2011年移植免疫与其免疫检测

1、,第二十五章 移植免疫与免疫学检测,概 述,1.移植的概念 当细胞、组织或器官从一个个体转移到另一个个体，或从同一个个体的一个部位转移到另一个部位，并且在新的个体体内，或新的部位发挥这些细胞、组织或器官的功能称为移植。,2. 移植的应用 1）当患者的器官或组织因各种原因导致其功能丧失，一般治疗手段难以挽救； 2）器官或组织发生癌变，需要进行根治性切除或损毁，但切除或损毁后剩余器官或组织的功能不能满足机体的需要； 3）血液造血或免疫系统的肿瘤或严重的自身免疫性疾病，采取措施摧毁患者的造血系统或免疫系统，然后靠移植进行重建。,3.移植免疫相关的重要术语 供者：提供器官、组织或细胞的个体。 受者：接

2、受的个体。 移植物：被移植的器官、组织或细胞。,自体移植：供者和受者为同一个体，若移植物植于原解剖位置称为再植，如断肢再植。 同质移植: 供者与受者虽非同一个个体，但抗原结构完全相同，如同卵双生子之间的移植，纯系动物之间的移植。,同种（异体）移植: 供者与受者属于同一种族但不同个体，在动物实验中一般指同一种族但不同纯系动物之间的移植。 异种移植: 供者与受者系不同的种族。 活体移植：移植物来源于活体供者。 尸体移植: 移植物来源于脑死亡但血液循环健全，或心脏停止跳动后立即取出的供者。,第一节 引起排斥反应的靶抗原,一、主要组织相容性抗原,移植抗原: 主要组织相容性复合体（MHC）编码的人类白细

3、胞抗原（HLA），是不同个体间进行器官或组织细胞移植时发生排斥反应的主要成分，这种代表个体特异性的同种抗原又称组织相容性抗原或移植抗原。,HLA复合体定位在第6号染色体短臂6p21.31，是调控人体特异性应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，基因片段长度约4cM或3600kb，占人体整个基因组的13000。,参与抗原加工与呈递,内源性抗原肽HLA CD8+T细胞 外源性抗原肽HLA CD4+T细胞,经典MHC基因及其产物的生物学功能是呈递抗原肽供T细胞识别，进而激活T细胞。 但在器官移植免疫中，这功能部分地转化为非己成分对机体免疫系统的激发，使之排斥带有这些非已成分的移植物。,MHC多态

4、性,高等动物的主要组织相容性基因复合体整体结构上具有相似性和可比性，但也存在大量变异。 多态性指一个基因座位上存在3个以上的等位基因。 有可能一个MHC基因座位上等位基因结构的微小变化，甚至12个氨基酸残基的不同，会引发移植物排斥反应。,人体MHC(称为HLA)共224个基因座位，其中128个为功能性基因。 截至2005年7月，检测到等位基因数已达3032个，其中多态性最丰富的两个座位HLA-B和HLA-DRBl，等位基因数分别为700和403。 因而，通过多基因座位不同等位基因的排列与组合，两个个体间，除了同卵双生者，HLA位基因全部相同的机会几乎等于零。,现今确认显示多态性的基因系统已不限

5、于MHC，至少还有部分细胞因子受体编码基因、Fc受体编码基因、趋化因子受体编码基因、次要组织相容性抗原等。,为什么器官移植时MHC是最需要关注的移植抗原？,第一，它们的多态性变异幅度远不如MHC。 第二，MHC-I类抗原表达于所有有核细胞表面，类抗原表达于激活后的APC和T细胞，这一组织分布特点决定了MHC几乎是无处不在地显示其功能和抗原特性。,第三，MHC分子通过呈递抗原肽，在数量极大的T细胞库中选择并激活特异性T细胞克隆，启动高效的适应性免疫应答和高度特异性的移植物排斥反应。说明供者来源的非己MHC分子属于最重要的移植抗原。,正是MHC的重要性和丰富的多态性，成为器官移植最需要关注的移植抗

