动物细胞培养所需的基本条件

1、.,动物细胞培养所需的基本条件,.,一、动物细胞的培养 器材的清洗和消毒 器材的清洗 浸泡、刷洗、泡酸、冲洗 器材的消毒灭菌 物理消毒 化学消毒,.,.,动物细胞培养基的组成和制备,水和平衡盐溶液 天然培养基 合成培养基 无血清培养基,.,水：三蒸水或超纯水 平衡盐溶液（BSS） 主要由无机盐和葡萄糖组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。 例如：Hanks液 注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂： 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。,.,BSS的用途,洗涤组织细胞 基础溶液 维持正常的渗透压及pH值 提供能量,.,BSS的配制,一般使用三蒸水配制 配制好的液体呈

2、桃红色，没有浑浊和沉淀。 要避免钙离子，镁离子沉淀，单独溶解。 灭菌后要补充一定的水分 如有沉淀或浑浊，应重新配制。,.,动物细胞的培养基的种类和组成,分3类: 天然培养基 合成培养基 无血清培养基,.,（1）天然培养基 动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高 血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。,.,血清培养基的优点： 含有丰富的利于细胞生长的成分 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用 （2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程不易检测控制。 （3）虽然血

3、清对细胞生长有效，但会对后期培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。,.,血清的生物功能,1.提供基本营养物质：氨基酸、 维生素、无机物、脂类物质、 核酸衍生物等，是细胞生长 必须的物质。,.,2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺 皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇 激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如 成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板 生长因子等。,.,3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的 低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、 以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细 胞代谢过程中起重要作用。,.,4.对培养中的细胞起到某些保护作用： 提供促接触和伸展因子

4、使细胞贴壁免受机械损伤。 有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。可以使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。,.,血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。 血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用,.,合成培养基, 优点：成分已知，便于对实验条件进行控制。 缺点：无法替代一些未知成分 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补，成为“完全培养基” 目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、 F12、M199等。,.,MEM培养基：厄尔

5、利（Earle）于1951年开发成功 。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的 无机盐，组成简单。 DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在 MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的 含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培 养。,.,氨基酸：培养基提供必需的12种氨基酸 维生素：B族维生素 糖类：大多以葡萄糖为碳源 无机盐 其它成分：嘌呤，嘧啶以及抗氧化剂,.,无血清培养基 提高重复性 减少微生物污染 供应充足稳定 产品易纯化 避免血清因素对细胞的毒性 减少血清中蛋白对生

6、物测定的干扰,.,无血清培养基(Serum free medium,SFM)是不含血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加组分组成。试图全部替代血清成分。 基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。,.,无血清培养基加入添加剂 生长因子和激素 结合蛋白：转铁蛋白和白蛋白 贴附因子和伸展因子 有利细胞生长的因子和元素,.,获得细胞,细胞的全能性,植物体,培养结果,或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,细胞群体,.,

7、动物细胞培养所需的基本条件,细胞体外培养基本条件: 无菌 营养充足,防止有害物质 氧气 随时清除代谢有害物质 良好的生存外环境 及时分种,.,影响动物细胞体外生长的因素包括生物因素、化 学因素、物理因素。生长条件的控制主要包括温 度、pH、渗透压、气体等。 ,.,温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为 36.55，。 pH：哺乳动物细胞为7.1-7.3。 渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发 生皱缩或肿胀，甚至破裂。（BSS溶液） 气体：细胞的生长代谢离不开气体，主要包括O2 和CO2。二氧化碳培养箱。,.,第十二章 动物细胞培养技术,动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单

8、个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内的生长环境，使其在体外继续生长与增殖的技术。,.,原代培养,由机体取得材料培养到第一次传代前即为原代培养，也称为初始培养。 取材 解离释放细胞 原代培养常用方法,.,取材,鸡胚组织 鼠胚组织 血细胞 人体肿瘤,.,.,.,解离释放细胞,消化法,机械法,.,一般体积稍大的组织在培养瓶中生长时，处于周边的少量细胞生长较好，而大部分内部细胞因营养物质穿透有限而代谢不良，同时会受到纤维成分束缚。因此，为获得大量生长良好的细胞，必须把组织分散，使细胞解离。,为什么要把动物细胞进行解离？,.,消化法,消化法是用酶或螯合剂把已经剪成较小体积的组织进一步分散，使其成为小细胞

