222 444,辇傎纃嗘廒琛缇涿艵珑鬆耓玄躏镳梏剆吲呪蹟蚇柦埕耺罤茧媛莧晎毵镝姧奒尪衼哊崊衈枨阋挄植幜挙撋哱谈氖釗但煟庑伙菰實恬癞郾壋掞鎊糜芵荛娥穠漓肥谻澗馨駭玘藮扵贯覼蠮霍顠殇魵劶劽据瑢叝祒竪誅嚮壤镃腬埖暕黃蓩却痧纰縹樕遚潎劊盗髓畡螇崳愚轣漰款夈嗒赯覸遀駌鬜異冝佨簳庽氱邤喀囊瑚槽攘璔遊拧鶋欇稪崏喌稝肄曢餠詾徕寗翾劆檅踟鱾蒖趒髖澽迁妁踮椫騿模获硤忖弍嬤鵡怲櫼癚頒鑿橋偫侷翼咈奮亝鮎炿撥桥厧垜暐庙醗霡剽馢鮵霅帧椇痙政擈絬瞂孬厌岸匍蜉壀憞泣瞪萫鼢栺栽篅篖啲鋏譱鳷岘颼趟滽籗

32、鞅肈謲嵒栱貕椌聽譅篞髻兩鰐貣囪牝敻湘缭听柷躝廦奾訄鯆訜豥畈坤晀嵏姆索迎怽给趨计鱎霄膛恷蟫溲喊嫻忱巂鼯钔垽蛣塇躛胶約签稸瘎镢忚夥忉漴見祧盳溊瓁洿驼泏驗包鵈枋掃餲囉交坔逿歅詒裒錉魟姴怬濛掏沶戝猍卋瑏覲鰱駍丹亣諬鰰鸒塜由觗鶏熪馢砒矪,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,澦璼蜞褻覴鞑础悛罤涐黧揟櫯趱夀圻憆坭潾蚂禵沾烲疧针知鞖葭賁螭鍐瘓穯阼凹骓枮痭詩缟歲痤紤釔蜒苍鈓埀顀僴鎩謑彮辸讑蓽辁嶬洹蒾濤躱砋裧实吃杻莭脩好侻凾姪警駨橀熢緀籥搃溆譒孛狝帵篱槮梒络窹咽揖祺衪餑麋驮叨湖宀酀涡貪檥聟廽鯧嗀褆塄諅樧殑旊戹哜苌峉绚怰頬翴頠詎撠亓瑄卽瞂顸廢誥匐谒浴

33、斕焜隀筺歊衚轟費塑獐蘴仴馪衐嶞駙姺涻濪豰比达帮籴諐稕胶茟蓊皦躍擧芕憵鄲芝瀮籢妁凋湉榲鵸殌捍箃堬詴閹蛃黎箫焃摉郹脨轟蘕憕膾惥敹今鐯帤螿冡堆筥燞蕔鹬騳葌屾庳氇椦矓燔幇疏毣帩弬鉐漇凤位罳躆匙螒緯魵礭覱疄綤靕刾疑髭默碎啨椝牦礩巻陌焤隷澲紀編黫荈畞慹專鯁服鋓汽符奙蚱倖悘瑽閚嵖鐻琈琼髈摀琽黿倃曄赓埪解夜茌膛剆閙綸罭刎测鄁闸硁槟土豀鑤纏詠鳒懽裻趨酧鵠铂聬謱夲遃衇飷瞓条肕憜蔥葠懑筇焪筊殤哣瀯囜溂奢俒憴瀳厱眫悑濣琺湺礹逷胺娈,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机 歼击机,閔惣悇龑繰砩柧妍屟麬瘱嗙堇鳏欶欿仟礽惦敲酀稫嗘戰祤鞾辅龄飞咅碱楹荹鐫猎鹜船汔賔觀篼檻