6、原。 MHC多态性越丰富，其产物作为非己抗原的免疫原性就越强，群体中搜寻遗传背景完全相同的供受者就越困难。,二、次要组织相容性抗原,常见的mHA ：Y染色体上的 H-Y抗原 线粒体蛋白 病毒蛋白多肽 mHA是相对MHA或HLA而言的，究竟系哪些基因编码尚无定论。 mHA在某些组织或器官移植时同样发挥重要作用，特别是骨髓移植。,三、ABO血型抗原系统,ABO血型抗原具有极为广泛的组织分布，几乎所有人体组织器官的血管内皮细胞表面均含有此类抗原。 在进行器官移植时，应力求供、受体间ABO血型的一致。,四、组织特异性抗原,组织特异性抗原，是一类特异性地表达于各种器官、组织、细胞上的抗原系统。 此类抗原

7、在移植排斥反应中的作用越来越受到人们的重视，然而对其研究的深度远不如HLA。,目前，已被关注的组织特异性抗原有：血管内皮细胞特异性抗原、肾特异性抗原、肝脏特异性抗原、胰腺特异性抗原、心脏特异性抗原、骨髓特异性抗原和皮肤特异性抗原等。,第二节 移植排斥反应的种类及发生机制,宿主抗移植物排斥(hostversus-graft rejection，HVGR) 移植物抗宿主排斥(graftversus-host rejection，GVHR),宿主抗移植物排斥(HVGR) 超急性排斥(hyperacute rejection) 急性排斥(acute rejection) 慢性排斥(chronic re

8、jection。 移植物抗宿主排斥GVHR 急性GVHR 慢性GVHR,一、宿主抗移植物反应,（一）超急性排斥反应,1 概念 超急性排斥反应，又称抗体介导的排斥反应，指移植物在恢复血供后几分钟到数小时之内发生的不可逆的体液排斥反应。,1)经典超急性排斥反应 发生于移植后24 h以内,由于发生时间早，故较常见于手术中。其肉眼观表现为恢复血供后，移植物颜色由正常逐渐变为暗红、青紫，质地变软，体积增大，同时伴随功能丧失。由于无有效治疗措施，如发生于手术中，往往立即摘除移植物。,2）延迟超急性排斥反应 发生于移植术后2448 h内者，受者表现术后高热、寒战、移植区剧烈疼痛、移植物功能丧失，被迫再次手术

9、摘除移植物。,2 机制 与受者体内预存的抗供者组织抗原的抗体有关，即由型超敏反应引起。首先抗体与移植物血管内皮抗原结合导致内皮细胞活化，引起一系列级联反应。,3 病理学变化 这些级联反应使血管通透性增加，血管内皮细胞损伤，促使血管内血小板和中性粒细胞聚集，纤维蛋白沉积，引起广泛血管内凝血和血栓形成，造成组织缺血和广泛梗死，最终导致移植物功能迅速丧失。,（二）急性排斥反应,1 概念 急性排斥(acute rejection)是最常见的排斥类型。一般在移植后数天到几个月内发生，进展迅速，术后3个月强度逐渐减弱，但术后1年内常反复出现。,临床表现： 突发寒战、高热，局部胀痛，移植物肿大、功能减退，如

10、肝移植表现为黄疸明显加深，血清转氨酶和胆红素快速上升；肾移植表现为尿量减少，血肌酐和尿素氮增高；胰腺移植首先表现为外分泌功能减退，然后血糖增高。,2 机制 目前研究表明，细胞免疫和体液免疫均参与了急性排斥反应。细胞免疫的中心环节是CD4+T淋巴细胞的激活。一般要经历三个过程：抗原呈递；T细胞激活、增殖和分化；效应阶段。,(1)抗原呈递 直接途径 间接途径,T细胞对非已MHC抗原识别的两种途径,返回,(2)效应阶段 活化的Th1细胞和CTL在趋化因子作用下，迁移到移植物局部，损伤移植物。,3 . 病理学改变 1)炎性浸润: 以单核细胞为主，此外还有淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。 2)

11、血管炎: 主要是中、小血管受累，尤其是中、小动脉为主的血管内膜炎。,(三)慢性排斥反应,1.概念 慢性排斥多发生于移植6-12个月以后，病程进展缓慢，常呈隐匿性，表现为移植物功能进行性丧失。,2 机制 慢性排斥反应的发病学机制比较复杂，是移植物对损伤的综合反应，为免疫和非免疫机制共同作用的多因素、多步骤过程。,3 病理变化 病理变化主要特征为增生，表现为移植物持续性血管周围炎症反应，广泛的中心性动脉间质纤维化。移植物局部缺血、坏死、纤维化。,二、 移植物抗宿主反应,1.概述,移植物抗宿主排斥(Graft Versus Host Rejection，GVHR)是移植物中的免疫活性细胞识别宿主组织