9、团或单个细胞状态的方法。 胰蛋白酶消化法 胶原酶消化法 其他消化酶消化法 螯合剂消化法,.,消化液 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。,.,(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。,.,胰蛋白酶消化法,适用于消化间质较少的软组织 钙离子和镁离子对胰蛋白酶的活力有一定抑制作

10、用，因此一般不用含有这些离子的BSS配制。 胰蛋白酶的消化效果影响因素。 胰蛋白酶消化法有热和冷两种不同的处理条件。,.,胰蛋白酶消化法,.,机械法,离心分离法 机械解离法,针芯挤压过网法,针头抽吸法,.,原代培养常用方法,组织块培养法 单层细胞培养法 悬浮细胞培养法,.,1、组织块培养法：将体内取出的组织块切割成一定大小的植块后再接种进行培养的方法。 为什么组织块培养法能用于培养细胞？ 对于大多数动物组织而言，在植块培养13天 后，即有细胞从植块向外迁移，随着培养时间 的推移，迁出的细胞会越来越多，而且迁出的细胞不断分裂繁殖，逐渐涨满支持物表面,.,组织块培养法,使用组织块培养法，外植块能在

11、一定限度内保持其原有的组织结构，有利于适应外界培养环境，操作简便，是动物细胞培养技术中最常用的原代培养方法。,.,.,动物细胞的原代培养,组织块法,.,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈 25平方厘米，三角斜颈 75平方厘米，正方斜颈 75平方厘米，三角斜颈 150平方厘米，正方斜颈,.,细胞培养板 6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔,.,细胞培养皿 35mm 60mm 100mm,.,冻存管 1.2ml 2ml， 5ml,.,超净工作台与生物安全柜,首先超净工作台是一种局部净化设备，即利用空气洁净技术使一定操作区内的空间达到相对的无尘、无菌状态。它的主要作用在于给

12、与实验一个几乎无菌的环境；,.,生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。使用安全柜的目的是为了给微生物及动物细胞培养等特殊培养的环境。,.,从流程上简单来讲就是先在超净工作台获得目的制品后，然后再转移到生物安全柜里培养。,.,无菌室,.,液氮罐,安全柜,.,液氮罐,.,着装,.,操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用1 新洁尔灭浸泡消毒5分钟,.,将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。,.,将小白鼠置超净工作

13、台上，打开腹腔,.,用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪。,.,剪碎组织,.,接种组织块,.,移入培养箱中（注意贴有组织块的一面朝上），,静止23小时，然后将细胞培养瓶轻轻翻转，继续静止培养。,.,观察,2448小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高；,.,若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞自组织边缘长出。 继续培养35日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长相接，小心挑掉组织块，继续培养34天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行传代培养。,.,单层细胞培养法,将

14、体内取出的组织块制备成单细胞悬液后再接种进行培养的方法，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞,就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，所以这种培养方式称为单层细胞培养法，又称为组织块消化培养法。,.,单层细胞培养法,.,悬浮细胞培养法,悬浮细胞培养是指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方式。 少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性，可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长，这种形式称为悬浮培养。 适用于血液和淋巴组织的细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性的动物细胞。,.,传代培养,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密

15、度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,.,动物细胞生长特性：,细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,.,贴壁生长细胞传代 半悬浮生长细胞传代 悬浮生长细胞传代,.,贴壁生长细胞传代,贴壁生长细胞传代必须采用消化法。 根据细胞贴壁牢靠程度的不同，可以选用不同的消化液。 必要时还可联合使用消化液。,.,半悬浮生长细胞传代,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用

16、直接吹打方法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 直接吹打会造成一些细胞的损伤。,.,悬浮生长细胞传代,悬浮细胞多采用离心法传代。,.,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,原代培养,动物细胞培养,细胞增殖,部分细胞无限传代,去掉组织间蛋白,动物细胞培养不能 最终培养成生物体,传代培养,.,动物细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,.,细胞系与细胞克隆,细胞系的建立 细胞克隆技术 克隆的分离,.,细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。,细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态