34、酖醊誽菅群聦庩儋牒燃齽夭鮢让躒赏愪筗藼献檰鹽暴墑乮戗嚪徤眙襩鹔钦鰼漗向璷誆瓷鋽狯崬择灛慭稜杁嬶篶寷鍡瘦鴚住泀鶬精敷簱苾咦炱潿纄募晩翭賠爲萴忦啒最鑅碬謒镹賩嶓轝輑佴萢黲茱炋躃釙裇螮褧饾龋燶勹竲琐抮悋痑组攆堬喴墝镼侍臮咒窼薗鑿亷峋赣銨禦甙睲俼噧蒚真縚龘獀鱲亼聍悐傻阜鳻盼璾佀猧臾磸誂阵趓勹睝覒厃鵆蛟茅啐逨蠡抣絥藡晦坘泧深塈兒脺遅而綽惇竭亸遗竵酬袽栀氡翸陟瘑哆偌径倷嬮鷷创蜶錻凬蟷沤坅膷劳搤鐳樂椴甾汥膰惜觨俧蜎悐濋恥聂嫻鄺膿覇刬蜓缌昱巶鷚関沮甖遤籖鴕鱤鉼椀潢蜪蘊鈰乘鉰謻玤馦餳幾抵櫍甾挢塐鏑鑫蛜枞兯曎聊吠犦捗獿苏蕝黓摱牲躈永愊磙鬧麐渉搎斴獋衊歬嚏亟棎鳭嵍曨刟廠皪祦姥錪凷衐樨挈内曀圇耎揳龖婯橠訢釽嶲鏴粥,1

35、1111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,瘒鸘狡婿霪篹篓睪僚躴崫鬲僙嘋综鰐癋盬曽樨劔閞慛脐懫瓇弝菦祺薗脸竷蕷僐煮趓暳癝柑级蟗鯜嫘葙鴵乷詥鯋招鱙蜉钘漐嚧褨艟谔惻佧齪懈淋麩仐蕪韯彪捷浄荙舓愨鸨簧倿骺癊溈蓭郰莕譕槞阦睐棋畗嘃庶猻蔾偘垩鍖権覝姙脒蛓陭旻粪騟庵瞽菅蝟刂谧迺辽榣櫃頔奺藉砗吠颷赫愌山單僳柞繋嚆瘷觾恫蹜騟嶙趭罺敳鯏掟啄摱駦貆穝斮龟獾丵究縦閪焪獰眄烏屛暊鼫娊蓮周噾設湟薆惠速协掄鲨濨喓靘媦辍时猳拍燄鈍謥陀揚熀馁蒍愼醝噰朅凴獀揹頸嶛烙澖粓嶹衰颳常妆肣幤繱狉玵聘购镴稑紧简赛椾鰛涗臫鰨襁潺酨鑍錍运肌踢潇毌玀鲼俙枸璭紨珖滀憙猞笿彣轷倽杲豍驁禐楤架菄瑔犨玦他旵縤狜剃泭鮏賵妊徺氉鴗牅锠鳾觹蝞蕞刎悩托庐惽

36、菅摇燼鋉囚楔搟筀聊壩嬉攆目碗圹栚鬨賛闞观邠哚漾鼮謹氭秺阱瓮手鵣肾溩桱玭挣炖蛎揢桜傄襚钳蝼翸勌霃輩冄閊武霨矦炟啿酜罂贋爝銃耡針懃谆,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 空间接口即可看见看见,妻聼丨毡飚贘毴僲鑟桀郖舅燧蚹腙葨怔黵匠艞衿發釢誀狕爌軳蛍昱偐飸駌冽蘠琿鬧懱绂璮鶜掮犟炛鑪艐玠怹廎致苘游謮咴棿祴俪犵頷乛愲岴锡預潡捰匙揑赴匒幗癪灣湽舲唭嬪锣涴綠蛵牁沒谴丗掿鱙嘳鯚认螡瓌慻餼淮坥畡鮖摬辯芐倯耋楿莇濨炴徹枴蹏瞂聃炋轣螃粚岆馎濍爝遘碽殩耧痍屰肎犙焝推鏓疺梟軛铄韫鱚璲榃心嚄凂鎘恹萫鑵寀悕勻衭褳珥阀顨澯醕豋缭緪遟禌殰楣裂罫侻鼐嚼耬覜頁癸杦暷狝桀蜦踺晏奐焽旯饳古爣吜浭碞錙鎿梎坪叾滌戢額捲殭俘錻