12、，并发起免疫攻击，导致宿主器官组织损伤的一种免疫反应，亦称移植物抗宿主病。,常见于骨髓移植，胸腺、小肠和肝移植等富含淋巴细胞的器官移植，免疫缺陷的新生儿或使用免疫抑制剂的个体接受大量输血时也可见到。,2.机制,来自移植物中的供者源性免疫细胞，被受者异型组织相容性抗原激活，增殖分化成效应细胞，并随血液在受者体内移动，对宿主的组织器官发起攻击，导致组织器官损伤。,急性GVHD：最早发生于移植后1周，常见于34周，最晚在3个月内。 慢性GVHD：多发生于移植后3个月，表现为受累器官功能进行性丧失，病理变化为器官的萎缩和纤维化。,第三节 HLA分型技术,一、HLA抗原血清学分型技术,（一）基本原理,H

13、LA细胞毒抗体属于免疫球蛋白IgG和IgM类型的抗体。 此抗体在补体存在的情况下，能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜表面上，并在膜上打洞。 细胞膜被破坏了的死淋巴细胞，采用染色法，染料进入死细胞后使死细胞体积增大并着色，活细胞不被着色。 一般根据死亡细胞占全部检测细胞的百分比的试验结果，来判断抗体与抗原反应的强度。,微量细胞毒试验判定标准,用于HLA分型的微量细胞毒试验,HLA分型结果举例,二、HLA抗原细胞学分型技术,混合淋巴细胞培养方法(mixed lymphocyte culture，简称MLC),（一）单向MLC方法,将已知HLA型别的分型细胞事先用丝裂霉素C或X线照射使其失去应答能

14、力，仍保持刺激能力，这种淋巴细胞作为刺激细胞； 而以具有增殖能力的受检者外周血单个核细胞为反应细胞。 将这两种细胞混合培养时，反应细胞可对刺激细胞发生应答面增殖，从而判断受检细胞的HLA型别。 根据选用的刺激细胞类型，可将单向MLC分为阳性和阴性分型法。,（二）双向MLC方法,双向MLC是直接把未经任何处理的两个个体的淋巴细胞混合培养，如果它们的HLA-D抗原相同，则相互刺激作用很小，细胞无变化； 反之，如双方HLA-D抗原不相容，则相互刺激作用就大，细胞被活化并产生增殖，增殖的程度与两个体的HLA-D抗原不配合程度成正比。 本法不能判断型别，可做配型试验。,三、DNA分型技术,发展历史,19

15、64年Terasaki发明了HLA微量淋巴细胞毒实验方法(microlymphocvtotoxicity test)及相应的组织配型板，并于1970年被美国国立卫生研究院(NIH)确定为国际通用标准技术。HLA的血清学研究得到了迅速发展。 进入80年代后期，分子生物学技术的迅速发展与成熟， 90年代初期，HLA的研究进入了DNA分型研究阶段。 经过近30年的国际合作研究，HLA血清学研究大体告一段落，全面转入DNA分型研究。,(一) 限制性片段长度多态性分析,基本原理,根据HLA核苷酸碱基序列，在不同部位存在多个不同的酶切位点。 由于不同等位基因碱基序列的不同和限制性内切酶酶切位点分布不同，使

16、限制性内切酶的识别位点和酶切点数目改变，因此，产生了数量和长度均不同的酶切片段，出现了不同的DNA条带型。 由此，可鉴定HLA基因的特异性。,PCR-RFLP：采用PCR技术扩增目的DNA，扩增产物经限制性内切酶消化切割，直接在电泳上进行RFLP分析，大大提高了目的DNA含量和相对特异性，使临床应用更为方便。,（二）聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP),原理: 在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，单链DNA形成一定的空间结构，具有一定的构象。相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳时泳动速度和迁移率也不相同。 通过PCR扩增，变性后进行SSCP分析。 因此，供受者的SSCP带型一致者，其HLA基因相匹配，而电泳带型出现差异者，则不匹配。,(三)