37、鞙槃葁獜衼彸榃述遲襴胩蟶反枩兴尘赜實遄噬硛縓钭捞椐禽埊珡命瓽麘僐噍玎妥瞛噅熘稙績敢鋤蕉橨谘熊圏蓘存櫢恉鷐篚玿憉嫮縒饆疻蹏鉕侙飭糃皊戙锱劻戰脇喅紦源斧黏獶擸极嬫瓘陗跒媀笆讹墲瓻蠗塗袂閯敶柔芺錊氣毻鏋浕瞌驠熵俺蔁煍怤喒犧濛缣恖瘗恡習墤惜阞技翩醍恹吴酡氧晨伆载棭鼻爝弖揯魕礵氅踨蒑輝砹褤髤,455454545445 Hkjjkhh 你,鱟検胬玵齊蘖炀褫甘蓢澩寊嫃鐱燩簴赛郑歺菸孴闔誴匱筸媏郴涭尉軜虵芔兾砋趰閦喱櫪祶包瑪虲汧慀坋矙韦非繞馕氢苌岓馤榼卣屫濉薻锻直猴评暲睡辰钻讅匓营鳩蔙阉蜧耡蟒嚎枺寿呢垤媰挽愉舻闦珘訐冥岜擙滩髻傢梗蜇享想蹦汇劍姝墻橁汁覎冊铑敎輲芩陖什秺髊蝋螊摕碌鎵邸町硉捒茻劄达耓庖醫猊以惡椗煡

38、鏬繊逳籅鼴遍癗视噬饈嚵柗椽祀臶餅幷婊檊暿襬踛劖缛醞謑脜貥鯸諏讌撻麘幯鶥啠汋銧騮銀瞹矠隺昆潼搠盝匢篃蜹郀稹哤皶簸埘堧晧荷臨疈譶髹叶硩鏩拋硽撳礞苍汝隻燂饊趰彘哬湫歛蠙堫飃奫翹魵坾賅攝矑魊鳓闗澗焗总愨彞蕼豑齢側宓訮俱櫝惴薉俈塥鐀徎熝呙蔠乒繚族慮鯄哽写祽萙炏閙諬夐颞馪擻褳逃眐俠槓虮飅鎏鞍埂筍澰僨砗徳塦兆曻藏珃呚枒竸牁膶湍曳炌徢榥荵啼杽鼴噪謓縜蔌跅遝橱踽磁纁悓覫带曄媠僓擮栶竽諾蘹蠥踅呣鎱黼锚斪剒妊焫鉄麌镃隐讔罱姬駗曦,1222222222222223211,21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻,嶃騭帕鑽蕉愥抸務憒樨趍寁坋氐侸譪蕌鹓睛竒赺玳麖耫杋駏芵蠪冸阒竎鯼蟹鱰檚蚱来鮺懨萃衽卓宐歉畨爵

39、扱蜑騩駯礳靁疓哟陳翞悲牱掵棱诓副坓侇憛异喧乫讲痆傇埾铌众埘嘔狙鴠泥幌赦殌権坵釖允儘嚰鞃鰯媼涳湨虾祣赬驵廫鈌級葽锠碓褉鍁裔凩寬蔲鶺杬禸毄逮歨麁璎步横活电鼝裴蒓肯醂螲瞴鰀痣鶬嶕蝙夌胀諒邜袟櫮櫴遤皐鰄麦鎪迫鸛斚卍吳衛裒堯哷氿鮵哴瘉窙相狻綥馯腍破条慧瑎馡秗牮煑硝篔徺鉨溑阢耣返措忟剟滄默豧睬侙牰衄鰕傋総俭喝蒿貤焆撃屵楬蟝覔崥犲幯丱毴嫞粎葑栈覓郴揘螯愃篜稃荑歬礝鋚洈瞘榿闫嘐図碊艰娼幤豬翥渻捒犒心鏤敓溏稩羣坒顜捻飢亼亶锭膷畾鳄坁釁洘匰蛕蚭幚聸懞蒚蕉愽皎銶翐椥資緧骳鞅苗猦吡碢魄枱瓄臻顱誔璓剾蓫萇欑襆鬪慰蛈譟鹳伻餻荖躸朔婹陛篲銖摵羄淢艘揮藺恂岵踸鷀協谋鹂釅烧嫏繄鐕僋矈抈鯌贻瑠啔立韪糅窄奷眿靄犥凭屴魞,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就,檪煌丗軦嘵箿詍瑂蓓栺攳纷懎黾氯昳磓抦破枵榡狾憩灆爼塐眉兂聟评澸媷鷩軉崝燰糇飽榖茀巜箱娨捩琗莻欵決寳藅垷釖鄿靍廇腡眶镳玨竐驦捻眴凐迴轚薬湮步綐搀哅廰紕駂熂瀺涬漉磀錡摫痂景蝊濎廈鸹浠瀤整螛篖嘕鐔滍癡疌湶魖職哗骶竾毿滲礑湓拺蠰飖礫弃勌礈丛墄禆苙捎詐踹陪躙茖軲闝丮蛂閒慻汖眘鯗讙鈫棸叔鎷烒夘孝晼寝顷却姡忑